TWI579722B - 藥物不良反應風險評估方法及其裝置 - Google Patents

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Description

藥物不良反應風險評估方法及其裝置
本發明係關於一種藥物不良反應風險評估方法，特別是指一種抗甲狀腺藥物不良反應之風險評估方法；本發明另關於一種藥物不良反應評估裝置，特別是指一種抗甲狀腺藥物不良反應之風險評估裝置。
葛瑞夫茲氏病（Graves’ Disease，簡稱 GD， 人類孟德爾遺傳編號27500）是甲狀腺機能亢進的最主要原因，臨床表現包括瀰漫性甲狀腺腫大、甲狀腺功能過高、抗甲狀腺抗體、眼病變以及皮膚病變。本疾病的盛行率高達 1.0% 至1.6%，且女性比男性更常見。抗甲狀腺藥物(antithyroid drugs，簡稱 ATD)包括甲硫咪唑(methimazole)、卡比馬唑(carbimazole)及丙硫氧嘧啶(propylthiouracil)等，是屬於硫代醯胺（thionamide）一類相對簡單的分子，這些藥物是全世界治療葛瑞夫茲氏病以及甲狀腺功能過高症的主要選擇。
硫代醯胺類藥物引發之無顆粒性白血球症（thionamide induced agranulocytosis，簡稱 TiA），定義為當服用抗甲狀腺藥物期間發生絕對顆粒性白血球數量小於500每立方毫米，是抗甲狀腺藥物所引發最嚴重的藥物不良反應，在接受這些藥物的患者中約0.1%-0.37%可能發生。無顆粒性白血球症可能致命，且可以被許多種非化學治療藥物所引發。在最近一篇文獻探討所列舉的十一種可能引發無顆粒性白血球症的藥物中，抗甲狀腺藥物就佔了其中的三種，而其他藥物還包括clozapine、dapsone、dipyrone,、penicillin G 、 procainamide 、 rituximab 、 sulfasalazine 及 ticlopidine。
藥物不良反應(Adverse Drug Reaction，簡稱ADR)為一種非預設且不希望發生的藥物反應，其可以大致分為幾種類型，包括A型（劑量相關的，增強型）和B型（非劑量相關的，奇異型），並且具有不同的遺傳傾向。抗甲狀腺藥物所引發的無顆粒性白血球症屬於 B 型。根據藥物遺傳學之研究顯示，偵測患者體內藥物不良反應相關之對偶基因有助於評估患者是否有發展藥物不良反應之風險，而人類白血球表面抗原(HLA)基因已被證明與許多藥物不良反應相關，包括 carbamazepine引發之 Stevens-Johnson 症候群（HLA-B*15:02 及HLA-A*31:01 ）、abacavir引發之過度敏感症候群（HLA-B*57:01），以及 lapatinib 引發之肝臟傷害（HLA-DQA1*02:01）等。非人類白血球表面抗原基因也可能經由各種藥代動力學以及藥效學機轉而引發各式藥物不良反應。整體而言，有關藥物引起無顆粒性白血球症的藥物基因體學研究仍然相當不足，而且往往沒有確定結論，因此，找出抗甲狀腺藥物引發無顆粒性白血球症之致病基因，實屬極為重要之議題。
就本案的一方面而言，本案提出一種評估患者針對一抗甲狀腺藥物發展出一藥物不良反應風險之方法，包括自一患者取得一生物檢體，以及偵測該生物檢體中是否存在與該藥物不良反應相關之HLA-B*38:02對偶基因或HLA-DRB1*08:03 對偶基因，若該HLA-B*38:02 對偶基因或該HLA-DRB1*08:03 對偶基因任一者為存在，即判定該患者具有針對該抗甲狀腺藥物發展出該藥物不良反應之風險，其中，該藥物不良反應為無顆粒性白血球症。
根據上述構想，該對偶基因之存在也可藉由偵測該對偶基因之等效基因標記來判定。由於接近所需HLA對偶基因之基因標記與該對偶基因易於共同分離或呈現連鎖不平衡狀態，因此，此等效基因標記為所需對偶基因是否存在之指標，進而可代表患者是否具有發展藥物不良反應之風險
前述等效基因標記可為任何型式，包括但不限於：限制性片段長度多態性(RFLP)、微衛星標記與單核苷酸多型性(SNP)標記。等效基因標記可採用上述之方法或習知相關方法進行檢測。
於本案所提出之藥物不良反應風險評估方法中，偵測該HLA-B*38:02對偶基因係包含偵測該HLA-B*38:02 對偶基因之一等效基因標記；其中偵測該HLA-DRB1*08:03對偶基因係包含偵測該HLA-DRB1*08:03 對偶基因之一等效基因標記。
根據上述構想，其中該等效基因標記係選自由限制性片段長度多態性、微衛星標記及單一核苷酸多型性標記所組成之群。
根據上述構想，其中該HLA-B*38:02 對偶基因之存在係以單核苷酸多型性標記rs17193122、rs140833037 或 rs34531986為代表，其中該HLA-DRB1*08:03對偶基因之存在係以單核苷酸多型性標記rs116869525、rs117921525或rs117968912為代表。
於本案所提出之藥物不良反應風險評估方法中，若該HLA-B*38:02對偶基因為存在，即表示該患者發展出該藥物不良反應之風險相較不具該對偶基因者之勝算比(odds ratio)大於20；若該HLA-DRB1*08:03 對偶基因為存在，即表示該患者發展出該藥物不良反應之風險相較不具該對偶基因者之勝算比(odds ratio)大於6；若該HLA-B*38:02 對偶基因及該HLA-DRB1*08:03 對偶基因皆存在，即表示該患者發展出該藥物不良反應之風險相較不具該二對偶基因者之勝算比(odds ratio)大於48。
於本案所提出之藥物不良反應風險評估方法中，其中該抗甲狀腺藥物係為一硫代醯胺(thionamide)類藥物。於一較佳實施例中，該硫代醯胺類藥物係選自由甲硫咪唑(methimazole)、卡比馬唑(carbimazole)及丙硫氧嘧啶(propylthiouracil)所組成之群。
於本案所提出之藥物不良反應風險評估方法中，該生物檢體為核酸。於一較佳實施例中，該生物檢體為基因組DNA。於另一較佳實施例中，該生物檢體係選自由血液、尿液、唾液及毛髮所組成之群。
於本案所提出之藥物不良反應風險評估方法中，該患者為亞洲人。於一較佳實施例中，該患者為華人。
就本案的另一方面而言，本案提出一種藥物不良反應風險評估裝置，該裝置包含至少ㄧ探針，該探針可偵測該HLA-B*38:02對偶基因或該HLA-DRB1*08:03 對偶基因。於一較佳實施例中，該探針可偵測該HLA-B*38:02對偶基因或該HLA-DRB1*08:03 對偶基因之一等效基因標記。於另一較佳實施例中，該探針可偵測單核苷酸多型性標記rs17193122、rs140833037、rs34531986、rs116869525、rs117921525 或 rs117968912。
根據上述構想，該探針包含一寡核苷酸，該寡核苷酸係專一性地與該HLA-B*38:02對偶基因或該HLA-DRB1*08:03 對偶基因相結合。
本案得藉由以下圖式與實施方式說明而更易於讓在此領域具有通常知識者瞭解本案的精神。
本案「藥物不良反應風險評估方法及其裝置」將可透過以下的實施例說明而讓在此領域具有通常知識者瞭解其創作精神，並可據以實施。然本案的實施並非由下列實施例而限制其實施型態。
實施例一 研究對象之選定
葛瑞夫茲氏病是依據臨床上是否出現甲狀腺功能亢進，加上甲狀腺眼疾或是瀰漫性甲狀腺腫大，並加上血清檢驗出自體抗體作為判斷。抗甲狀腺藥物導致的無顆粒性白血球症，其診斷方式由最初對病患的詢問調查到利用病歷資料蒐尋。病患如果同時接受化療、clozapine、dapsone、dipyrone、penicillin G、procainamide、sulfasalazine 或 ticlopidine 等藥物的治療則被排除。雖然抗甲狀腺藥物導致的無顆粒性白血球症一般定義為在使用thionamide類的藥物造成絕對顆粒性白血球數量小於500每立方毫米，本研究病患都是在發生感染症的情況下被發現而非只是單純驗血得知。患者都有發燒喉嚨痛等症狀並可能有皮膚紅疹而住院治療，無顆粒性白血球症大約在使用抗甲狀腺藥物後三個月內出現。
本案共收入21位病患進入第一階段研究作基因型鑑定。以患有無顆粒性白血球症的葛瑞夫茲氏病患為病例組，而第一階段研究的對照組則為497位無親屬關係的葛瑞夫茲氏病患和165位從葛瑞夫茲氏病家族中挑選出來的葛瑞夫茲氏病患者成員（一個家族只納入一位病患）。第一階段研究出現正面跡象後再額外加入21名抗甲狀腺藥物導致無顆粒性白血球症病患作為病例組而進入第二階段研究，另再納入共546位無親屬關係的葛瑞夫茲氏病患做為對照組。採用QUANTO軟體來計算，並以不同的次要對偶基因頻率(Minor Allele Frequency，MAF)及勝算比(Odds Ratio，OR)作計算，本案帶有之樣本數量對於偵測重要基因變異具統計效力。
實施例二直接人類白血球表面抗原 (HLA)基因型鑒定
直接偵測HLA基因型或是其內部之特殊區域可用來判定一基因標記是否存在。從患者體內取得檢體並製備其基因體DNA來測定一對偶基因之存在已屬習知技術，例如美國Gentra Systems公司所生產之PUREGENE DNA純化系統，其係用以測定指定基因標記內一段區域上的核苷酸。測定特定區域之方法亦為習知技術，例如序列專一性寡核苷酸(Sequence Specific Oligonucleotide，SSO)雜交試驗、即時聚合酶鏈鎖反應(real-time PCR)，或是經結合之序列專一性寡核苷酸-酵素連結免疫吸附試驗等。
由聚合酶鏈鎖反應取得之DNA產物可用序列專一性探針來偵測，如：TaqMan、Beacon、Scorpions的水解性探針或是雜交探針。這些探針被設計成可與指定區域結合。該聚合酶鏈鎖反應產物可藉由DNA黏合物，如SYBR® Green來偵測。
本發明中使用四種HLA基因型鑑定方法，包括：（1）Dynal RELI SSO基因型鑑定套組（Dynal公司生物技術有限公司，現為Life Technologies公司所有）；（2）Gold SSP HLA-DPB1高解析度套組（Invitrogen公司，現為Life Technologies所有；（3）LABType SSO套組（One lambda公司）；和（4）SeCore HLA基因型鑑定套組（Life Technologies公司）。 前三種方法被應用到第一階段 21 位無顆粒性白血球症病例組的其中 2 名和所有的 662 位對照組，第四種方法（SeCore HLA基因型鑑定試劑）則用在所有的42位無顆粒性白血球症病例組（包括第一和第二階段）和546位第二階段的對照組。除了有2位無顆粒性白血球症病患接受了一個以上的基因型鑑定方法分析之外，本案還隨機選擇24個第一階段的對照組也使用SeCore HLA的基因型鑑定，以確保不同方法下所得到的基因型鑑定結果是一致的。
Dynal RELI SSO基因型鑑定係依據製造商的說明進行。簡要地說，使用特定基因座引子的聚合酶鏈鎖反應（PCR），分別用於擴增第一類（HLA-A，-B和-C）基因的外顯子2和外顯子3或是第二類（-DQB1和 - DRB1）基因的外顯子2。隨後將PCR產物和預先以線性陣列固定在尼龍膜的序列特異性寡核苷酸（SSO）探針進行雜交（HLA-A：48個探針，-B：61個探針， -C：37個探針，-DQB1：41個探針和-DRB1：60個探針）。最後使用模式匹配程序解譯基因型。
由於Dynal公司RELI SSO系統缺乏DPB1基因型鑑定套組，故本案使用製造商建議的「Gold SSP HL​​A-DPB1高解析度組」序列特異性引物（SSP）的擴增方法來分析HLA-DPB1。簡單地說，對每個DNA樣本進行48 PCR反應，經PCR擴增和電泳後，陽性擴增的型態用UniMatch軟件（Invitrogen公司）來分析HLA-DPB1基因型。
LABType SSO的基因型鑑定係根據製造商的方案進行。簡言之，將PCR產物結合到螢光編碼的微球探針（HLA-A：58/61/63個探針，-B：100個探針，-C：56個探針，-DPB1：40個探針，-DQB1：37個探針和-DRB1：70個探針）。接著用流式分析器來確定每個微球體的螢光強度（LABType視覺軟件; One lambda 公司），最後根據反應型態確認HLA基因型。
SeCore HLA基因型鑑定如下進行。根據製造商的說明使用SeCore HLA基因型鑑定套組（Life Technologies公司）決定HLA-A，HLA-B，HLA-C和HLA-DPB1上外顯子2，外顯子3和外顯子4的基因多型性，HLA-DRB1外顯子2的基因多型性，和HLA-DQB1外顯子2和外顯子3的基因多型性。簡單地說，經過基因座特異性聚合酶鏈鎖反應擴增，將PCR產物用核酸外切酶 I 和蝦鹼性磷酸酶處理，以除去過量的dNTP和引子。每個外顯子的測序反應使用Big Dye terminator v1.1 循環測序套組雙向進行，用ABI 3730自動測序儀（應用生物系統公司）進行測序。對偶基因的指定由選定的序列與IMGT / HLA數據庫的已知對偶基因序列的所有組合以uTYPE序列分析軟體（Life Technologies公司）進行比較。在出現基因型歧義的雜合個體的情況下，即幾個不同基因型組合卻產生相同的測序結果，對偶基因之指定係依照台灣人口中最常見的情況。
此外，測定對偶基因之存在亦可藉由使用由生物檢體(如：血液、唾液、尿液，或毛髮)製備之基因組DNA來直接測定該基因內之區域或核苷酸。該對偶基因亦可利用如血清學或微細胞毒性方法測定，亦可藉由檢測對偶基因之等效基因標記(equivalent genetic marker)來測定，例如：單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism, SNP)、微衛星標記(microsatellite marker)，或任何種類之基因多樣性標記。
本案由6個人類白血球表面抗原基因（HLA-A, -B, -C, -DPB1, -DQB1 及 -DRB1）直接基因型鑒定的資料進行分析，在第一階段的研究中（21位無顆粒性白血球症病患以及662 位葛瑞夫茲氏病患對照組），本案發現兩個顯著的相關信號，分別是在HLA-B*38:02 (P值 = 1.59 × 10-9 ) 以及 HLA-DRB1*08:03 (P值 = 1.24 × 10-5 )。而第二階段研究（21位無顆粒性白血球症病患以及546 位葛瑞夫茲氏病患對照組）則重現了第一階段研究的相關信號：HLA-B*38:02 (P值= 1.59 × 10-27 ) 及HLA-DRB1*08:03 (P值 = 3.91 × 10-5 )。兩階段合併分析（42位無顆粒性白血球症病患以及1208 位葛瑞夫茲氏病患對照組）可以看到更強的相關信號：HLA-B*38:02 (P值 = 6.75 × 10-32 ) 及HLA-DRB1*08:03 (P值 = 1.83 × 10-9 ) ，詳如下表一所示。表一、第一階段、第二階段及整體之相關性研究結果 Chr. ：染色體; RAF：高危險對偶基因頻率; OR：勝算比; CI：信賴區間.a 物理位置係依NCBI build 37.1進行標誌 。b 勝算比係以對偶基因相關性測試計算 。c P值係利用Cochran-Armitage 趨勢檢定計算。
HLA-B*38:02 對偶基因型頻率在無顆粒性白血球症患者為 29.8%，遠高於葛瑞夫茲氏病患對照組的3.3%以及一般台灣人族群的 3.3%。HLA-DRB1*08:03 對偶基因型頻率在無顆粒性白血球症患者為28.6%，遠高於葛瑞夫茲氏病對照組的8.4%以及一般台灣人族群的8.6%。帶有HLA-B*38:02 或HLA-DRB1*08:03 而發生無顆粒性白血球症的風險對比起不帶這對偶基因型的人的勝算比（odds ratio）分別是 21.48（95％信賴區間為11.13~41.48）及6.13（95％信賴區間為3.28~11.46）。同時帶有此二對偶基因型的個案對比起不帶這對偶基因型的人的勝算比更高達48.41 (P值 = 3.32 × 10-21 , 95％信賴區間為21.66~108.22)。
參考第1圖所示，上方圖示X軸代表染色體的區域，左側Y軸代表全基因體相關研究所得之 –log10 P值。點的顏色顯示 rs17193122 或 rs116869525 與其位於 4 Mb 區域內相鄰的單核苷酸多型性標記之間的連鎖不平衡，其中rs17193122係與30~32Mb單核苷酸多型性標記比較，rs116869525係與32~34 Mb單核苷酸多型性標記比較。虛線表示統計上有意義的門檻值(9.56 x 10-8 )。右側Y軸顯示單核苷酸多型性標記之重組率，其係以1000基因組計畫的亞洲祖系族群資料進行計算。第1圖下方圖示係依據相關區域的r2 值所繪之連鎖不平衡圖譜，該數據係以本發明的969個樣本進行基因型鑑定而得。本圖譜係使用Haploview軟體4.2版描繪，且 r2 (x100) 值記載於方塊圖形中。由此可知這兩個對偶基因並非出於同一個連鎖不平衡區域（linkage disequilibrium block）中。
本案另發現HLA-A*02:03 、HLA-C*07:02 及HLA-DQB1*06:01 也帶有和無顆粒性白血球症的顯著相關信號(P值 = 4.22 × 10-8 ，4.09 × 10-6 及 1.29 × 10-6 )。根據本案的資料分析這幾個對偶基因分別和HLA-B*38:02 或HLA-DRB1*08:03 具有連鎖不平衡的情形，因此並非獨立相關信號。
實施例三　全基因體 SNP基因型鑒定
全基因體基因型鑑定之分析係使用具有642,832個單核苷酸多型性(SNP)標記的Affymetrix Axiom全基因體CHB 1陣列板（博奧生物有限公司）進行。由Axiom GT1演算全基因體基因型，然後針對個人和SNP進行系統的質量控制，其方式為移除漏失樣本大於1％的SNP、並非體染色體(autosomal)、次要對偶基因頻率(MAF)小於1％或是對照組有表現出哈迪-溫伯格平衡顯著偏差（P值小於1×10-5 ）者。本案刪除了病患和對照組中基因型call rates有顯著差異（P值小於1×10-6 ）者。樣本過濾上生成的基因型陣列小於95％的位點被排除在外。雜合率計算，偏差超過6個標準差的也被排除在外。X染色體SNP的雜合被用來驗證樣本來源的性別，沒有出現性別不匹配。PLINK版本1.07軟體被用來識別基因是否從同一個體（或同卵雙胞胎）或是一、二、三等親屬而來。這些判斷是基於從身份血統狀態發現隱藏關聯的證據。篩選後，本案總共在42位抗甲狀腺藥物導致的無顆粒性白血球症病患和927位葛瑞夫茲氏病患對照組個案中保留了522,980個單核苷酸多型性(SNP)標記。
利用Affymetrix Axiom全基因體CHB 1陣列板（在體染色體共522,980個品質可靠之單核苷酸多型性標記）進行研究顯示許多處相關信號。參考表1、第1圖及第2圖所示，其中第2圖係以Manhattan plot 顯示以Cochran-Armitage Test分析522,980個單核苷酸多型性標記的趨勢，所得之全基因體P值(-log10 P值)。該分析係來自於42位無顆粒性白血球症患者以及927位葛瑞夫茲氏病患對照組。同一染色體上的單核苷酸多型性標記以同顏色標示。其中該橫線之P值等於9.56 × 10-8 ，係作為本發明全基因體統計上有意義的門檻值。
經過分析比對，本發明確認在人類白血球表面抗原基因區域有兩組彼此獨立的相關信號，且每一組都個別有許多單核苷酸多型性標記，其中第一組信號可用 rs17193122 作為代表 (第一階段P值 = 8.18 × 10-8 ，第二階段P值 = 1.15 × 10-24 ，整體P值= 4.29 × 10-27 )。第二組信號可用rs116869525 作為代表 (第一階段P值= 3.88 × 10-5 , 第二階段P值= 8.24 × 10-5 , 整體P值= 1.27 × 10-8 )。本案亦發現一組人類白血球表面抗原區域以外的另一相關信號，位於染色體3q13，可用 rs56343172 作為代表（第一階段P值= 1.71 × 10-5 , 第二階段P值= 7.32 × 10-4 , 整體P值= 7.75 × 10-8 ）。
本案發現HLA-B*38:02 及HLA-DRB1*08:03 具有獨立的致病效果，且在人類白血球表面抗原基因的相關信號是從兩個完全不同的基因型鑒定平台所得到的相同結果。如第1圖所示，在由單核苷酸多型性標記所得到的第一組信號（可由 rs17193122、rs140833037 或 rs34531986代表）係與HLA-B*38:02 有連鎖不平衡，而且其相關信號在回歸分析中如果已經帶有HLA-B*38:02項目的話就會消失，代表此一組單核苷酸多型性標記得到的相關信號與HLA-B*38:02是同一個信號。同樣的，第二組單核苷酸多型性標記信號（可由 rs116869525、rs117921525 或 rs117968912代表）則與HLA-DRB1*08:03是同一信號。
本發明所提供之所有單核苷酸多型性(SNPs)之rsID，其序列及所含單核苷酸變異之位置及其變異之鹼基係於本發明申請前已公開於美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)之單核苷酸多型性資料庫(SNP database，dbSNP)中。
更進一步分析，雖然HLA-B*38:02 及HLA-DRB1*08:03 有時會同時出現在延伸性的人類白血球表面抗原基因連鎖不平衡區塊上，但是本發明根據三點證據可以證明此二對偶基因代表兩個獨立相關信號。首先，參考第1圖，根據無顆粒性白血球症患者及葛瑞夫茲氏病患對照組的連鎖不平衡區塊的分析，明顯可以看到這兩個對偶基因是在不同的連鎖不平衡區塊；第二，根據回歸分析模型，這兩個對偶基因型顯現獨立效果；第三，在帶有HLA-B*38:02 的個案中（在無顆粒性白血球症患者中有25人，而在葛瑞夫茲氏病患對照組中有77人），帶有HLA-DRB1*08:03 的比例還是在無顆粒性白血球症患者比在葛瑞夫茲氏病患對照組中為高。
另一方面，本案發現HLA-B*38:02 及HLA-DRB1*08:03 具有主要致病效果。就HLA-B*38:02 而言，在無顆粒性白血球症患者中有 59.52% 帶有此對偶基因，而在葛瑞夫茲氏病患對照組中只有 6.41% 帶有此對偶基因，計算出來的疾病風險勝算比為21.48（P值 = 6.28 × 10-18 ，95％信賴區間為11.13~41.48）。就HLA-DRB1*08:03 而言，在無顆粒性白血球症患者有 52.38% 帶有此對偶基因，而在葛瑞夫茲氏病患對照組中只有 15.22% 帶有此對偶基因，計算出來的疾病風險勝算比是6.13（P值 = 1.35 × 10-8 ，95％信賴區間為3.28~11.46）。就同時分析HLA-B*38:02 及HLA-DRB1*08:03 而言，在無顆粒性白血球症患者有 38.10% 同時帶有此二對偶基因，而在葛瑞夫茲氏病患對照組中只有 1.26% 同時帶有此對偶基因，計算出來的疾病風險勝算比是48.41（P值 = 3.32 × 10-21 ，95％信賴區間為21.66~108.22）。根據本案資料所建構出的邏輯斯回歸（logistic regression）模型如下：logit(π) = -4.4936 + 2.6382 × HLA-B*38:02 + 1.2857 × HLA-DRB1*08:03，其中兩對偶基因都是根據加成性（additive）模型，其中π代表無顆粒型白血球症的可能性。根據此模型，則在接收器運作指標（receiver operating characteristic，ROC）曲線的曲線下面積為 81.22%。
實施例四　資料分析
本案使用PLINK版本1.07軟體並使用多維尺度（MDS）及GCTA主成分分析（PCA）來獲得 969 個案的人口結構。使用MDS和PCA將所有969個樣本（42位抗甲狀腺藥物導致的無顆粒性白血球症病患和927位對照組病患）和國際HapMap計劃中的281個亞洲參照樣本一起進行分析，並沒有發現異常值。基因組膨脹因子（λ）的數值為1.01，這說明群體分層的效果在本發明研究樣本中可以忽略不計。質量控制後，所有的GWA分析是由抗甲狀腺藥物導致無顆粒性白血球症病患和對照組病患使用五個單點方法之間的比較其對偶基因/基因型之頻率：基因型、對偶基因型、Cochran-Armitage趨勢測試並考慮疊加效應或有效對偶基因攜帶者。以Bonferroni對SNP的數目（522,980）校正後的全基因體顯著性閾值的P值設定為9.56×10-8。由於對照組的數量龐大，每個抗甲狀腺藥物導致無顆粒性白血球症個案依其年齡和性別隨機匹配10位對照組病患作配對分析。潛在的遺傳異質性調整透過MDS和GCTA確定的前兩個或前十個主成分作統整。逐步進行的多元回歸分析的方式，並使用SAS / STAT 9.3版作Cochran-Mantel-Haenszel測試。概似比測試中以P值 0.05 作為進入或排除標準用於逐步回歸分析。如第3圖所示，分析用以評估邏輯斯回歸模型預測表型的能力，並產生一個組合數據集來鑑別實驗組與對照組的接收器運作指標(receiver-operating characteristic，ROC)曲線，計算曲線下的面積。用Haploview4.2版進行LD評估，曼哈頓和分位-分位圖由R package製作。該實驗模型的敏感度、特異性、正面以及負面預測值分別為61.09% (95%信賴區間：45.64~76.42)、92.13% (95%信賴區間: 90.46~93.60)、21.67% (95%信賴區間：14.67~30.11)以及98.57% (95%信賴區間: 97.68~99.18)。
實施例五 HLA推算(imputation) 和關聯分析
本案係採用HLA推算法將HLA區域由全基因體相關研究( Genome-Wide Association Study，GWAS)獨立辨識出來驗證HLA基因型。使用SNP2HLA軟體將亞洲基準（530個亞洲人）高密度SNP基因型和4位數的典型HLA對偶基因和相應的胺基酸多態性推算典型HLA對偶基因。選取位於寬的MHC區域（染色體6：29-35Mb）的SNP基因型推算出兩位數典型對偶基因、四位數典型對偶基因和8個第I類和第II類HLA基因的胺基酸多態性（HLA-A ，HLA-B，HLA-C，HLA-DRB1，HLA-DQA1，HLA-DQB1，HLA-DPA1和HLA-DPB1）。PLINK用於執行與HLA-推算的關聯分析。
實施例六　三維模型建立
為了進一步探討人類白血球表面抗原基因蛋白和硫代醯胺類藥物的交互作用機轉，本發明進行了三維結構模式的建立 。
HLA-B * 38：02和HLA-B * 38：01蛋白質的三維結構係使用2BCK，3AM8，1S7Q，4NT6和1I4F的PDB登錄之ID作為模板而由I-TASSER 4.2進行建模。HLA-DRA / DRB1 * 08：03的結構是由MODELLER 9v9基於HLA-DR1（1AQD的PDB登錄號）的結構構成。蛋白質滴定殘基的質子化狀態以PROPKA在pH7.4確定，氫原子以PDB2PQR 1.9添加。硫代醯胺藥物分子，甲硫咪唑和丙硫氧嘧啶的初始構造，分別從蛋白質數據庫的MMZ和3CJ的配體ID衍生出。MarvinSketch 5.1.3被用於在pH7.4下預測質子化狀態以及加入藥物分子內的氫原子。使用Gaussian03和6-31G基本設定於哈特里 - 福克（HF）級進行量子化學計算，約束靜電電位則用來確定原子電荷。使用AutoDock448進行分子dockings與重新標定的打分函數（AutoDock4RRP）。以18.75×43.5×18.75Å3網格框大小設定為包含該蛋白質的整個結合溝，並且不包含胜肽，以允許藥物分子探索所有可能的結合位點。參考第4圖所示，其為硫代醯胺類藥物與人類白血球表面抗原之蛋白質-配體互動關係。其中(a)為甲硫咪唑與HLA-B*38:02之互動關係； (b)為丙硫氧嘧啶與HLA-B*38:02之互動關係；(c)為甲硫咪唑與HLA-B*38:01之互動關係；(d)為丙硫氧嘧啶與HLA-B*38:01之互動關係； (e)為甲硫咪唑與HLA-DRA/DRB1*08:03之互動關係；(f)為丙硫氧嘧啶與HLA-DRA/DRB1*08:03 複合體之互動關係。結合親和力預測係介於 -4.48 kcal/mol 與 -6.36 kcal/mol 之間。
參考第5圖所示，其為人類白血球表面抗原及其次­口袋(Sub-pockets)結構之表面示意圖。其中(a)為HLA-B*38:02，其口袋(pocket)結構位置係依胜肽-HLA-B*15:01複合物之結晶結構決定。HLA-B*38:01的次口袋(sub-pocket)結構區域亦位於相似區域。(b)為HLA-DRA/DRB1*08:03，其口袋結構位置係依胜肽-HLA-DR1複合物之結晶結構決定。
對接結果發現口袋F(pocket F)結構對藥物結合最有利，結合親和性估計介於-4.48和-6.36千卡/莫耳之間。為了進一步證實該藥物分子的結合態，以Amberer與AMBER parm99SB對蛋白質進行2納秒分子動力學模擬，分子圖形是由PyMOL的1.3和UCSF嵌合1.6.1製成。
由這些結合交互作用的模式，本案發現 HLA-B*38:02 蛋白的口袋B(pocket B)結構以及口袋F(pocket F)結構是重要的。而HLA-B*38:02的半胱胺酸 67(Cys67)、天冬醯胺 77(Asn77)、蘇胺酸 80(Thr80)及酪胺酸 123(Tyr123)也會影響結合。而HLA-DRA/DRB1*08:03的天冬醯胺 α69(Asnα69)、精胺酸 α76(Argα76)、 酪胺酸 β37(Tyrβ37)及絲胺酸 β57(Serβ57)也會影響結合的結構與穩定。
實施例七　藥物不良反應風險評估裝置
本發明另一方面提供一種藥物不良反應風險評估裝置，該裝置包括能夠偵測HLA-B*38:02 或HLA-DRB1*08:03 對偶基因之探針。此處所述之「探針」係指任何可用於探測其他物質之物。於一較佳實施例中，該探針為可與HLA-B*38:02 或HLA-DRB1*08:03 對偶基因中特定區域進行專一性結合之寡核苷酸片段或複合寡核苷酸片段。於一較佳實施例中，該寡核苷酸片段係與一發色基團或含有配體之分子(如抗原)形成共價鍵結，其針對一受器分子具有專一性之高親和力(如抗體對抗原之專一性)。於另一較佳實施例中，該探針為一聚合酶鏈鎖反應引子，與另一引子共同用於增幅該對偶基因內部的特定區域。於一較佳實施例中，該裝置可選擇性地包含一參照探針，該參照探針係針對一內部對照之對偶基因，其可為任一普遍存在之對偶基因，例如甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)、肌動蛋白等。該參照探針之設計係為了確認該裝置之效能。於一更佳實施例中，該裝置可進一步包含其他工具或試劑，用以收集病患之生物檢體，以及製備該生物檢體之基因體DNA、cDNA、RNA或蛋白質。
以上所提僅是本案的較佳實施例態樣，並不是用於限定本案的實施範圍；任何在此領域具有通常知識者，在不脫離本案的精神與範圍下所作的諸般變化與修飾，都不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
無
第1圖為本發明人類白血球表面抗原基因的相關信號以及連鎖不平衡區塊分析。
第2圖為本發明全基因體掃描所得之相關性結果。
第3圖為區分無顆粒性白血球症患者(n=42)與葛瑞夫茲氏病患者(n=927)的接收器運作指標(receiver-operating characteristic，ROC)曲線。
第4圖為硫代醯胺類藥物與人類白血球表面抗原之蛋白質-配體互動關係圖。
第5圖為人類白血球表面抗原及其次­口袋(Sub-pocket)結構之表面示意圖。

Claims (20)

  1. 一種評估患者針對一抗甲狀腺藥物發展出一藥物不良反應風險之方法，該方法包括： 自一患者取得一生物檢體；以及 偵測該生物檢體中是否存在與該藥物不良反應相關之HLA-B*38:02對偶基因或HLA-DRB1*08:03對偶基因，若該HLA-B*38:02對偶基因或該HLA-DRB1*08:03對偶基因任一者為存在，即判定該患者具有針對該抗甲狀腺藥物發展出該藥物不良反應之風險，其中該藥物不良反應為無顆粒性白血球症。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中偵測該HLA-B*38:02對偶基因係包含偵測該HLA-B*38:02對偶基因之一等效基因標記。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中偵測該HLA-DRB1*08:03對偶基因係包含偵測該HLA-DRB1*08:03對偶基因之一等效基因標記。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該HLA-B*38:02對偶基因之存在係以單核苷酸多型性標記rs17193122、rs140833037 或rs34531986為代表。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該HLA-DRB1*08:03對偶基因之存在係以單核苷酸多型性標記rs116869525、rs117921525 或rs117968912為代表。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，若該HLA-B*38:02對偶基因為存在，即表示該患者發展出該藥物不良反應之風險相較不具該對偶基因者之勝算比(odds ratio)大於20。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，若該HLA-DRB1*08:03對偶基因為存在，即表示該患者發展出該藥物不良反應之風險相較不具該對偶基因者之勝算比(odds ratio)大於6。。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，若該HLA-B*38:02對偶基因及該HLA-DRB1*08:03對偶基因皆存在，即表示該患者發展出該藥物不良反應之風險相較不具該二對偶基因者之勝算比(odds ratio)大於48。
  9. 如申請專利範圍第1至8項任一項所述之方法，其中該抗甲狀腺藥物係為一硫代醯胺(thionamide)類藥物。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該硫代醯胺類藥物係選自由甲硫咪唑(methimazole)、卡比馬唑(carbimazole)及丙硫氧嘧啶(propylthiouracil)所組成之群。
  11. 如申請專利範圍第1至8項任一項所述之方法，其中該生物檢體為核酸。
  12. 如申請專利範圍第1至8項任一項所述之方法，其中該生物檢體為基因組DNA。
  13. 如申請專利範圍第1至8項任一項所述之方法，其中該生物檢體係選自由血液、尿液、唾液及毛髮所組成之群。
  14. 如申請專利範圍第1至8項任一項所述之方法，其中該患者為亞洲人。
  15. 如申請專利範圍第1至8項任一項所述之方法，其中該患者為華人。
  16. 如申請專利範圍第2至3項任一項所述之方法，其中該等效基因標記係選自由限制性片段長度多態性、微衛星標記及單核苷酸多型性標記所組成之群。
  17. 一種用以執行如申請專利範圍第1項所述評估方法之裝置，該裝置包含至少ㄧ探針，該探針可偵測該HLA-B*38:02對偶基因或該HLA-DRB1*08:03對偶基因。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之裝置，其中該探針可偵測該HLA-B*38:02對偶基因或該HLA-DRB1*08:03對偶基因之一等效基因標記。
  19. 如申請專利範圍第17項所述之裝置，其中該探針可偵測單核苷酸多型性標記rs17193122、rs140833037、rs34531986、rs116869525、rs117921525 或 rs117968912。
  20. 如申請專利範圍第17~19項任一項所述之裝置，其中該探針包含一寡核苷酸，該寡核苷酸係專一性地與該HLA-B*38:02對偶基因或該HLA-DRB1*08:03對偶基因相結合。
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