CN105886609B - 药物不良反应风险评估方法及其装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物不良反应风险评估方法及其装置。本发明透过侦测病患是否带有与抗甲状腺药物所引发的无颗粒性白血球症相关的等位基因，以评估该病患发展出药物不良反应的风险。具体而言，本发明提供一种评估患者针对抗甲状腺药物发展出药物不良反应风险的方法，该方法包括：自患者取得生物检体；以及侦测该生物检体中是否存在与该药物不良反应相关的HLA‑B*38:02等位基因或HLA‑DRB1*08:03等位基因，若存在该HLA‑B*38:02等位基因或该HLA‑DRB1*08:03等位基因中的任意一种，即判定该患者具有针对该抗甲状腺药物发展出该药物不良反应的风险，其中该药物不良反应为无颗粒性白血球症。

Description

药物不良反应风险评估方法及其装置

【技术领域】

本发明涉及药物不良反应风险评估方法及其装置。

【现有技术】

葛瑞夫兹氏病(Graves’Disease，简称GD，人类门德尔遗传编号27500)是甲状腺机能亢进的最主要原因，临床表现包括弥漫性甲状腺肿大、甲状腺功能过高、抗甲状腺抗体、眼病变以及皮肤病变。该疾病的盛行率高达1.0％至1.6％，且女性比男性更常见。抗甲状腺药物(antithyroid drugs，简称ATD)包括甲硫咪唑(methimazole)、卡比马唑(carbimazole)及丙硫氧嘧啶(propylthiouracil)等，是属于硫代酰胺(thionamide)一类相对简单的分子，这些药物是全世界治疗葛瑞夫兹氏病以及甲状腺功能过高症的主要选择。

硫代酰胺类药物引发的无颗粒性白血球症(thionamide inducedagranulocytosis，简称TiA)，定义为当服用抗甲状腺药物期间发生绝对颗粒性白血球数量小于500每立方毫米，是抗甲状腺药物所引发最严重的药物不良反应，在接受这些药物的患者中约0.1％-0.37％可能发生。无颗粒性白血球症可能致命，且可以被许多种非化学治疗药物所引发。在最近一篇文献探讨所列举的十一种可能引发无颗粒性白血球症的药物中，抗甲状腺药物就占了其中的三种，而其他药物还包括clozapine、dapsone、dipyrone,、penicillin G、procainamide、rituximab、sulfasalazine及ticlopidine。

药物不良反应(Adverse Drug Reaction，简称ADR)为一种非预设且不希望发生的药物反应，其可以大致分为几种类型，包括A型(剂量相关的，增强型)和B型(非剂量相关的，奇异型)，并且具有不同的遗传倾向。抗甲状腺药物所引发的无颗粒性白血球症属于B型。根据药物遗传学的研究显示，侦测患者体内药物不良反应相关的等位基因有助于评估患者是否有发展药物不良反应的风险，而人类白血球表面抗原(HLA)基因已被证明与许多药物不良反应相关，包括carbamazepine引发的Stevens-Johnson症候群(HLA-B*15:02及HLA-A*31:01)、abacavir引发的过度敏感症候群(HLA-B*57:01)，以及lapatinib引发的肝脏伤害(HLA-DQA1*02:01)等。非人类白血球表面抗原基因也可能经由各种药代动力学以及药效学机转而引发各式药物不良反应。整体而言，有关药物引起无颗粒性白血球症的药物基因体学研究仍然相当不足，而且往往没有确定结论，因此，找出抗甲状腺药物引发无颗粒性白血球症的致病基因，实属极为重要的议题。

【发明内容】

就本案的一方面而言，本案提出一种评估患者针对抗甲状腺药物发展出药物不良反应风险的方法，包括自患者取得生物检体，以及侦测该生物检体中是否存在与该药物不良反应相关的HLA-B*38:02等位基因或HLA-DRB1*08:03等位基因，若存在该HLA-B*38:02等位基因或该HLA-DRB1*08:03等位基因中的任意一种，即判定该患者具有针对该抗甲状腺药物发展出该药物不良反应的风险，其中，该药物不良反应为无颗粒性白血球症。

根据上述构想，该等位基因的存在也可藉由侦测该等位基因的等效基因标记来判定。由于接近所需HLA等位基因的基因标记与该等位基因易于共同分离或呈现连锁不平衡状态，因此，此等效基因标记为所需等位基因是否存在的指标，进而可代表患者是否具有发展药物不良反应的风险。

前述等效基因标记可为任何型式，包括但不限于：限制性片段长度多态性(RFLP)、微卫星标记与单核苷酸多型性(SNP)标记。等效基因标记可采用上述的方法或习知相关方法进行检测。

于本案所提出的药物不良反应风险评估方法中，侦测该HLA-B*38:02等位基因系包含侦测该HLA-B*38:02等位基因的一种等效基因标记；其中侦测该HLA-DRB1*08:03等位基因包含侦测该HLA-DRB1*08:03等位基因的一种等效基因标记。

根据上述构想，其中该等效基因标记选自：限制性片段长度多态性、微卫星标记、单一核苷酸多型性标记及其任意组合。

根据上述构想，其中该HLA-B*38:02等位基因的存在以单核苷酸多型性标记rs17193122、rs140833037或rs34531986为代表，其中该HLA-DRB1*08:03等位基因的存在以单核苷酸多型性标记rs116869525、rs117921525或rs117968912为代表。

于本案所提出的药物不良反应风险评估方法中，若该HLA-B*38:02等位基因为存在，即表示该患者发展出该药物不良反应的风险相较不具该等位基因者的胜算比(oddsratio)大于20；若该HLA-DRB1*08:03等位基因为存在，即表示该患者发展出该药物不良反应的风险相较不具该等位基因者的胜算比(odds ratio)大于6；若该HLA-B*38:02等位基因及该HLA-DRB1*08:03等位基因皆存在，即表示该患者发展出该药物不良反应的风险相较不具该二等位基因者的胜算比(odds ratio)大于48。

于本案所提出的药物不良反应风险评估方法中，其中该抗甲状腺药物为一硫代酰胺(thionamide)类药物。于一较佳实施例中，该硫代酰胺类药物选自：甲硫咪唑(methimazole)、卡比马唑(carbimazole)、丙硫氧嘧啶(propylthiouracil)及其任意组合。

于本案所提出的药物不良反应风险评估方法中，该生物检体为核酸。于一较佳实施例中，该生物检体为基因组DNA。于另一较佳实施例中，该生物检体选自：血液、尿液、唾液、毛发及其任意组合。

于本案所提出的药物不良反应风险评估方法中，该患者为亚洲人。于一较佳实施例中，该患者为华人。

就本案的另一方面而言，本案提出一种药物不良反应风险评估装置，该装置包含至少一探针，该探针可侦测该HLA-B*38:02等位基因或该HLA-DRB1*08:03等位基因。于一较佳实施例中，所述装置包括可侦测该HLA-B*38:02等位基因的探针和可侦测该HLA-DRB1*08:03等位基因的探针。于一较佳实施例中，该探针可侦测该HLA-B*38:02等位基因或该HLA-DRB1*08:03等位基因的一种等效基因标记。于另一较佳实施例中，该探针可侦测单核苷酸多型性标记rs17193122、rs140833037、rs34531986、rs116869525、rs117921525或rs117968912。

根据上述构想，该探针包含一寡核苷酸，该寡核苷酸特异性与该HLA-B*38:02等位基因或该HLA-DRB1*08:03等位基因相结合。

本案还包括可侦测该HLA-B*38:02等位基因的探针和/或可侦测该HLA-DRB1*08:03等位基因的探针在制备评估患者针对抗甲状腺药物发展出药物不良反应风险的试剂或本文所述装置(如试剂盒)中的用途。

本案得藉由以下图式与实施方式说明而更易于让在此领域具有通常知识者了解本案的精神。

【附图说明】

图1为本发明人类白血球表面抗原基因的相关信号以及连锁不平衡区块分析。

图2为本发明全基因体扫描所得的相关性结果。

图3为区分无颗粒性白血球症患者(n＝42)与葛瑞夫兹氏病患者(n＝927)的接收器运作指标(receiver-operating characteristic，ROC)曲线。

图4为硫代酰胺类药物与人类白血球表面抗原的蛋白质-配体互动关系图。

图5A和5B分别为人类白血球表面抗原及其次-口袋(Sub-pocket)结构的表面示意图。

【具体实施方式】

本案“药物不良反应风险评估方法及其装置”将可透过以下的实施例说明而让在此领域具有通常知识者了解其创作精神，并可据以实施。然本案的实施并非由下列实施例而限制其实施型态。

实施例一 研究对象的选定

葛瑞夫兹氏病是依据临床上是否出现甲状腺功能亢进，加上甲状腺眼疾或是弥漫性甲状腺肿大，并加上血清检验出自体抗体作为判断。抗甲状腺药物导致的无颗粒性白血球症，其诊断方式由最初对病患的询问调查到利用病历资料搜寻。病患如果同时接受化疗、clozapine、dapsone、dipyrone、penicillin G、procainamide、sulfasalazine或ticlopidine等药物的治疗则被排除。虽然抗甲状腺药物导致的无颗粒性白血球症一般定义为在使用thionamide类的药物造成绝对颗粒性白血球数量小于500每立方毫米，本研究病患都是在发生感染症的情况下被发现而非只是单纯验血得知。患者都有发烧喉咙痛等症状并可能有皮肤红疹而住院治疗，无颗粒性白血球症大约在使用抗甲状腺药物后三个月内出现。

本案共收入21位病患进入第一阶段研究作基因型鉴定。以患有无颗粒性白血球症的葛瑞夫兹氏病患为病例组，而第一阶段研究的对照组则为497位无亲属关系的葛瑞夫兹氏病患和165位从葛瑞夫兹氏病家族中挑选出来的葛瑞夫兹氏病患者成员(一个家族只纳入一位病患)。第一阶段研究出现正面迹象后再额外加入21名抗甲状腺药物导致无颗粒性白血球症病患作为病例组而进入第二阶段研究，另再纳入共546位无亲属关系的葛瑞夫兹氏病患做为对照组。采用QUANTO软件来计算，并以不同的次要等位基因频率(Minor AlleleFrequency，MAF)及胜算比(Odds Ratio，OR)作计算，本案带有的样本数量对于侦测重要基因变异具统计效力。

实施例二 直接人类白血球表面抗原(HLA)基因型鉴定

直接侦测HLA基因型或是其内部的特殊区域可用来判定一基因标记是否存在。从患者体内取得检体并制备其基因体DNA来测定一等位基因的存在已属习知技术，例如美国Gentra Systems公司所生产的PUREGENE DNA纯化系统，其系用以测定指定基因标记内一段区域上的核苷酸。测定特定区域的方法亦为习知技术，例如序列特异性寡核苷酸(SequenceSpecific Oligonucleotide，SSO)杂交试验、实时聚合酶链式反应(real-time PCR)，或是经结合的序列特异性寡核苷酸-酵素连结免疫吸附试验等。

由聚合酶链式反应取得的DNA产物可用序列特异性探针来侦测，如：TaqMan、Beacon、Scorpions的水解性探针或是杂交探针。这些探针被设计成可与指定区域结合。该聚合酶链式反应产物可藉由DNA黏合物，如Green来侦测。

本发明中使用四种HLA基因型鉴定方法，包括：(1)Dynal RELI SSO基因型鉴定套组(Dynal公司生物技术有限公司，现为Life Technologies公司所有)；(2)Gold SSP HLA-DPB1高分辨率套组(Invitrogen公司，现为Life Technologies所有；(3)LABType SSO套组(One lambda公司)；和(4)SeCore HLA基因型鉴定套组(Life Technologies公司)。前三种方法被应用到第一阶段21位无颗粒性白血球症病例组的其中2名和所有的662位对照组，第四种方法(SeCore HLA基因型鉴定试剂)则用在所有的42位无颗粒性白血球症病例组(包括第一和第二阶段)和546位第二阶段的对照组。除了有2位无颗粒性白血球症病患接受了一个以上的基因型鉴定方法分析之外，本案还随机选择24个第一阶段的对照组也使用SeCoreHLA的基因型鉴定，以确保不同方法下所得到的基因型鉴定结果是一致的。

Dynal RELI SSO基因型鉴定系依据制造商的说明进行。简要地说，使用特定基因座引子的聚合酶链式反应(PCR)，分别用于扩增第一类(HLA-A，-B和-C)基因的外显子2和外显子3或是第二类(-DQB1和-DRB1)基因的外显子2。随后将PCR产物和预先以线性数组固定在尼龙膜的序列特异性寡核苷酸(SSO)探针进行杂交(HLA-A：48个探针，-B：61个探针，-C：37个探针，-DQB1：41个探针和-DRB1：60个探针)。最后使用模式匹配程序解译基因型。

由于Dynal公司RELI SSO系统缺乏DPB1基因型鉴定套组，故本案使用制造商建议的“Gold SSP HLA-DPB1高分辨率组”序列特异性引物(SSP)的扩增方法来分析HLA-DPB1。简单地说，对每个DNA样本进行48PCR反应，经PCR扩增和电泳后，阳性扩增的型态用UniMatch软件(Invitrogen公司)来分析HLA-DPB1基因型。

LABType SSO的基因型鉴定系根据制造商的方案进行。简言之，将PCR产物结合到荧光编码的微球探针(HLA-A：58/61/63个探针，-B：100个探针，-C：56个探针，-DPB1：40个探针，-DQB1：37个探针和-DRB1：70个探针)。接着用流式分析器来确定每个微球体的荧光强度(LABType视觉软件；One lambda公司)，最后根据反应型态确认HLA基因型。

SeCore HLA基因型鉴定如下进行。根据制造商的说明使用SeCore HLA基因型鉴定套组(Life Technologies公司)决定HLA-A，HLA-B，HLA-C和HLA-DPB1上外显子2，外显子3和外显子4的基因多型性，HLA-DRB1外显子2的基因多型性，和HLA-DQB1外显子2和外显子3的基因多型性。简单地说，经过基因座特异性聚合酶链式反应扩增，将PCR产物用核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶处理，以除去过量的dNTP和引子。每个外显子的测序反应使用Big Dyeterminator v1.1循环测序套组双向进行，用ABI 3730自动测序仪(应用生物系统公司)进行测序。等位基因的指定由选定的序列与IMGT/HLA数据库的已知等位基因序列的所有组合以uTYPE序列分析软件(Life Technologies公司)进行比较。在出现基因型歧义的杂合个体的情况下，即几个不同基因型组合却产生相同的测序结果，等位基因的指定依照台湾人口中最常见的情况。

此外，测定等位基因的存在亦可藉由使用由生物检体(如：血液、唾液、尿液，或毛发)制备的基因组DNA来直接测定该基因内的区域或核苷酸。该等位基因亦可利用如血清学或微细胞毒性方法测定，亦可藉由检测等位基因的等效基因标记(equivalent geneticmarker)来测定，例如：单核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)、微卫星标记(microsatellite marker)，或任何种类的基因多样性标记。

本案由6个人类白血球表面抗原基因(HLA-A,-B,-C,-DPB1,-DQB1及-DRB1)直接基因型鉴定的数据进行分析，在第一阶段的研究中(21位无颗粒性白血球症病患以及662位葛瑞夫兹氏病患对照组)，本案发现两个显著的相关信号，分别是在HLA-B*38:02(P值＝1.59×10^-9)以及HLA-DRB1*08:03(P值＝1.24×10^-5)。而第二阶段研究(21位无颗粒性白血球症病患以及546位葛瑞夫兹氏病患对照组)则重现了第一阶段研究的相关信号：HLA-B*38:02(P值＝1.59×10^-27)及HLA-DRB1*08:03(P值＝3.91×10^-5)。两阶段合并分析(42位无颗粒性白血球症病患以及1208位葛瑞夫兹氏病患对照组)可以看到更强的相关信号：HLA-B*38:02(P值＝6.75×10^-32)及HLA-DRB1*08:03(P值＝1.83×10-⁹)，详如下表一所示。

表一、第一阶段、第二阶段及整体的相关性研究结果

Chr.：染色体；RAF：高危险等位基因频率；OR：胜算比；CI：信赖区间。

^a物埋位置依NCBI build 37.1进行标志。

^b胜算比以等位基因相关性测试计算。

^cP值利用Cochran-Armitage趋势检定计算。

HLA-B*38:02等位基因型频率在无颗粒性白血球症患者为29.8％，远高于葛瑞夫兹氏病患对照组的3.3％以及一般台湾人族群的3.3％。HLA-DRB1*08:03等位基因型频率在无颗粒性白血球症患者为28.6％，远高于葛瑞夫兹氏病对照组的8.4％以及一般台湾人族群的8.6％。带有HLA-B*38:02或HLA-DRB1*08:03而发生无颗粒性白血球症的风险对比起不带这等位基因型的人的胜算比(odds ratio)分别是21.48(95％信赖区间为11.13～41.48)及6.13(95％信赖区间为3.28～11.46)。同时带有此两种等位基因型的个案对比起不带这等位基因型的人的胜算比更高达48.41(P值＝3.32×10^-21，95％信赖区间为21.66～108.22)。

参考图1所示，上方图示X轴代表染色体的区域，左侧Y轴代表全基因体相关研究所得的–log₁₀P值。点的颜色显示rs17193122或rs116869525与其位于4Mb区域内相邻的单核苷酸多型性标记之间的连锁不平衡，其中rs17193122系与30～32Mb单核苷酸多型性标记比较，rs116869525系与32～34Mb单核苷酸多型性标记比较。虚线表示统计上有意义的门坎值(9.56x 10^-8)。右侧Y轴显示单核苷酸多型性标记的重组率，其以1000基因组计划的亚洲祖系族群数据进行计算。图1下方图标为依据相关区域的r²值所绘的连锁不平衡图谱，该数据系以本发明的969个样本进行基因型鉴定而得。本图谱系使用Haploview软件4.2版描绘，且r²(x100)值记载于方块图形中。由此可知这两个等位基因并非出于同一个连锁不平衡区域(linkage disequilibrium block)中。

本案另发现HLA-A*02:03、HLA-C*07:02及HLA-DQB1*06:01也带有和无颗粒性白血球症的显著相关信号(P值＝4.22×10^-8，4.09×10^-6及1.29×10^-6)。根据本案的资料分析这几个等位基因分别和HLA-B*38:02或HLA-DRB1*08:03具有连锁不平衡的情形，因此并非独立相关信号。

实施例三 全基因体SNP基因型鉴定

全基因体基因型鉴定的分析使用具有642,832个单核苷酸多型性(SNP)标记的Affymetrix Axiom全基因体CHB 1数组板(博奥生物有限公司)进行。由Axiom GT1演算全基因体基因型，然后针对个人和SNP进行系统的质量控制，其方式为移除漏失样本大于1％的SNP、并非体染色体(autosomal)、次要等位基因频率(MAF)小于1％或是对照组有表现出哈迪-温伯格平衡显著偏差(P值小于1×10^-5)者。本案删除了病患和对照组中基因型callrates有显著差异(P值小于1×10^-6)者。样本过滤上生成的基因型数组小于95％的位点被排除在外。杂合率计算，偏差超过6个标准偏差的也被排除在外。X染色体SNP的杂合被用来验证样本来源的性别，没有出现性别不匹配。PLINK版本1.07软件被用来识别基因是否从同一个体(或同卵双胞胎)或是一、二、三等亲属而来。这些判断是基于从身份血统状态发现隐藏关联的证据。筛选后，本案总共在42位抗甲状腺药物导致的无颗粒性白血球症病患和927位葛瑞夫兹氏病患对照组个案中保留了522,980个单核苷酸多型性(SNP)标记。

利用Affymetrix Axiom全基因体CHB 1数组板(在体染色体共522,980个质量可靠的单核苷酸多型性标记)进行研究显示许多处相关信号。参考表1、图1及图2所示，其中图2系以Manhattan plot显示以Cochran-Armitage Test分析522,980个单核苷酸多型性标记的趋势，所得的全基因体P值(-log₁₀P值)。该分析系来自于42位无颗粒性白血球症患者以及927位葛瑞夫兹氏病患对照组。同一染色体上的单核苷酸多型性标记以同颜色标示。其中该横线的P值等于9.56×10^-8，系作为本发明全基因体统计上有意义的门坎值。

经过分析比对，本发明确认在人类白血球表面抗原基因区域有两组彼此独立的相关信号，且每一组都个别有许多单核苷酸多型性标记，其中第一组信号可用rs17193122作为代表(第一阶段P值＝8.18×10^-8，第二阶段P值＝1.15×10^-24，整体P值＝4.29×10^-27)。第二组信号可用rs116869525作为代表(第一阶段P值＝3.88×10^-5,第二阶段P值＝8.24×10^-5,整体P值＝1.27×10^-8)。本案亦发现一组人类白血球表面抗原区域以外的另一相关信号，位于染色体3q13，可用rs56343172作为代表(第一阶段P值＝1.71×10^-5,第二阶段P值＝7.32×10^-4,整体P值＝7.75×10^-8)。

本案发现HLA-B*38:02及HLA-DRB1*08:03具有独立的致病效果，且在人类白血球表面抗原基因的相关信号是从两个完全不同的基因型鉴定平台所得到的相同结果。如图1所示，在由单核苷酸多型性标记所得到的第一组信号(可由rs17193122、rs140833037或rs34531986代表)系与HLA-B*38:02有连锁不平衡，而且其相关信号在回归分析中如果已经带有HLA-B*38:02项目的话就会消失，代表此一组单核苷酸多型性标记得到的相关信号与HLA-B*38:02是同一个信号。同样的，第二组单核苷酸多型性标记信号(可由rs116869525、rs117921525或rs117968912代表)则与HLA-DRB1*08:03是同一信号。

本发明所提供的所有单核苷酸多型性(SNPs)的rsID，其序列及所含单核苷酸变异的位置及其变异碱基系于本发明申请前已公开于美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的单核苷酸多型性数据库(SNPdatabase，dbSNP)中。

更进一步分析，虽然HLA-B*38:02及HLA-DRB1*08:03有时会同时出现在延伸性的人类白血球表面抗原基因连锁不平衡区块上，但是本发明根据三点证据可以证明此二等位基因代表两个独立相关信号。首先，参考图1，根据无颗粒性白血球症患者及葛瑞夫兹氏病患对照组的连锁不平衡区块的分析，明显可以看到这两个等位基因是在不同的连锁不平衡区块；第二，根据回归分析模型，这两个等位基因型显现独立效果；第三，在带有HLA-B*38:02的个案中(在无颗粒性白血球症患者中有25人，而在葛瑞夫兹氏病患对照组中有77人)，带有HLA-DRB1*08:03的比例还是在无颗粒性白血球症患者比在葛瑞夫兹氏病患对照组中为高。

另一方面，本案发现HLA-B*38:02及HLA-DRB1*08:03具有主要致病效果。就HLA-B*38:02而言，在无颗粒性白血球症患者中有59.52％带有此等位基因，而在葛瑞夫兹氏病患对照组中只有6.41％带有此等位基因，计算出来的疾病风险胜算比为21.48(P值＝6.28×10^-18，95％信赖区间为11.13～41.48)。就HLA-DRB1*08:03而言，在无颗粒性白血球症患者有52.38％带有此等位基因，而在葛瑞夫兹氏病患对照组中只有15.22％带有此等位基因，计算出来的疾病风险胜算比是6.13(P值＝1.35×10^-8，95％信赖区间为3.28～11.46)。就同时分析HLA-B*38:02及HLA-DRB1*08:03而言，在无颗粒性白血球症患者有38.10％同时带有此二等位基因，而在葛瑞夫兹氏病患对照组中只有1.26％同时带有此等位基因，计算出来的疾病风险胜算比是48.41(P值＝3.32×10^-21，95％信赖区间为21.66～108.22)。根据本案数据所建构出的逻辑斯回归(logistic regression)模型如下：logit(π)＝-4.4936+2.6382×HLA-B*38:02+1.2857×HLA-DRB1*08:03，其中两等位基因都是根据加成性(additive)模型，其中π代表无颗粒型白血球症的可能性。根据此模型，则在接收器运作指标(receiver operating characteristic，ROC)曲线的曲线下面积为81.22％。

实施例四 资料分析

本案使用PLINK版本1.07软件并使用多维尺度(MDS)及GCTA主成分分析(PCA)来获得969个案的人口结构。使用MDS和PCA将所有969个样本(42位抗甲状腺药物导致的无颗粒性白血球症病患和927位对照组病患)和国际HapMap计划中的281个亚洲参照样本一起进行分析，并没有发现异常值。基因组膨胀因子(λ)的数值为1.01，这说明群体分层的效果在本发明研究样本中可以忽略不计。质量控制后，所有的GWA分析是由抗甲状腺药物导致无颗粒性白血球症病患和对照组病患使用五个单点方法之间的比较其等位基因/基因型的频率：基因型、等位基因型、Cochran-Armitage趋势测试并考虑迭加效应或有效等位基因携带者。以Bonferroni对SNP的数目(522,980)校正后的全基因体显著性阈值的P值设定为9.56×10^-8。由于对照组的数量庞大，每个抗甲状腺药物导致无颗粒性白血球症个案依其年龄和性别随机匹配10位对照组病患作配对分析。潜在的遗传异质性调整透过MDS和GCTA确定的前两个或前十个主成分作统整。逐步进行的多元回归分析的方式，并使用SAS/STAT 9.3版作Cochran-Mantel-Haenszel测试。概似比测试中以P值0.05作为进入或排除标准用于逐步回归分析。如图3所示，分析用以评估逻辑斯回归模型预测表型的能力，并产生一个组合数据集来鉴别实验组与对照组的接收器运作指标(receiver-operating characteristic，ROC)曲线，计算曲线下的面积。用Haploview4.2版进行LD评估，曼哈顿和分位-分位图由Rpackage制作。该实验模型的敏感度、特异性、正面以及负面预测值分别为61.09％(95％信赖区间：45.64～76.42)、92.13％(95％信赖区间:90.46～93.60)、21.67％(95％信赖区间：14.67～30.11)以及98.57％(95％信赖区间:97.68～99.18)。

实施例五 HLA推算(imputation)和关联分析

本案系采用HLA推算法将HLA区域由全基因体相关研究(Genome-WideAssociation Study，GWAS)独立辨识出来验证HLA基因型。使用SNP2HLA软件将亚洲基准(530个亚洲人)高密度SNP基因型和4位数的典型HLA等位基因和相应的胺基酸多态性推算典型HLA等位基因。选取位于宽的MHC区域(染色体6：29-35Mb)的SNP基因型推算出两位数典型等位基因、四位数典型等位基因和8个第I类和第II类HLA基因的胺基酸多态性(HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DRB1，HLA-DQA1，HLA-DQB1，HLA-DPA1和HLA-DPB1)。PLINK用于执行与HLA-推算的关联分析。

实施例六 三维模型建立

为了进一步探讨人类白血球表面抗原基因蛋白和硫代酰胺类药物的交互作用机转，本发明进行了三维结构模式的建立。

HLA-B*38：02和HLA-B*38：01蛋白质的三维结构系使用2BCK，3AM8，1S7Q，4NT6和1I4F的PDB登录的ID作为模板而由I-TASSER 4.2进行建模。HLA-DRA/DRB1*08：03的结构是由MODELLER 9v9基于HLA-DR1(1AQD的PDB登录号)的结构构成。蛋白质滴定残基的质子化状态以PROPKA在pH7.4确定，氢原子以PDB2PQR 1.9添加。硫代酰胺药物分子，甲硫咪唑和丙硫氧嘧啶的初始构造，分别从蛋白质数据库的MMZ和3CJ的配体ID衍生出。MarvinSketch5.1.3被用于在pH7.4下预测质子化状态以及加入药物分子内的氢原子。使用Gaussian03和6-31G基本设定于哈特里-福克(HF)级进行量子化学计算，约束静电电位则用来确定原子电荷。使用AutoDock448进行分子dockings与重新标定的打分函数(AutoDock4RRP)。以

网格框大小设定为包含该蛋白质的整个结合沟，并且不包含多肽，以允许药物分子探索所有可能的结合位点。参考图4所示，其为硫代酰胺类药物与人类白血球表面抗原的蛋白质-配体互动关系。其中(a)为甲硫咪唑与HLA-B*38:02的互动关系；(b)为丙硫氧嘧啶与HLA-B*38:02的互动关系；(c)为甲硫咪唑与HLA-B*38:01的互动关系；(d)为丙硫氧嘧啶与HLA-B*38:01的互动关系；(e)为甲硫咪唑与HLA-DRA/DRB1*08:03的互动关系；(f)为丙硫氧嘧啶与HLA-DRA/DRB1*08:03复合体的互动关系。结合亲和力预测系介于-4.48kcal/mol与-6.36kcal/mol之间。

参考图5A和5B所示，其为人类白血球表面抗原及其次-口袋(Sub-pockets)结构的表面示意图。其中图5A为HLA-B*38:02，其口袋(pocket)结构位置系依多肽-HLA-B*15:01复合物的结晶结构决定。HLA-B*38:01的次口袋(sub-pocket)结构区域亦位于相似区域。图5B为HLA-DRA/DRB1*08:03，其口袋结构位置系依多肽-HLA-DR1复合物的结晶结构决定。

对接结果发现口袋F(pocket F)结构对药物结合最有利，结合亲和性估计介于-4.48和-6.36千卡/莫耳之间。为了进一步证实该药物分子的结合态，以Amberer与AMBERparm99SB对蛋白质进行2纳秒分子动力学仿真，分子图形是由PyMOL的1.3和UCSF嵌合1.6.1制成。

由这些结合交互作用的模式，本案发现HLA-B*38:02蛋白的口袋B(pocket B)结构以及口袋F(pocket F)结构是重要的。而HLA-B*38:02的半胱胺酸67(Cys67)、天冬酰胺77(Asn77)、苏胺酸80(Thr80)及酪胺酸123(Tyr123)也会影响结合。而HLA-DRA/DRB1*08:03的天冬酰胺α69(Asnα69)、精胺酸α76(Argα76)、酪胺酸β37(Tyrβ37)及丝胺酸β57(Serβ57)也会影响结合的结构与稳定。

实施例七 药物不良反应风险评估装置

本发明另一方面提供一种药物不良反应风险评估装置，该装置包括能够侦测HLA-B*38:02和/或HLA-DRB1*08:03等位基因的探针。此处所述的“探针”指任何可用于探测其他物质之物。于一较佳实施例中，该探针为可与HLA-B*38:02或HLA-DRB1*08:03等位基因中特定区域进行特异性结合的寡核苷酸片段或复合寡核苷酸片段。于一较佳实施例中，该寡核苷酸片段与一发色基团或含有配体的分子(如抗原)形成共价键结，其针对一受体分子具有特异性的高亲和力(如抗体对抗原的特异性)。于另一较佳实施例中，该探针为一聚合酶链式反应的引物，与另一引物共同用于扩增该等位基因内部的特定区域。于一较佳实施例中，该装置可选择性地包含一参照探针，该参照探针针对一内部对照的等位基因，其可为任一普遍存在的等位基因，例如甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)、肌动蛋白等。该参照探针的设计系为了确认该装置的效能。于一更佳实施例中，该装置可进一步包含其他工具或试剂，用以收集病患的生物检体，以及制备该生物检体的基因体DNA、cDNA、RNA或蛋白质。

以上所提仅是本案的较佳实施例，并不是用于限定本案的实施范围；任何在此领域具有通常知识者，在不脱离本案的精神与范围下所作的诸般变化与修饰，都不脱如附申请专利范围所欲保护者。

Claims (5)

1.可侦测HLA-B*38:02等位基因和/或可侦测HLA-DRB1*08:03等位基因的探针在制备评估患者针对抗甲状腺药物发展出药物不良反应风险的试剂或装置中的用途；

其中，该可侦测HLA-B*38:02等位基因的探针为可侦测单核苷酸多型性标记rs17193122、rs140833037或rs34531986的探针；

该可侦测HLA-DRB1*08:03等位基因的探针为可侦测单核苷酸多型性标记rs116869525、rs117921525或rs117968912的探针；

该抗甲状腺药物为硫代酰胺类药物；

该药物不良反应为无颗粒性白血球症。

2.如权利要求1所述的用途，若存在该HLA-B*38:02等位基因，即表示该患者发展出该药物不良反应的风险相较不具该等位基因者的胜算比为21.48。

3.如权利要求1所述的用途，若存在该HLA-DRB1*08:03等位基因，即表示该患者发展出该药物不良反应的风险相较不具该等位基因者的胜算比为6.13。

4.如权利要求1所述的用途，若同时存在该HLA-B*38:02等位基因及该HLA-DRB1*08:03等位基因，即表示该患者发展出该药物不良反应的风险相较不具该两种等位基因者的胜算比为48.41。

5.如权利要求1所述的用途，其中该硫代酰胺类药物选自：甲硫咪唑、卡比马唑、丙硫氧嘧啶及其任意组合。

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