CN104830989A - 一种用于ros1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒 - Google Patents

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CN104830989A CN201510269031.1A CN201510269031A CN104830989A CN 104830989 A CN104830989 A CN 104830989A CN 201510269031 A CN201510269031 A CN 201510269031A CN 104830989 A CN104830989 A CN 104830989A
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张道允
巩子英
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Shanghai Yunying Medical Technology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒，包括特异性反转录引物、Q-PCR特异性引物和探针；所述的Q-PCR特异性引物和探针核苷酸序列包括：Mix 1：CD47；SDC4；SLC34A2和ROS1基因融合、Mix 2：CD47；EZR；SDC4；SLC34A2和ROS基因融合、Mix 3：LRIG3；TPM3；GOPC和ROS1基因融合、Mix 4：GOPC和ROS1基因融合。本发明采用了特异引物和探针技术，可以特异检测人类ROS1基因融合突变；建立了实时荧光PCR体系，可同时检测RET基因15种融合突变；灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；样本检测范围广，检测速度快。

Description

一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒。
背景技术
肺癌是世界上癌症死亡的主要原因,从组织病理学上可以分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)两大类，其中非小细胞肺癌约占肺癌总病例的85％。在我国肺癌患者5年生存率仅为13％，而约70％的NSCLC在确诊时己处于晚期。分化程度更低，转移更快的小细胞肺癌(Small lung cancer，SCLC)的治疗效果及生存率更不容乐观。其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及与之相配的科学治疗方案，从而使患者错失了治疗的最佳时机。其主要治疗方法化疗的疗效并不让人满意。随着肿瘤分子生物学的发展，肺癌的分子靶向治疗因其特异性高，毒副作用低，日益成为临床医生首选治疗方式。ROSl融合在NSCLC病人中阳性率为2-4％，并被公认为肺癌中致癌突变。ROS1基因为原癌基因，定位于第6号染色体，编码一个受体酪氨酸激酶。研究发现，ROS1基因在乳头状甲状腺癌和非小细胞肺癌中还可以和CD74、EZR、LRIG3、SDC4、SLC3A42、TPM3、GOPC发生融合，其中ROSl同一点与在不同点断裂的CD74基因分别融合形成2种CD74-ROSl变异体；与不同断裂点的SDC4融合形成2种不同的SDC4-ROSl变异体；与不同断裂点的SLC3A42形成2种不同的SLC3A42-ROSl变异体。激活下游RAS/MAPK/ERK,PI3K/AKT，和phospholipase号途径，引起癌症的发生(Gainor JF，Shaw AT，The Oncologist2013；18：865–875)。
以克唑替尼为代表的药物是针对ROS1基因融合突变开发的小分子靶向药物，通过抑制ROS1酪氨酸激酶区域的活性，阻断其下游异常信号通路，从而抑制肿瘤细胞的生长。临床研究表明克唑替尼对ROS1融合突变患者的有效率可达61％以上，而对野生型的患者几乎没有疗效。因此，检测ROS1融合突变情况是指导克唑替尼类药物用药的前提和基础，在化疗之前通过高敏度的检测方法检测ROS1融合基因突变对于提高患者的生存率，延长生存期，避免过度化疗，提高生存质量有着重要意义。因此检测ROS1基因的融合状态是筛选克唑替尼适合患者的重要前提。
目前，ROS1融合突变的检测方法主要为荧光原位杂交(FISH)法，然而FISH法检测特异性差，灵敏度低，检测时间长。此外，FISH检测需要昂贵的专用仪器设备，试剂成本较高，操作复杂，使临床检测广泛使用受到了限制。FISH检测要求检测样本保存时间不宜过长，采用保存时间长的样本进行检测会导致假阴性的发生，影响了检测的准确性。因此，FISH检测法无法满足临床医生检测实际应用的需求，临床迫切需要开发一种高灵敏度的可以同时检测ROS1融合基因多种突变的检测方法，以实现采用快速的检测方法对ROS1多种融合突变进行同时检测，从而为临床肺癌个体化治疗方案提供科学参考依据。
发明内容
本发明的目的：提供一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒，可以一次同时检测ROS1基因的15种融合突变，检测灵敏度高，检测时间只需2小时即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，廉价快速，操作简单等优点，可以满足临床快速检测的实际需求。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒，包括特异性反转录引物、Q-PCR特异性引物和探针；
所述的特异性反转录引物包括如下序列：
所述的Q-PCR特异性引物和探针核苷酸序列包括：
Mix 1：CD47；SDC4；SLC34A2和ROS1基因融合，其序列如下：
Mix 2：CD47；EZR；SDC4；SLC34A2和ROS基因融合，其序列如下：
Mix 3：LRIG3；TPM3；GOPC和ROS1基因融合，其序列如下：
Mix 4：GOPC和ROS1基因融合，其序列如下：
上述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒，其中，所述的Q-PCR特异性引物和探针核苷酸序列还包括Mix 5：参考基因特异性引物和探针核苷酸序列，其序列如下：
一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，该方法至少包括如下步骤：
步骤1：根据COSMIC数据公布的人类ROS1基因为野生型基因序列，针对ROS1基因15种融合突变，来设计特异引物和探针。
步骤2：提取检测样本的RNA，所述的检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织和胸腔液。
步骤3：配制实时荧光PCR扩增反应体系。
步骤4：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
步骤5：实验结束后进行分析和判定。
上述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其中，在所述的步骤2中，还包括如下分步骤：
步骤2.1：取约1×1cm2的各肺癌样本切片置于离心管中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
步骤2.2：12,000rpm离心2分钟，小心吸弃上清。
步骤2.3：加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀；12,000rpm离心2分钟，弃上清。
步骤2.4：打开管盖，室温或最高至37℃孵育10分钟，直至无乙醇残留。
步骤2.5：加入150μl Buffer PKD，重悬沉淀；加入10μl ProteinaseK，涡旋震荡混匀。
步骤2.6：56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解；80℃孵育15分钟；短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
步骤2.7：加入320μl Buffer RBC，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.8：将步骤2.7中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的过滤柱中；10,000rpm离心1分钟，收集滤液。
步骤2.9：在步骤2.8得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.10：将步骤2.9中所得的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中；10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.11：向吸附柱中加入500μl Buffer，10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.12：12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液；将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
步骤2.13：将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，10，000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，准备后续实验。
上述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其中，在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系为：
上述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其中，在所述的步骤3中，所述的实时PCR扩增反应条件如下。
上述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其中，在所述的步骤5中，还包括如下分步骤：
步骤5.1：运行无模板对照时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，继续分析实验情况。
步骤5.2：运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
步骤5.3：运行MIX5(ref)的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0，则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
步骤5.4：有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。
步骤5.5：在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，具体结果判定见下表，阳性为存在融合，阴性为不存在融合。
上述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其中，在所述的步骤2.13中，所述的RNA溶液合成cDNA体系，mRNA反转录cDNA体系如下：
上述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其中，所述的mRNA反转录cDNA的操作方法，包括如下步骤：
步骤1：取逆转录反应混合液13μL，super RT逆转录酶1μl，加入无菌离心管中，混匀。
步骤2：加入待测样品RNA 6μL，RNA总量在0.1～5μg范围内至20μl。
步骤3：42°保温1个小时，85℃孵育5分钟；反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
步骤4：逆转录产物可直接用于后续PCR反应和荧光定量PCR反应。
本发明采用了特异引物和探针技术，可以特异检测人类ROS1基因融合突变；建立了实时荧光PCR体系，可同时检测RET基因15种融合突变；灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；操作简单，检测廉价，临床应用范围广；样本检测范围广，样本可以为新鲜病理组织，石蜡包埋组织或胸腔液；检测速度快，检测过程只需要2小时即可完成。
附图说明
图1是本发明一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒检测CD47-E6和ROS1-E32基因融合质粒Q-PCR图。
图2是本发明一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒检测CD47-E6和ROS1-E32基因融合质粒灵敏度分析试验结果Q-PCR图。
图3是本发明一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒检测临床样本突变阳性(SDC4-E2和ROS1-E34基因融合)Q-PCR图。
图4是本发明一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒检测临床样本(SDC4-E2和ROS1-E34基因融合)野生型Q-PCR图。
具体实施方式
以下结合附图进一步说明本发明的实施例。
请参见附图1至附图4所示，一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒，包括特异性反转录引物、Q-PCR特异性引物和探针；
所述的特异性反转录引物包括如下序列：
所述的Q-PCR特异性引物和探针核苷酸序列包括：
Mix 1：CD47(E6)；SDC4(E2，E4)；SLC34A2(E4，E13)和ROS1(E32)基因融合，其序列如下：
Mix 2：CD47(E6)；EZR(E10)；SDC4(E2；E4)；SLC34A2(E4，E13)和ROS(E34)基因融合，其序列如下：
Mix 3：LRIG3(E16)；TPM3(E8)；GOPC(E8)和ROS1(E35)基因融合，其序列如下：
Mix 4：GOPC(E4)和ROS1(E36)基因融合，其序列如下：
所述的Q-PCR特异性引物和探针核苷酸序列还包括Mix 5：参考基因特异性引物和探针核苷酸序列，其序列如下：
一种利用所述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，该方法至少包括如下步骤：
步骤1：根据COSMIC数据公布的人类ROS1基因为野生型基因序列，针对ROS1基因15种融合突变，来设计特异引物和探针。通过特异性引物和探针体系优化，实现高灵敏和特异检测，ROS1基因15个融合突变位点参见附表1。
针对选定的15个融合突变位点，应用Premier 6.0引物设计软件设计多对特异引物和多条探针，引物和探针序列形成的试剂盒如附表2所示。
步骤2：提取检测样本的RNA，所述的检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织和胸腔液。
步骤3：配制实时荧光PCR扩增反应体系。
步骤4：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
步骤5：实验结束后进行分析和判定。
在所述的步骤2中，还包括如下分步骤：
步骤2.1：取约1×1cm2的各肺癌样本切片(共约4-5片切片)置于离心管(自备)中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
步骤2.2：12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉。
步骤2.3：加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀；12,000rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
步骤2.4：打开管盖，室温或最高至37℃孵育10分钟，直至无乙醇残留。
步骤2.5：加入150μl Buffer PKD，重悬沉淀；加入10μl ProteinaseK，涡旋震荡混匀。
步骤2.6：56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解；80℃孵育15分钟；短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
步骤2.7：加入320μl Buffer RBC，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.8：将步骤2.7中所得到的溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube 2ml)的过滤柱(DNA Remover Column)中；10,000rpm离心1分钟，收集滤液。
步骤2.9：在步骤2.8得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.10：将步骤2.9中所得的溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube 2ml)的吸附柱(Spin Column RS)中；10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.11：向吸附柱中加入500μl Buffer RW2，10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.12：12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液；将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
步骤2.13：将吸附柱置于一个新的无RNase离心管(Collection Tube1.5ml)中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，10,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，准备后续实验。
在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系为：
在所述的步骤3中，所述的实时PCR扩增反应条件为：
在所述的步骤5中，还包括如下分步骤：
步骤5.1：运行无模板对照(NTC)时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
步骤5.2：运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
步骤5.3：运行MIX5(ref)的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0，则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
步骤5.4：有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期(升高)和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
步骤5.5：在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，具体结果判定见下表，阳性为存在融合，阴性为不存在融合。
在所述的步骤5.5中，判定结果为：
在所述的步骤2.13中，所述的RNA溶液合成cDNA体系，mRNA反转录cDNA体系如下：
所述的mRNA反转录cDNA的操作方法，包括如下步骤：
步骤1：取逆转录反应混合液13μL，super RT逆转录酶1μl，加入无菌离心管中，混匀。
步骤2：加入待测样品RNA 6μL，RNA总量在0.1～5μg范围内至20μl。
步骤3：42°保温1个小时，85℃孵育5分钟；反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
步骤4：逆转录产物可直接用于后续PCR反应和荧光定量PCR反应。
实施例1：
利用本发明体系检测质粒，实验用质粒模板(含CD47-E6和ROS1-E32基因融合)，利用上述荧光PCR检测ROS1基因融合突变的方法如下：
(1)质粒处理与提取
质粒的提取采用TIANGEN(HighPure Plasmid kid，DP116)的质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明操作。所提DNA溶于Tris-HCl(10mM,pH 8.0),经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl(10mM,pH 8.0)溶液调整DNA浓度到20ng/ul作为稀释母液。
根据公式C拷贝浓度＝(C质量浓度X6.02X1023)/MWDNA稀释野生型质粒为106个拷贝数/微升。
(2)建立PCR扩增反应体系：
将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增
实时PCR反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
实验结束以后，按以下步骤进行分析、判定：
1、运行无模板对照(NTC)时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
2、运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
3、运行MIX5(ref)的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0,则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
4、有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期(升高)和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
5、在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，具体结果判定见下表，阳性为存在融合，阴性为不存在融合。
灵敏度分析：取CD47-E6和ROS1-E32基因融合质粒经定量后浓度为1000个拷贝的样品DNA，进行10倍稀释，然后分别对3个浓度进行检测，每次反应加入5μL DNA.结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，10拷贝DNA基因即可检出，结果如附图2所示。
重复性试验：每个反应分别加入突变质粒DNA 1000拷贝、100拷贝、10拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.5个循环。
检测结果表明，本发明的检测体系可以准确检测质粒ROS1融合突变，检测的灵敏度可达到5-10拷贝。
实施例2：
运用本发明检测临床样本，取送我公司待检测的临床肺癌石蜡包埋组织样本115例，男性69例，女性46例，年龄为35-76岁，平均年龄为56岁，中位年龄52岁。利用本发明特异引物和探针荧光PCR体系检测115例临床样本的ROS1的基因融合突变步骤如下：
(1)样本处理与RNA的提取
a.取约1×1cm2的各肺癌样本切片(共约4-5片切片)置于离心管(自备)中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
b.12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉。
c.加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀。12,000rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
d.打开管盖，室温或最高至37℃孵育10分钟，直至无乙醇残留。
e.加入150μl Buffer PKD，重悬沉淀；加入10μl Proteinase K，涡旋震荡混匀。
f.56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解。80℃孵育15分钟。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
g.加入320μl Buffer RBC，涡旋震荡彻底混匀。
h.将步骤g中所得到的溶液全部加入到已装入收集管(CollectionTube 2ml)的过滤柱(DNA Remover Column)中。10,000rpm离心1分钟，收集滤液。
i.在步骤h得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
j.将步骤i中所得的溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube2ml)的吸附柱(Spin Column RS)中。10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
k.向吸附柱中加入500μl Buffer RW2，10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
l.12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
m.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管(Collection Tube 1.5ml)中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，10,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，准备后续实验。
(2)建立PCR扩增反应体系
将所提上述RNA溶于0.1％DEPC水中，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度OD260/OD280为1.9-2.1，并读其含量。取0.1～5μg的RNA A作为其c DNA合成的模板，采用康为世纪的RNA逆转录试剂盒合成cDNA，cDNA合成体系如下：
应用上述反转录体系按如下步骤进行逆转录。
(a)取逆转录反应混合液13μL,super RT逆转录酶1μL,加入无菌离心管中，混匀。
(b)加入待测样品RNA 6μL,RNA总量在0.1～5μg范围内至20μL.
(c)42℃保温1个小时
(d)85℃保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA模板
将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增：
实时PCR反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
实验结束以后，按以下步骤进行分析、判定：
1、运行无模板对照(NTC)时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
2、运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
3、运行MIX5(ref)的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0,则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
4、有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期(升高)和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
5、在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，具体结果判定见下表，阳性为存在融合，阴性为不存在融合。
结果判定：
检测结果表明所检测115例肺癌样本中有3例发生有RET融合突变(为SDC4-E2和ROS1-E34基因融合)，突变率为2.6％，同时对上述所有样本进行FISH对比检测，FISH结果表明突变有2例，经测序证明FISH结果未检出的样本为融合阳性，进一步证明了本发明体系检测的结果优于FISH检测，结果参见附表3。
附表1：ROS1基因15种融合突变：
融合基因 融合基因 融合外显子位点 COSMIC
CD47 ROS1 C6-R32 COSF1203
CD47 ROS1 C6-R34 COSF1201
EZR ROS1 E10-R34 COSF1268
SDC4 ROS1 S2-R32 COSF1266
SDC4 R0S1 S2-R34 COSF1672
SDC4 ROS1 S4-R32 COSF1279
SDC4 ROS1 S4-R34 /
SLC34A2 ROS1 SL4-R32 COSF1197
SLC34A2 ROS1 SL4-R34 /
SLC34A2 ROS1 SL13-R32 COSF1260
SLC34A2 ROS1 SL13-R34 /
LRIG3 ROS1 L16-R35 COSF1270
TPM3 ROS1 T8-R35 /
GOPC ROS1 G8-R35 COSF1251
GOPC ROS1 G4-R36 COSF1295
附表2：ROS1基因15种融合突变PCR反应各管检测突变点：
附表3：临床样本检测结果比较：
综上所述，本发明采用了特异引物和探针技术，可以特异检测人类ROS1基因融合突变；建立了实时荧光PCR体系，可同时检测RET基因15种融合突变；灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；操作简单，检测廉价，临床应用范围广；样本检测范围广，样本可以为新鲜病理组织，石蜡包埋组织或胸腔液；检测速度快，检测过程只需要2小时即可完成。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
<110>上海允英医疗科技有限公司
<120>一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒
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CCAGACAAAGGTCAGTGGGAT 21
 
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TCTTCAGCTTTCTCCCACTG 20
 
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GCCAACTCTTTGTCTTCGTTT 20
 
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CACTTCTCCAAAGGCTCCAC 20
 
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CAGGAGGAGCAATGATCTTG 20
 
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AGCTGTCTGGCTCTGGAGAT 20
 
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TTGAGAGAACGGAGGTCCTG 20
 
 
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TCTTAGTAGCGCCTTCCAGC 20
 
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Claims (9)

1.一种用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒，其特征在于：包括特异性反转录引物、Q-PCR特异性引物和探针；
所述的特异性反转录引物包括如下序列：
所述的Q-PCR特异性引物和探针核苷酸序列包括：
Mix 1：CD47；SDC4；SLC34A2和ROS1基因融合，其序列如下：
Mix 2：CD47；EZR；SDC4；SLC34A2和ROS基因融合，其序列如下：
Mix 3：LRIG3；TPM3；GOPC和ROS1基因融合，其序列如下：
Mix 4：GOPC和ROS1基因融合，其序列如下：
GOPC-E4   TTGGATAAGGAACTGGCAGG  SEQ ID NO：26
ROS1-E36  ATTGAAAATCTTCCTGCCT   SEQ ID NO：27
Taqman ROS1-E36FAM-5-CACTTCTCCAAAGGCTCCAC-3-BHQ-MGB
SEQ ID NO：28。
2.根据权利要求1所述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒，其特征在于：所述的Q-PCR特异性引物和探针核苷酸序列还包括Mix 5：参考基因特异性引物和探针核苷酸序列，其序列如下：
ACTBF   CTGGCATTGCCGACAGGA       SEQ ID NO：29
ACTBR   AGGAGCAATGATCTTGATCTTC   SEQ ID NO：30
ACTtaqman FAM-5-AAGGAGATCACTGCCCTG-3-BHQ-MGB
SEQ ID NO：31。
3.一种利用权利要求1所述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：该方法至少包括如下步骤：
步骤1：根据COSMIC数据公布的人类ROS1基因为野生型基因序列，针对ROS1基因15种融合突变，来设计特异引物和探针；
步骤2：提取检测样本的RNA，所述的检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织和胸腔液；
步骤3：配制实时荧光PCR扩增反应体系；
步骤4：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃；
步骤5：实验结束后进行分析和判定。
4.根据权利要求3所述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：在所述的步骤2中，还包括如下分步骤：
步骤2.1：取约1×1cm2的各肺癌样本切片置于离心管中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒；
步骤2.2：12,000rpm离心2分钟，小心吸弃上清；
步骤2.3：加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀；12,000rpm离心2分钟，弃上清；
步骤2.4：打开管盖，室温或最高至37℃孵育10分钟，直至无乙醇残留；
步骤2.5：加入150μl Buffer PKD，重悬沉淀；加入10μl Proteinase K，涡旋震荡混匀；
步骤2.6：56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解；80℃孵育15分钟；短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；
步骤2.7：加入320μl Buffer RBC，涡旋震荡彻底混匀；
步骤2.8：将步骤2.7中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的过滤柱中；10,000rpm离心1分钟，收集滤液；
步骤2.9：在步骤2.8得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀；
步骤2.10：将步骤2.9中所得的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中；10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2.11：向吸附柱中加入500μl Buffer，10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2.12：12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液；将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干；
步骤2.13：将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，10,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，准备后续实验。
5.根据权利要求3所述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系为：
6.根据权利要求3所述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：在所述的步骤3中，所述的实时PCR扩增反应条件如下。
7.根据权利要求3所述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：在所述的步骤5中，还包括如下分步骤：
步骤5.1：运行无模板对照时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，继续分析实验情况；
步骤5.2：运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动；
步骤5.3：运行MIX5(ref)的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0，则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要；
步骤5.4：有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型；
步骤5.5：在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，具体结果判定见下表，阳性为存在融合，阴性为不存在融合。
8.根据权利要求4所述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：在所述的步骤2.13中，所述的RNA溶液合成cDNA体系，mRNA反转录cDNA体系如下：
9.根据权利要求8所述的用于ROS1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的mRNA反转录cDNA的操作方法，包括如下步骤：
步骤1：取逆转录反应混合液13μL，super RT逆转录酶1μl，加入无菌离心管中，混匀；
步骤2：加入待测样品RNA 6μL，RNA总量在0.1～5μg范围内至20μl；
步骤3：42°保温1个小时，85℃孵育5分钟；反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却；
步骤4：逆转录产物可直接用于后续PCR反应和荧光定量PCR反应。
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