CN104031992B - 人类B-raf基因V600突变检测试剂盒 - Google Patents

人类B-raf基因V600突变检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人类B-raf基因V600突变检测试剂盒（荧光PCR法），所述的检测试剂盒包括用于阻断野生型B-raf基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增V600突变型B-raf基因序列的一组引物对及检测探针、作为试剂盒内部质控的一组引物对及检测探针。本发明的试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒，成本低等显著优点。

Description

人类B-raf基因V600突变检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术及临床分子诊断技术领域，特别涉及人类B-raf基因V600突变检测试剂盒。
技术背景
B-raf基因属于RAF家族一员，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从ras转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学活动。B-raf基因突变引起编码氨基酸的改变导致B-raf基因编码的蛋白持续被激活使得MAPK信号通路中的磷酸激酶活性改变，引起细胞异常增殖和分化，最终形成肿瘤。
B-raf基因错义突变在人类实体肿瘤发生率中占8%。在多种人类恶性肿瘤中，如结直肠癌、黑色素瘤、甲状腺癌、肺癌等均存在不同比例的B-raf突变。据统计，B-raf基因在原发性黑素瘤中突变率为80%、在转移性黑色素瘤中突变率为68%；在乳头状甲状腺癌（PTC）中突变率为56%；在结肠癌患者中突变率为15%；非小细胞癌患者中突变率为3%。B-raf基因突变主要发生在第11外显和第15外显子上，第15外显子突变发生率占80%，其中第15外显子处的600位氨基酸密码子GTG突变占第15外显子突变的90%以上。
检测B-raf基因突变情况对肿瘤的发生发展和对肿瘤个体化治疗和预后均具有重要的指导意义。研究表明，对EGFR靶向疗法缺乏敏感性的患者中，B-raf突变占10%；2011年版《NCCN结直肠癌临床实践指南》中明确指出结直肠癌患者应进行B-raf基因突变的检测，如果患者存在突变不建议使用抗EGFR单抗治疗。B-raf基因突变检测已经成为PTC细针穿刺细胞学标本诊断和病情预后的一个重要指标。针对黑色素瘤疗效显著的靶向药物维罗非尼/Vemurafenib已被美国FDA批准上市。因此，通过检测B-raf基因突变可以实现肿瘤患者的个体化治疗，大大改善或延长患者生存期。
对于晚期肿瘤及肿瘤复发而不能再次手术的患者，血浆突变检测可作为一种新的分子诊断方法，血浆分子检测将成为肿瘤研究的一大热点。原因在于取材方便，但是血浆肿瘤DNA含量较之肿瘤组织甚少，因此对于基因的检测方法的灵敏度及特异性提出很大挑战。
目前，针对B-raf基因突变检测的方法有多种，常规检测依然为DNA直接测序法，但是DNA直接测序法存在很多缺点，如：检测周期长，操作过程繁琐，结果判读复杂，尤其是检测灵敏度低（20%-25%），易污染等缺点将难以满足临床检测需求。目前临床急切需要一种快速、准确且能有效避免污染的B-raf基因突变检测试剂，来辅助临床诊断及用药。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速，准确，有效防止污染的人类B-raf基因V600突变检测试剂盒，解决现有技术中针对B-raf基因突变检测周期长，操作过程繁琐，结果判读复杂，灵敏度低，易污染等问题，尤其提供除了肿瘤组织之外的无创伤的血浆或其他体液的检测。
本发明的具体原理是：应用肽核酸PNA探针阻断B-raf野生型基因扩增，设计特异性引物及MGB探针与突变模板稳固结合，选用热启动DNA聚合酶，以脱氧核苷酸为底物，进行B-raf突变基因的体外PCR扩增。MGB探针在PCR过程中水解释放荧光信号对整个扩增过程进行实时监测，从而确定待测样本的B-raf基因V600突变情况。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：
一种人类B-raf基因V600突变检测试剂盒（荧光PCR法），所述的检测试剂盒包括用于阻断野生型B-raf基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增V600突变型B-raf基因序列的一组引物对及检测探针、作为试剂盒内部质控的一组引物对及检测探针；
所述用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针序列为下述序列中的任一条：
SEQIDNO.01：H2N/TCGAGATTTCACTGTAGCTA/CON2H
SEQIDNO.02：H2N/GATTTCACTGTAGC/CON2H
SEQIDNO.03：H2N/CGAGATTTCACTGTAGC/CON2H
SEQIDNO.04：H2N/TCGAGATTTCACTGTAGCTA/CON2H
SEQIDNO.05：H2N/TCGAGATTTCACTGTAGC/CON2H
所述用于特异性扩增靶向序列的一组引物对的上游序列为下述序列中的任一条：
SEQIDNO.06：5'GCCTCAATTCTTACCATCCACA3'
SEQIDNO.07：5'ACTGTTCAAACTGATGGGACC3'
SEQIDNO.08：5'CAGACAACTGTTCAAACTGAT3'
所述用于特异性扩增靶向序列的一组引物对的下游序列为下述序列中的任一条：
SEQIDNO.09：5'TGAGATCTACTGTTTTCCT3'
SEQIDNO.10：5'CATAATGCTTGCTCTGATAGG3'
SEQIDNO.11：5'TAATGCTTGCTCTGATAGGAA3'
所述用于检测B-raf基因V600突变的探针为MGB探针，探针的两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，其序列为述序列中的任一条：
SEQIDNO.12：FAM/ACTGTGAGGTCTTCATG/MGB
SEQIDNO.13：FAM/TCTGAGGTGTAGTAAGT/MGB
SEQIDNO.14：FAM/ATCTGAGGTGTAGTAAGT/MGB
SEQIDNO.15：FAM/TAGCTAGACCAAAATC/MGB
所述作为试剂盒内部质控的一组引物对，其序列为SEQIDNO.16，SEQIDNO.17。
SEQIDNO.16：5'TTCACCGCAGTGCATCAGAAC3'
SEQIDNO.17：5'GGACAGGAAACGCACCATATC3'
所述作为试剂盒内部质控的探针为TaqMan探针，探针的两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，其序列为：SEQIDNO.18。
SEQIDNO.18：FAM/GAATCGGGCTGGTTTCCAAACAGA/BHQ1
经各组分优及条件化试剂盒提供的最优引物和探针组合见实施例表1。
本发明所述的检测试剂盒还包括含有PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA的PCR反应体系及阳性对照品。
所述的阳性对照品是含有B-raf基因第15外显子一段碱基序列和B-raf基因第18外显子一段碱基序列的质粒基因组DNA混合物，浓度2ng/ul。
本发明经过大量试验、研究和分析成功研究出能够用于快速、灵敏、有效的检测B-raf基因V600突变的试剂盒。利用这个试剂盒可以检测出人类B-raf基因V600突变情况。
本发明涉及的人类B-raf基因V600突变检测试剂盒不包括对待测样品处理和模板提取的步骤，但对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的片段DNA依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。
与现有技术相比，本发明在PNA探针区分野生型和突变型基因的基础上，建立了多重实时PCR检测人类B-raf基因V600处所有突变的试剂盒，该试剂盒具有如下有益效果和显著进步：
（1）特异性强：本发明设计肽核酸探针，可有效抑制野生型基因组扩增，只富集突变型基因扩增，大大提高了检测特异性，本发明可有效抑制100ng野生型基因扩增，见图3。
（2）灵敏度高：本发明设计的TaqMan-MGB探针使用非荧光淬灭基团，使得背景荧光值很低，提高了检测灵敏度。本技术检出B-raf基因突变基因组DNA的敏感度为0.1%，即可检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其他微量组织中突变检测，远远高于测序法，见图4。
（3）适用于多种样本类型：本技术对标本DNA获取质量要求低，无论是新鲜组织还是石蜡组织，血清，血浆都能获得理想的检测效果。
（4）检测时间短，从样本送检到出结果约3个小时完成。
（5）操作简单，一次加样，从PCR反应开始到结束，一直在封闭的反应体系中进行，不但降低了污染几率，而且降低了结果出现偏差的几率。
（6）结果判读明确直观：可采用两个PCR管两个反应体系确定1份待测样本中B-raf基因V600突变情况。不仅仅依靠ct值而且还依靠两孔的ct差同时判定，增加了判读的准确性。
（7）安全：整个试剂盒不包含有毒有害物质，对操作人员和环境无危害。
总之，本发明涉及的人类B-raf基因V600突变检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒，成本低等显著优点。
附图说明
图1为本发明检测不含B-raf基因V600突变的阴性样品扩增曲线图。
图2为本发明检测含B-raf基因V600突变的样品扩增曲线图。
图3为本发明检测试剂盒耐受野生型基因组DNA扩增曲线图。
图4为本发明检测10ng野生型基因组背景下灵敏度扩增曲线图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1：临床样本DNA的提取
本实施例是从乳头状甲状腺癌患者的石蜡包埋组织切片中提取DNA,并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用Qiagen公司的QIAamp石蜡包埋组织提取试剂盒，具体详述如下。
1、实验前的准备
(1)将水浴锅调到56℃。
(2)将QIAamp试剂盒中的BufferATL和BufferAL于56℃放置，直到沉淀溶解。
2、样本的处理
(1)将石蜡切片上多余的石蜡切去,将切片切成合适的尺寸，装在石蜡切片机上。
(2)将卡尺调到10μm，然后切蜡块，直到切下的切片上明显的看到均匀的组织。
(3)去掉最初的5片，从第6片开始，装入1.5ml的EP管中，每管5片，然后编号。
3、DNA提取
(1)在样本中加入1ml二甲苯，盖上盖子，轻柔的旋转颠倒混匀，室温下14000rpm离心3min。
(2)用移液器吸去上清，加入1ml无水乙醇，盖上盖子，轻柔的旋转颠倒混匀，室温下14000rpm离心3min。
(3)用移液器吸尽上清，将盖子打开，在56℃放置10min。
(4)加入180μlBufferATL和20μl蛋白酶K，盖上盖子，旋涡混匀，于56℃水浴1h。
(5)从水浴锅中拿出样本，轻柔的旋转颠倒混匀，在干式恒温仪上90℃放置1h。
(6)用迷你离心机离心1min，使管盖上的液滴落下。
(7)加入100mg/ml的RNaseA2μl，旋涡混匀后室温放置2min。
(8)加入200μlBufferAL和200μl无水乙醇，立即旋涡混匀。
(9)用迷你离心机离心1min，使管盖上的液滴落下。
(10)将离心管中的液体加入到吸附柱中，注意不要吸到沉淀。盖上盖子，12000rpm离心2min。弃去流出物，将吸附柱置于新的干净的2ml的收集管上。
(11)加入500μlBufferAW1，盖上盖子，12000rpm离心2min。弃去流出物，将吸附柱置于新的干净的2ml的收集管上。
(12)加入500μlBufferAW2，盖上盖子12000rpm离心2min。弃去流出物，将吸附柱置于新的干净的2ml的收集管上。
(13)再12000rpm离心2min，彻底去除乙醇。
(14)将吸附柱套入一个干净的1.5ml的EP管中，打开盖子，在膜中央加入50μlBufferATE。
(15)盖上盖子，在56℃水浴10min。然后12000rpm离心2min。流出物即为提取的DNA。
4、定量
将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量，并稀释DNA浓度到2ng/μl。
实施例2：实时荧光PCR法扩增临床样本DNA
人类B-raf基因V600突变检测试剂盒含2个PCR反应体系分别是检测反应体系和定量反应体系，8联PCR反应条偶数孔为检测反应体系扩增突变模板，用来检测待检样本突变情况；8联PCR反应条奇数孔为定量反应体系，用来质控待测样本质量。本实施例采用如表1所示的引物、探针扩增实施例1所提取的DNA样品。
表1：试剂盒所提供的引物和探针序列
检测方法如下：
(1)取10μl（2ng/μl）待检测样本加入TaqDNA聚合酶1.2μl，盖紧管盖轻微震荡混匀离心，置于冰上，待用。
(2)取8联PCR反应条，确定奇数偶数孔后轻轻打开管盖。将步骤（1）混匀的待用液分别加到偶数孔检测体系与奇数孔定量体系孔中，5.6μl/孔，盖紧管盖，离心，确保试剂全落在PCR反应管的管底（注意避免剧烈振荡引起基因组DNA断裂）。
(3)把离心好的8联PCR反应条放置于荧光定量PCR仪中，PCR反应体系为：
1×PCR缓冲液：
dNTP：0.2~0.8mmol
MgCl2：2.0~5.0mmol
引物：0.1~1.0μmol
探针：0.1~1.0μmol
TaqDNA聚合酶：1~2Units
模板：4~6μl
总体积：20~30μl。
(4)设置PCR程序：
第一阶段：94℃1min；
第二阶段：94℃20s，70℃1s，60℃20s，40个循环；
第二阶段40个循环时，收集FAM和JOE信号。
本发明利用PNA区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的FAM和JOE的荧光强度来判断检测结果；JOE是内控信号，用于检测是否漏加样本及初步判定上样的DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值（CT值大于26）；FAM是检测信号，用于检测是否存在突变位点；在内控信号达到要求后，以FAM信号达到设定阈值所需的循环次数CT值作为判断标准，首先定量体系CT值应满足12≤CT值≤29，若定量体系FAM信号Ct值＜12说明待测样本DNA上样浓度过大；若Ct值＞29或无Ct值说明待测样本DNA上样浓度太低或已经降解建议重新处理待测样本DNA再验证。若实验满足以上条件再判定检测样本的突变清况，若检测体系CT值＜29且△Ct＜10判定检测样本为突变阳性；若检测体系CT值≥29或unde或△Ct≥10判定检测样本无突变为阴性。（注：△Ct=检测体系Ct值-定量体系Ct值）具体判定标准见表2。
表2：试剂盒结果判定参考值
。

Claims (3)

1.一种人类B-raf基因V600突变的检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒包括用于阻断野生型B-raf基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增V600突变型B-raf基因序列的一组引物对及检测探针、作为试剂盒内部质控的一组引物对及检测探针；
所述肽核酸PNA探针的序列为SEQIDNO.1所示序列；
所述用于特异性扩增B-raf基因靶向序列的一组引物对的上游序列为SEQIDNO.8所示序列；
所述用于特异性扩增B-raf基因靶向序列的一组引物对的下游序列为SEQIDNO.10所示序列；
所述用于V600突变型B-raf基因的检测探针为MGB探针，是两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，检测探针的序列为SEQIDNO.12所示序列；
所述的作为试剂盒内部质控的一组引物对，其序列为SEQIDNO.16和SEQIDNO.17所示；
所述作为试剂盒内部质控的检测探针为TaqMan探针，是两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，检测探针的序列为SEQIDNO.18所示。
2.根据权利要求1所述的人类B-raf基因V600突变的检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒还包括含有PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA的PCR反应体系及阳性对照品。
3.根据权利要求2所述的人类B-raf基因V600突变的检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照品为含有B-raf基因第15外显子序列和第18外显子序列的质粒基因组DNA混合物。
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