CN103290120B - 一种用于检测alk基因表达的探针、引物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测ALK基因表达差异的引物、探针及试剂盒。本发明主要包括以下序列:SEQ?ID?NO1-SEQ?ID?NO12。本发明的引物和探针可以特异检测ALK基因表达差异,以确定是否存在ALK基因融合。本发明建立了用于检测ALK基因表达差异的实时荧光PCR体系,通过检测5'端和3'端基因表达量的差异,提供ALK基因表达差异外显子的定性评估,适用于非小细胞肺癌患者在进入个性化靶向治疗之前。该方法(1)灵敏度高,可检出5拷贝的阳性质粒;(2)操作简单,检测价廉,临床应用范围广;(3)样本检测范围广,样本可以为新鲜的病理组织,石蜡包埋组织(切片)或冰冻病理切片;(4)检测速度快,检测过程只需要160分钟即可完成。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地涉及一种ALK基因表达差异检测的探针、引物及试剂盒。
背景技术
受体型酪氨酸激酶间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)最早发现于间变性大细胞淋巴瘤(Anaplastic large cell lymphoma,ALCL)中,由2号及5号染色体易位所形成的融合蛋白质包含了ALK的3'端胞内结构域,以及核磷蛋白(Nucleophosmin,NPM)的5'端的结构域。随后的研究发现,正常的ALK专一表达于神经系统中,如脑和神经索,尤其是新生儿的脑中。ALK基因位于染色体2p23位点,正常情况下人源的ALK可转录产生大小6222bp的mRNA,由29个外显子构成,编码1620个氨基酸序列200KDa的I型跨膜蛋白ALK。该蛋白为一种受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase,RTK),是RTK胰岛素超家族的成员。完整的ALK具有典型的RTK三部分结构,即胞外区、亲脂性跨膜区和胞内酪氨酸激酶。
据文献报道,ALK蛋白除在极少部分弥漫性大B细胞淋巴瘤中表达外,可在60%~85%的原发性系统性ALCL中表达,是原发性系统性ALCL相对特异的免疫表型特征。近年来研究人员亦发现ALK基因在肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要作用。
ALK融合基因存在于约3%至7%的非小细胞肺癌(NSCLC)患者中。它是由2号染色体上的ALK基因位点发生断裂且与其他基因融合所致,多存在于非(轻度)吸烟肺癌患者中;文献资料显示,ALK融合断裂点绝大多数位于外显子20,ALK融合的发生导致了ALK断裂点两侧mRNA表达量的差异,ALK基因的外显子20-29之后的mRNA序列表达量明显增高,进而导致ALK基因的外显子20-29(3'端)的表达量明显高于外显子1-18(5'端)。
ALK激酶抑制剂的抗癌效果与ALK融合的存在与否密切相关。由辉瑞公司开发的crizotinib(商品名:Xalkori)是肝细胞生长因子受体Met蛋白、ALK以及它们的致癌变异体的小分子ATP竞争性抑制剂。体外研究证实,crizotinib是Met和ALK激酶抑制剂,能剂量依赖性地抑制Met基因发生扩增或ALK因发生易位或倒位的肿瘤细胞生长;临床研究表明:crizotinib对ALK阳性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的生存情况有显著改善作用,且耐受性良好,安全性较高。已于2011年8月26日获美国FDA批准用于治疗局部晚期或转移性的、ALK为阳性的NSCLC。因此对NSCLC患者进行ALK融合基因的检测将帮助找到从crizotinib治疗中受益的患者,指导临床正确用药。
用于检测ALK融合基因的方法有多种,如免疫组织化学方法(IHC)、荧光原位杂交技术(FISH)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等。早前的用于ALK融合基因检测的RT-PCR法,针对已报道的ALK融合类型进行设计并检测,检测谱只能涵盖已知的ALK融合类型,因此,不具有未知/未报道的ALK融合类型的检测能力,并且早前RT-PCR法采用电泳手段分析指示检测结果,难以避免扩增带来的假阳性;IHC法能够检测肿瘤特异性抗原表达,而不丢失能鉴别正常组织和病理组织的细胞和组织结构特征,具有快速筛选作用,但IHC法针对的是ALK蛋白表达量,可能存在假阳性情况(ALK蛋白表达量增高一方面可能由于肿瘤细胞中含有ALK基因融合,另一方面可能由于肿瘤细胞异常表达ALK蛋白),并且ALK蛋白表达结果可能会出现微弱的和局部的弱阳性结果,结果判读上存在一定主观性,对弱阳性结果须进一步用FISH等技术来验证。FISH技术可以运用探针诊断ALK重排,但该技术成本高、检测周期长,尤其是使用活检样本检测时,不易判读,并且对于特定融合类型,如EML4-ALK融合,因EML4基因与ALK基因在染色体位置上距离较近(12Mb),可能导致重排的分离信号不明显,产生假阴性结果。因此,临床上特别需要一种可以高效快速,高准确率,高灵敏度的定性基因表达的检测方法,从而为可为肿瘤患者个体用药提供科学依据,降低治疗风险以及患者负担。
针对上述问题,本发明开发一种快速、操作简便的ALK基因表达检测试剂盒及检测方法。本试剂盒以RNA为检测样本,通过检测5'端和3'端基因表达量的差异,提供ALK基因表达差异外显子的定性评估,适用于非小细胞肺癌患者在进入个性化靶向治疗之前。本检测方法灵敏度高,检测时间只需160分钟即可完成,同时具备了特异性好,准确率高,价廉快速,操作简单等优点,可以满足临床快速检测的实际需求。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于ALK基因表达检测的引物和探针,其特异引物与探针包括如下序列:
表1ALK基因表达特异性双引物和探针核苷酸序列
本发明另一方面提供一种用于检测ALK基因表达检测试剂盒,其PCR反应扩增体系如下:
本发明另一方面提供了一种用于mRNA反转录cDNA的方法,方法包括反转录体系组成以及如下操作步骤:
mRNA反转录cDNA体系包括如下成分:
(a)取ALK表达逆转录反应液18.5μL,逆转录酶(AMV)0.5μL,加入离心管中,混匀。
(b)加入待测样品RNA6μL。(RNA总量在0.1~5μg范围内,可用无RNase水进行稀释)
(c)42℃保温1个小时。
(d)95℃保温5分钟后冷却,得到的cDNA溶液用于PCR扩增。
本发明另一方面提供一种用于检测ALK基因表达的方法,其方法包括以下步骤:
(1)根据COSMIC数据公布的人类ALK为野生型基因序列,针对ALK基因5'和3'端外显子,设计特异性引物和探针。
(2)提取检测样本中基因组RNA,检测样本包括新鲜病变组织、石蜡包埋病理组织或切片、冰冻病理切片等组织。
(3)配制实时荧光PCR扩增反应体系。
(4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果:利用特异性引物和荧光探针对ALK基因5'端和3'端mRNA进行荧光PCR检测,5'端表达量由FAM信号指示,3'端表达量由HEX信号指示,获得ALK基因mRNA5'端和3'端荧光PCR Ct值,通过计算△△Ct的大小对表达差异进评估,
△△Ct=(Ct样品,FAM-Ct校准品,FAM)-(Ct样品,HEX-Ct校准品,HEX)
分析样本检测管的FAM和HEX信号,有以下4种情况:
a)若样本的表达差异检测管FAM和HEX均为阴性(无Ct值或者曲线没有升起),可能是由于所提取的样本RNA中含有PCR扩增的抑制物或者样本的RNA片段化较为严重或者样本的RNA发生降解,建议重新提取样本的RNA并重复实验。
b)若样本表达差异检测管HEX为阴性(无Ct值或者曲线没有升起)而FAM为阳性,说明样品中FAM的表达量高于HEX的表达量,因此样本不含有ALK基因融合。
c)若样本表达差异检测管FAM为阴性(无Ct值或者曲线没有升起)而HEX为阳性,则分为两种情况:
①若HEX的Ct值≤18,则该样本含有ALK基因融合;
②若HEX的Ct值>18,建议重新提取样本的RNA并重复实验。若重复结果相同,则样本不含有ALK基因融合。
d)若样本表达差异检测管的FAM和HEX均为阳性,根据以下公式进行计算:
△△Ct=(Ct样品,FAM-Ct校准品,FAM)-(Ct样品,HEX-Ct校准品,HEX)
①若-△△Ct≥5.0,则样品含有ALK基因融合;
②若-△△Ct<3.0,则样品不含ALK基因融合;
③若3.0≤-△△Ct<5.0,建议重复实验。若重复结果为-△△Ct≥3,则样本含有ALK基因融合;反之,为样本不含有ALK基因融合。
本发明的有益效果是:本发明采用了特异性引物和探针技术,可以特异性检测ALK基因差异表达,通过检测5'端和3'端基因表达量的差异,提供ALK基因融合的定性评估。此方法:(1)建立了实时PCR体系实现对ALK基因差异表达的快速检测;(2)灵敏度高,25拷贝的基因融合阳性质粒均可以检出;(3)操作简单,检测廉价,临床应用范围广;(4)样本检测范围广,样本可以为新鲜病理组织,石蜡包埋组织或冰冻病理切片;(5)检测速度快,检测过程只需要160分钟即可完成。
附图说明
图1为灵敏度分析试验结果PCR图。
图2为检测临床样本ALK表达阴性PCR图。
图3为检测临床样本ALK表达阳性PCR图。
具体实施方式
本发明以野生型细胞系基因组为RNA模板,建立ALK实时荧光PCR检测反应体系,针对5'端和3'端基因表达差异的外显子设计特异引物和探针,检测ALK基因表达差异的方法包括以下步骤:
(1)针对5'端和3'端基因表达差异的外显子设计合成特异性引物和探针
根据COSMIC数据库公布的野生型ALK基因序列,在ALK5'端(1-18外显子)和3'端(20-29外显子)设计特异引物和探针。通过特异性引物和探针优化,实现高灵敏和快速检测。应用Premier6.0引物设计软件设计探针和特异引物核苷酸序列,引物和探针序列如表1所示。
(2)检测样本处理与RNA的提取
检测样本包括新鲜病理组织、冰冻病理切片、石蜡包埋组织或切片。新鲜病理组织,取1克左右,使用Amoydx的新鲜组织RNA提取试剂盒提取其RNA。石蜡包埋组织或切片,使用AmoDx FFPE样品RNA提取试剂盒提取其RNA。上述具体操作步骤按试剂盒说明书操作。
(3)建立PCR扩增反应体系
将所提上述RNA溶于0.1%DEPC水中,经紫外分光光度计检测提取质量,确定其浓度OD260/OD280为1.9-2.1,并读取其含量。取0.1~5μg的RNA作为其cDNA合成的模板,cDNA合成体系如下:
应用上述反转录体系按如下步骤进行逆转录:
(a)取ALK表达逆转录反应液18.5μL,逆转录酶(AMV)0.5μL,加入离心管中,混匀。
(b)加入待测样品RNA6μL。(RNA总量在0.1~5μg范围内,可用无RNase水进行稀释)
(c)42℃保温1个小时。
(d)95℃保温5分钟后冷却,得到的cDNA溶液用于PCR扩增。
将上述所得cDNA模板,用作实时荧光PCR扩增的模板,按照如下扩增体系进行PCR扩增:
实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟,1个循环;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环。第三阶段退火时收集FAM和HEX荧光信号。
在每次PCR反应中,每份样品和ALK表达校准品(CAL),无模板对照(NTC,自备纯化水)共同进行分析。
(4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果:
利用特异性引物和荧光探针对ALK基因5'端和3'端mRNA进行荧光PCR检测,5'端表达量由FAM信号指示,3'端表达量由HEX信号指示,获得ALK基因mRNA5'端和3'端荧光PCR Ct值,通过计算△△Ct的大小对表达差异进行评估,
△△Ct=(Ct样品,FAM-Ct校准品,FAM)-(Ct样品,HEX-Ct校准品,HEX)
分析样本检测管的FAM和HEX信号,有以下4种情况:
a)若样本的表达差异检测管FAM和HEX均为阴性(无Ct值或者曲线没有升起),可能是由于所提取的样本RNA中含有PCR扩增的抑制物或者样本的RNA片段化较为严重或者样本的RNA发生降解,建议重新提取样本的RNA并重复实验。
b)若样本表达差异检测管HEX为阴性(无Ct值或者曲线没有升起)而FAM为阳性,说明样品中FAM的表达量高于HEX的表达量,因此样本不含有ALK基因融合。
c)若样本表达差异检测管FAM为阴性(无Ct值或者曲线没有升起)而HEX为阳性,则分为两种情况:
①若HEX的Ct值≤18,则该样本含有ALK基因融合;
②若HEX的Ct值>18,建议重新提取样本的RNA并重复实验。若重复结果相同,则样本不含有ALK基因融合。
d)若样本表达差异检测管的FAM和HEX均为阳性,根据以下公式进行计算:
△△Ct=(Ct样品,FAM-Ct校准品,FAM)-(Ct样品,HEX-Ct校准品,HEX)
①若-△△Ct≥5.0,则样品含有ALK基因融合;
②若-△△Ct<3.0,则样品不含ALK基因融合;
③若3.0≤-△△Ct<5.0,建议重复实验。若重复结果为-△△Ct≥3,则样本含有ALK基因融合;反之,为样本不含有ALK基因融合。
以下结合具体实施例,对本发明进一步阐述。应理解,这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明,本专利所述的科学术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
实施例1
运用本发明体系检测质粒,实验用质粒模板(含ALK表达外显子片段),利用上述荧光PCR检测ALK表达的方法如下:
(1)质粒处理与提取:
质粒的提取采用TIANGEN(HighPure Plasmid Kit,DP116)的质粒提取试剂盒进行提取,具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提DNA溶于Tris-HCl中(10mmol/L,PH8.0),经紫外分光光度计检测提取质量,确定其浓度,然后用Tris-HCl(10mmol/L,PH8.0)溶液调整DNA相应浓度到作为PCR模板,取5μL进行PCR反应扩增。
(2)建立PCR反应体系
将上述所得cDNA模板,用作实时荧光PCR扩增的模板,按照如下扩增体系进行PCR扩增:
实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟,1个循环;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环。在第三阶段退火时收集FAM和HEX或VIC荧光信号。
在每次PCR反应中,每份样品和ALK表达校准品(CAL),无模板对照(NTC,自备纯化水)共同进行分析。
(3)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果
利用特异性引物和荧光探针对ALK基因5'端和3'端mRNA进行荧光PCR检测,5'端表达量由FAM信号指示,3'端表达量由HEX信号指示,获得ALK基因mRNA5'端和3'端荧光PCR Ct值,通过计算△△Ct的大小对表达差异进行评估,
△△Ct=(Ct样品,FAM-Ct校准品,FAM)-(Ct样品,HEX-Ct校准品,HEX)
分析样本检测管的FAM和HEX信号,有以下4种情况:
a)若样本的表达差异检测管FAM和HEX均为阴性(无Ct值或者曲线没有升起),可能是由于所提取的样本RNA中含有PCR扩增的抑制物或者样本的RNA片段化较为严重或者样本的RNA发生降解,建议重新提取样本的RNA并重复实验。
b)若样本表达差异检测管HEX为阴性(无Ct值或者曲线没有升起)而FAM为阳性,说明样品中FAM的表达量高于HEX的表达量,因此样本不含有ALK基因融合。
c)若样本表达差异检测管FAM为阴性(无Ct值或者曲线没有升起)而HEX为阳性,则分为两种情况:
①若HEX的Ct值≤18,则该样本含有ALK基因融合;
②若HEX的Ct值>18,建议重新提取样本的RNA并重复实验。若重复结果相同,则样本不含有ALK基因融合。
d)若样本表达差异检测管的FAM和HEX均为阳性,根据以下公式进行计算:
△△Ct=(Ct样品,FAM-Ct校准品,FAM)-(Ct样品,HEX-Ct校准品,HEX)
①若-△△Ct≥5.0,则样品含有ALK基因融合;
②若-△△Ct<3.0,则样品不含ALK基因融合;
③若3.0≤-△△Ct<5.0,建议重复实验。若重复结果为-△△Ct≥3,则样本含有ALK基因融合;反之,为样本不含有ALK基因融合。
灵敏度分析:取定量后浓度为1000拷贝/μL的样品DNA,进行10倍梯度及2倍梯度稀释,共做4个稀释梯度,即1000拷贝/μL、100拷贝/μL、10拷贝/μL、5拷贝/μL,每次反应加入5μL进行扩增反应。结果表明,本发明灵敏度可以检测到5拷贝/μL,结果如图1。
检测结果表明,本发明的检测体系可以准确检测ALK质粒基因,检测的灵敏度可达到5拷贝/μL。
实施例2
运用本发明检测临床肺癌石蜡包埋组织样本共3845例,利用本发明特异引物和探针荧光PCR体系检测3845例临床样本ALK基因表达差异步骤如下:
(1)样本处理与RNA的提取:
(a)取上述各肺癌样本,分别加入1ml二甲苯,混匀,室温下14000RPM离心2min,弃上清液,加入1ml无水乙醇到沉淀中,震荡混匀(去除二甲苯),室温下14000RPM离心2min弃上清液,打开离心管盖,37℃晾干;
(b)在离心管中加150μl Buffer PKD及10μl蛋白酶K,震荡混匀,56℃孵育15min,80℃孵育15min,待降到室温后,加入16ul DNase Booster Buffer和10ul Dnase I原液,室温孵育15min,后加入320μl Buffer RBC,混匀;
(c)往上清液加入720μl无水乙醇,混匀,取700μl样品包括前面生成的沉淀转移到带有2ml收集管的RNA MinElute离心柱里,大于10,000rpm离心15s,弃废液,重复上一步直到样品转移到RNA MinElute离心柱里。
(d)打开盖子加入500μl Buffer RPE,盖紧盖子,大于10000rpm离心2min,将柱子转移到收集管中,向吸附膜中间部位滴加14-30μlRnase-free water,离心1min后收集RNA。
(2)建立PCR扩增反应体系:
将所提上述RNA溶于0.1%DEPC水中,经紫外分光光度计检测提取质量,确定其浓度OD260/OD280为1.9-2.1,并读取其含量。取0.1~5μg的RNA作为其cDNA合成的模板,cDNA合成体系如下:
应用上述反转录体系按如下步骤进行逆转录:
(a)取ALK表达逆转录反应混合液18.5μL,逆转录酶(ALK)0.5μL,加入离心管中,混匀。
(b)加入待测样品RNA6μL。(RNA总量在0.1~5μg范围内,可用无Rnase水进行稀释)
(c)42℃保温1个小时。
(d)95℃保温5分钟后冷却,得到的cDNA溶液用于PCR扩增。
将上述所得cDNA模板,用作实时荧光PCR扩增的模板,按照如下扩增体系进行PCR扩增:
实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟,1个循环;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环。第三阶段退火时收集FAM和HEX荧光信号。
在每次PCR反应中,每份样品和ALK表达校准品(CAL),无模板对照(NTC,自备纯化水)共同进行分析。
(3)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果
利用特异性引物和荧光探针对ALK5'端和3'端mRNA进行荧光PCR检测,5'端表达量由FAM信号指示,3'端表达量由HEX信号指示,获得ALK基因mRNA5'端和3'端荧光PCRCt值,通过计算△△Ct的大小对表达差异进行评估,
△△Ct=(Ct样品,FAM-Ct校准品,FAM)-(Ct样品,HEX-Ct校准品,HEX)
分析样本检测管的FAM和HEX信号,有以下4种情况:
a)若样本的表达差异检测管FAM和HEX均为阴性(无Ct值或者曲线没有升起),可能是由于所提取的样本RNA中含有PCR扩增的抑制物或者样本的RNA片段化较为严重或者样本的RNA发生降解,建议重新提取样本的RNA并重复实验。
b)若样本表达差异检测管HEX为阴性(无Ct值或者曲线没有升起)而FAM为阳性,说明样品中FAM的表达量高于HEX的表达量,因此样本不含有ALK基因融合。
c)若样本表达差异检测管FAM为阴性(无Ct值或者曲线没有升起)而HEX为阳性,则分为两种情况:
①若HEX的Ct值≤18,则该样本含有ALK基因融合;
②若HEX的Ct值>18,建议重新提取样本的RNA并重复实验。若重复结果相同,则样本不含有ALK基因融合。
d)若样本表达差异检测管的FAM和HEX均为阳性,根据以下公式进行计算:
△△Ct=(Ct样品,FAM-Ct校准品,FAM)-(Ct样品,HEX-Ct校准品,HEX)
①若-△△Ct≥5.0,则样品含有ALK基因融合;
②若-△△Ct<3.0,则样品不含ALK基因融合;
③若3.0≤-△△Ct<5.0,建议重复实验。若重复结果为-△△Ct≥3,则样本含有ALK基因融合;反之,为样本不含有ALK基因融合。
在所检测的3845例的临床样本中,检测出含ALK融合基因的样本118例,其阳性率为3.1%。同时采用直接测序法进行对比检测,结果表明本发明体系与直接测序法的符合率达到100%,进一步证明了本发明体系检测的准确性,结果见表2。本发明荧光PCR反应体系通过检测5'端和3'端基因表达量的差异,提供ALK基因表达差异外显子的定性评估,检测方便快捷,准确性高,可满足ALK基因差异表达的快速检测。该荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100%。
表2荧光PCR方法与传统测序方法比较
表3试剂盒组成成分
Claims (2)
1.用于检测ALK基因表达差异的引物和探针,其特征在于,包括以下序列:SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 12。
2.用于检测ALK基因表达差异的试剂盒,其特征在于,包括以下序列:SEQ ID NO 1-SEQID NO 12。
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