CN103571948A - 一种用于检测braf基因热点突变的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种用于检测BRAF基因热点突变的试剂盒及其检测方法。本发明试剂盒包含PNA试剂，利用钳夹技术封闭野生型BRAF基因序列，从而提高sanger测序法的灵敏度和BRAF基因突变的检出率。本发明检测方法操作简单、安全，不需要较多昂贵试剂的使用，经济高效；同时还具有操作时间短的优点，整个检测过程可在4～6小时内完成。

Description

一种用于检测BRAF基因热点突变的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测BRAF基因热点突变的试剂盒及其检测方法。 
背景技术
BRAF基因位于7q34，长约190kb，转录mRNA长2.5kb，编码783个氨基酸的蛋白。BRAF蛋白由783个氨基酸组成，功能上从N端到C端为RAS结合区、富含半胱氨酸区(Cys)、甘氨酸环(Gloop)和激活区。在绝大多数组织和细胞类型中，BRAF是MEK/ERK最为关键的激活因子。它主要有CR1、CR2和CR3三个保守区，其中CR1区含RBD区(ras banding domain，为RAS蛋白结合区)和富含半胱氨酸区(Cys)；CR3区为激酶结构域，含甘氨酸环(Gloop)，为ATP结合位点和激活区，该区T598和S601两个位点的磷酸化对BRAF蛋白的激活至关重要。BRAF蛋白的主要磷酸化位点为S364、S428、T439、T598和S601。BRAF蛋白的完全活化需要T598和S601两个位点的磷酸化，这两个位点氨基酸的置换将导致激酶持续性激活。 
研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF突变。BRAF突变主要有两种类型：1.11%位于exon11上的甘氨酸环，如G463、G465、G468等的点突变；2.89％的突变发生在exon15上的激活区，其中约92％位于第1799核苷酸上，T突变为A(T1799A以前认为是T1796A)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E以前被认为是V599E)。此外，仅不到1％的癌组织同时存在BRAF突变与RAS突变，且在这1％中，BRAF突变几乎均为非V600E突变。以上两种类型的突变均能使BRAF激酶活性及NIH3T3细胞转化能力提高，但以后者更为重要。V600E突变能模拟T598和S601两个位点的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活而导致肿瘤的发生和发展。 
目前用于基因突变检测的方法有Sanger测序法、高效液相色谱法、实时荧光定量PCR法等。Sanger基因测序技术经过了30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达1,000bp的DNA片段进行测序，而且对每一个碱基的读取准确率 高达99.999%。由于具有很高的读取准确率，Sanger法测序成为基因突变、单核苷酸多态性等基因分析的金标准。 
肿瘤组织中，BRAF野生型细胞与突变型细胞混杂，而Sanger测序法的灵敏度仅为10～20%，即当突变型细胞占整体检测细胞的10～20%时才能检出，因此而极大的限制了Sanger测序法的应用。 
肽核酸（peptide nucleic acids，PNA)一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA与互补DNA具有1个碱基不匹配时，其溶解温度会下降8℃～20℃，2个碱基不匹配时则完全不能杂交。鉴于上述诸多DNA分子不具备的优点，近十年来，人们为其在许多高技术领域找到了用途。 
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于检测BRAF基因热点突变的试剂盒及其检测方法，本发明采用PNA钳夹技术封闭野生型BRAF基因序列，从而提高检测BRAF基因热点突变的敏感度和突变检出率。 
为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现： 
一种用于检测BRAF基因热点突变的试剂盒，包括PCR反应液、PNA试剂、酶消化液、测序反应液、磁珠和产物纯化液，所述PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探针和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列为SEQ.ID NO.1，所述PCR反向引物的序列为SEQ.ID NO.2，所述探针的序列为SEQ.ID NO.3，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光基团为BHQ1；所述PNA的序列为SEQ.ID NO.4；所述测序反应液中含有Bigdye、Bigdye缓冲液和测序引物。 
上述方案中，所述PCR缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl和15mmol/L MgCl2组成；所述dNTPs的摩尔浓度为2.5mmol/L dNTPs；所述PCR正向引物的摩尔浓度为10μmol/L，所述PCR反向引物的摩尔浓度为10μmol/L；所述探针的摩尔浓度为10μmol/L；所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/μl；所述PNA试剂的摩尔浓度为10μmol/L。 
上述方案中，所述酶消化液包括核酸外切酶Ⅰ和碱性磷酸酶。 
上述方案中，所述核酸外切酶Ⅰ和碱性磷酸酶的酶活力单位比为5：2。 
上述方案中，所述测序反应液含有5×Bigdye、2.5×Bigdye缓冲液和3μmol/L的测序引物。 
上述方案中，所述产物纯化液为0.75M氯化钠溶液。 
上述方案中，在所述PCR正向引物的5’端插入通用M13序列： 
TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述PCR反向引物的5’端插入通用M13序列： 
CAGGAAACAGCTATGACC，则所述的测序引物序列为： 
TGTAAAACGACGGCCAGT。 
一种利用上述试剂盒检测BRAF基因热点突变的方法，具体包括如下步骤： 
（1）目的基因荧光定量PCR扩增：使用试剂盒中荧光定量PCR反应液和PNA试剂，对样品DNA进行PCR扩增反应，得到目的基因的定量结果和PCR产物； 
（2）根据步骤（1）中的定量结果，使用试剂盒中的酶消化液，对步骤（1）得到的PCR产物进行纯化，得到纯化后PCR产物； 
（3）使用试剂盒中的测序反应液，对步骤（2）得到的纯化后PCR产物进行测序PCR反应，得到测序PCR产物； 
（4）使用试剂盒中的磁珠和产物纯化液，对步骤（3）得到的测序PCR产物进行纯化，得到纯化后测序PCR产物； 
（5）将步骤（4）得到的纯化后测序PCR产物加样至测序仪进行序列分析，测序所得基因序列与NCBI（美国国立生物技术信息中心）数据库中BRAF基因标准序列进行比对，并查看峰图，判断是否存在BRAF基因热点突变：若峰图中BRAF基因热点突变区域600位点GTG峰图下游典型的突变套峰，或者完全为突变峰图，可知样本中部分或全部细胞含有BRAF热点突变区域600位点。 
本发明的有益效果： 
（1）本发明试剂盒包含PNA试剂，在对样本DNA进行PCR扩增反应中，利用PNA试剂封闭野生型BRAF基因序列，提高sanger测序法的灵敏度和BRAF基因突变的检出率。 
（2）本发明检测方法操作简单、安全，同时不需要较多昂贵试剂的使用，经济高效。 
（3）本发明检测方法操作时间短，整个检测过程可在4～6小时内完成。 
附图说明
图1为BRAF基因突变热点区域序列，其中下划线代表引物序列或引物结合位点，方框代表探针序列或探针结合位点，下划虚线代表PNA序列或PNA结合位点，斜体字母代表突变位点。 
图2为实施例1中BRAF基因荧光定量PCR扩增曲线。 
图3为实施例1中BRAF基因测序图。 
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图、表格、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。 
实施例1 
1、荧光定量PCR反应液中的引物、探针序列的合成和PNA序列的合成 
根据BRAF基因热点突变区域和测序片段的要求（见图1），设计如下引物、探针和PNA，并用人工合成的方法合成如下引物、探针和PNA： 
BRAF600F:CTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG（SEQ.ID NO.1） 
BRAF600R:TCAACTATAGTATTTTCATAGTTCCCAG（SEQ.ID NO.2） 
BRAF600P:FAM-CTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCCA-BHQ1（SEQ.ID NO.3） 
BRAF600PNA:CTAGCTACAGTGAAATCTC（SEQ.ID NO.4） 
上述引物、探针和PNA序列均为5’端至3’端，600表示BRAF突变热点区域密码子编号，F表示正向引物，R表示反向引物，P表示探针，FAM表示探针中荧光基团，BHQ1表示淬灭基团。 
在上述正向引物的5’端插入通用M13序列：TGTAAAACGACGGCCAGT，在反向引物的5’端插入通用M13序列：CAGGAAACAGCTATGACC，该通用引 物插入的意义在于能够使本实验方案后序的测序反应均使用统一的测序引物。 
2、目的基因片段的荧光定量PCR扩增 
（1）提取样本DNA：人工合成BRAF基因突变热点区域野生型和突变型基因，BRAF基因突变热点区域野生型的序列为SEQ.ID NO.5，BRAF基因突变热点区域突变型的序列为SEQ.ID NO.6，分别转化入DH5α大肠杆菌后培养，然后以野生型菌：突变型菌浓度比为99:1混合，再提取混合菌液DNA，即为样本DNA； 
（2）使用试剂盒中PCR反应液和PNA试剂，对上述样本DNA进行荧光PCR反应扩增，得到目的片段DNA，PCR反应体系为25μl体系： 
Figure BDA0000392861800000051
上述PCR反应液含有10×100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl、15mmol/LMgCl2、、2.5mmol/L dNTPs、10μmol/L正向引物、10μmol/L反向引物、10μmol/L探针、5U/μl Taq DNA聚合酶；上述PNA试剂的摩尔浓度为10μmol/L；其中正向引物的序列为SEQ.ID NO.1，反向引物的序列为SEQ.ID NO.2，探针的序列为SEQ.ID NO.3，PNA的序列为SEQ.ID NO.4。 
（3）PCR扩增程序如下表： 
表1PCR扩增程序 
Figure BDA0000392861800000052
（4）得到PCR扩增产物和荧光定量PCR扩增结果曲线，根据荧光PCR扩增曲线（图3）判断PCR扩增产物的有无和特异性：从图3看出，PCR扩增曲线成典型的“S”型曲线，曲线光滑，无明显的背景信号，这说明有特异性的PCR扩增产物。 
3、PCR产物的纯化 
取上述PCR反应产物5μl置于1管中，每管加入试剂盒中酶消化液3μl，混匀，瞬间离心后，37℃加热45分钟，80℃加热15分钟。该酶消化液由1U/μl碱性磷酸酶2μl和5U/μl核酸外切酶Ⅰ1μl组成，能去除PCR反应残余的引物、dNTP、单链DNA等，从而得到纯化后PCR产物。 
4、测序PCR反应 
使用试剂盒中测序反应液，取上述经酶消化液消化后得到的纯化后PCR产物3μl进行测序PCR反应，得到测序PCR产物。 
测序反应体系如下： 
测序反应液        1.75μl 
纯化后PCR产物     3μl 
双蒸水            1.25μl 
上述测序反应液含有5×Bigdye、2.5×Bigdye缓冲液和3μmol/L的测序引物，其中测序引物的序列为：TGTAAAACGACGGCCAGT。 
测序反应程序如下表2： 
表2测序PCR反应程序 
Figure BDA0000392861800000061
5、采用磁珠法纯化测序PCR产物 
（1）取上述测序PCR产物6μl，加入54μl0.75M NaCl，加入30μl异丙醇和10μl磁珠，混匀后，室温静置3分钟； 
（2）置于磁力架静置1min，弃废液； 
（3）再加入200μl70%乙醇，混匀，静置1min，置于磁力架静置1分钟； 
（4）弃废液，将液体尽量吸干，室温晾干； 
（5）然后加入20μl双蒸水，混匀，60℃放置3min，置于磁力架静置1min，取上清10μl，置于95℃，5min，再放在-20℃，5min，即得到纯化后测序PCR产物。 
6、纯化后的测序PCR产物加样至测序仪测序 
将上述10μl纯化后测序PCR产物加样至测序仪，测序仪为ABI公司3500测序仪，测序模式为标准模式或快速模式，得到测序结果见图3，图3中测序所得基因序列与NCBI（美国国立生物技术信息中心）数据库中BRAF基因标准序列进行比对，并查看峰图，峰图中BRAF基因热点突变区域600位点GTG峰图下游典型的突变套峰，可知样本中部分细胞含有BRAF热点突变区域600位点突变为TTG。 
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。 
Figure IDA0000392861890000011
Figure IDA0000392861890000021

Claims (8)

1.一种用于检测BRAF基因热点突变的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、PNA试剂、酶消化液、测序反应液、磁珠和产物纯化液，所述PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探针和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列为SEQ.ID NO.1，所述PCR反向引物的序列为SEQ.ID NO.2，所述探针的序列为SEQ.ID NO.3，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光基团为BHQ1；所述PNA的序列为SEQ.ID NO.4；所述测序反应液包含Bigdye、Bigdye缓冲液和测序引物。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液由100mmol/LTris-HCl、500mmol/L KCl和15mmol/L MgCl2组成；所述dNTPs的摩尔浓度为2.5mmol/L dNTPs；所述PCR正向引物的摩尔浓度为10μmol/L，所述PCR反向引物的摩尔浓度为10μmol/L；所述探针的摩尔浓度为10μmol/L；所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/μl；所述PNA试剂的摩尔浓度为10μmol/L。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述酶消化液包括核酸外切酶Ⅰ和碱性磷酸酶。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述核酸外切酶Ⅰ和碱性磷酸酶的酶活力单位比为5：2。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述测序反应液含有5×Bigdye、2.5×Bigdye缓冲液和3μmol/L的测序引物。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述产物纯化液为0.75M氯化钠溶液。
7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于在所述PCR正向引物的5’端插入通用M13序列：TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述PCR反向引物的5’端插入通用M13序列：CAGGAAACAGCTATGACC，则所述的测序引物序列为：TGTAAAACGACGGCCAGT。
8.一种使用权利要求1～7所述试剂盒检测BRAF基因热点突变的方法，其特征在于它包括如下步骤：
（1）目的基因荧光定量PCR扩增：使用试剂盒中的PCR反应液和PNA试剂，对样品DNA进行PCR扩增反应，得到目的基因的荧光定量结果和PCR产物；
（2）根据步骤（1）中的定量结果，使用试剂盒中的酶消化液，对步骤（1）得到的PCR产物进行纯化，得到纯化后PCR产物；
（3）使用试剂盒中的测序反应液，对步骤（2）得到的纯化后PCR产物进行测序PCR反应，得到测序PCR产物；
（4）使用试剂盒中的磁珠和产物纯化液，对步骤（3）得到的测序PCR产物进行纯化，得到纯化后测序PCR产物；
（5）将步骤（4）得到的纯化后测序PCR产物加样至测序仪进行序列分析，测序所得基因序列与BRAF基因标准序列进行比对，判断是否存在BRAF基因热点突变。
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