CN115679003A - 用于预测药物疗效的组合物、系统及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于预测药物疗效的组合物、系统及用途。该组合物包括用于检测生物样本中核酸的以下SNP位点信息的试剂：rs67453154和rs79663242；选自rs214594、rs1207042、rs4712328和rs7740550组成的组中的至少之一的位点；选自rs7519753和rs12021785组成的组的至少之一的位点；选自rs12576054、rs34271604、rs35678303和rs11827974组成的组中的至少之一的位点和选自rs10808842、rs12550844和rs78775926组成的组中的至少之一的位点。本发明采用较大样本高通量的全基因组关联技术实现了对干扰素应答相关遗传标识的无偏移筛选，结果更加可靠，能够在干扰素治疗前预测干扰素应答和临床治疗效果，实现了对慢乙肝患者的个性化治疗。

Description

用于预测药物疗效的组合物、系统及用途

技术领域

本发明涉及分子生物领域，特别涉及治疗乙肝患者疗效的预测方法，具具体地涉及用于预测药物疗效的组合物、系统及用途。

背景技术

乙肝(以下称为慢性乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)持续感染引起的肝脏慢性炎症性疾病。据世界卫生组织估计，截止到2019年，全球约有3160万慢乙肝患者，每年约有55.5万死于相关肝病。慢性乙肝是重型乙型肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等疾病的重要病因，我国肝细胞癌85％以上都有慢性乙肝的背景，因此慢性乙肝仍然是严重危害我国人民健康的重要传染病之一。

目前临床上抗HBV一线药物主要有干扰素(Interferon，IFN)和核苷(酸)类似物(nucleoside/nucleotide analogues，NAs)。IFN主要通过激活JAK-STAT通路，诱导干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)表达，从而发挥抗病毒和免疫调节功能。目前临床用于慢性乙肝治疗的IFN主要是聚乙二醇修饰的长效干扰素α(PEG-IFNα)。研究表明，规范的抗病毒治疗可以有效抑制HBV病毒的复制，缓解肝脏疾病的进程，并有效减少肝硬化和肝癌的发生。

慢性乙肝理想的临床治疗终点是使患者达到HBsAg血清学阴转或血清学转换，实现“临床治愈”。然而，基于IFN和NAs及其组合的临床治疗策略均难以实现“临床治愈”。临床上用于预测慢性乙肝患者抗病毒应答效果的主要的检测指标是循环血中HBV DNA、RNA及相关抗原和血清ALT水平等生化指标和肝功指标的监测。但以上指标多用于治疗效果评价，目前仍亟需一种能够在治疗前预测患者个体对含干扰素等免疫调节药物治疗应答的方法。同时，部分患者在使用干扰素时会出现明显的副作用，预测评估手段的缺乏很可能会导致部分不适合干扰素治疗的患者被纳入治疗，从而遭受不必要的副作用。上述现状充分表明，目前对预测干扰素治疗慢性乙肝治疗应答并实现功能性治愈需要更准确的指标进行补充。运用临床队列研究、鉴定有效的遗传标识，是辅助现有临床诊断、指导临床干预的关键手段之一。

发明内容

为解决现有技术中的技术问题，本发明提供一种用于预测药物疗效的组合物、系统及用途，通过全基因组测序对临床阵列进行全面分析，通过全基因组关联分析和表达数量性状位点分析得到了一组与干扰素治疗下乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阴转相关的SNP位点。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于预测药物疗效的组合物，其包括用于检测生物样本中核酸的以下SNP位点信息的试剂：

(a)rs67453154和rs79663242；

(b)选自rs214594、rs1207042、rs4712328和rs7740550组成的组中的至少之一的位点；

(c)选自rs7519753和rs12021785组成的组的至少之一的位点；

(d)选自rs12576054、rs34271604、rs35678303和rs11827974组成的组中的至少之一的位点；和

(e)选自rs10808842、rs12550844和rs78775926组成的组中的至少之一的位点。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测药物疗效的组合物，其中，所述药物包括干扰素类和核苷(酸)类似物。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测药物疗效的组合物，其中，所述疗效包括药物对于乙型肝炎的治疗效果。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测药物疗效的组合物，其中，所述乙型肝炎包括慢性乙肝。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测药物疗效的组合物，其中，所述SNP通过以下方法中至少一种或它们的联合检测进行测定：聚合酶链反应PCR、毛细管电泳、质谱、单链构象多态性SSCP、电化学分析、变性HPLC及凝胶电泳、限制性片段长度多态性、单碱基延伸SBE、等位基因特异性引物延伸ASPE、限制酶消化、链置换扩增SDA、转录介导的扩增TMA、连接酶链反应LCR、基于核酸序列的扩增NASBA、引物延伸、滚环扩增RCA、自主序列复制3SR、环介导的等温扩增LAMP、核酸测序和微阵列；

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测药物疗效的组合物，其中，所述核酸测序选自由以下组成的组：Maxam-Gilbert测序、链终止方法、鸟枪测序、桥式PCR、单分子实时测序、离子半导体或离子流测序、合成测序、SOLiD测序、链终止或Sanger测序、大规模平行测序MPSS、聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、DNA纳米球测序、单分子实时测序、纳米孔DNA测序、隧穿电流DNA测序、杂交测序、质谱测序、微流体Sanger测序、基于显微镜的测序、RNAP测序和体外病毒高通量测序。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测药物疗效的组合物，其中，所述试剂包括引物、探针或基因测序试剂。

本发明的第二方面，提供根据第一方面所述的组合物在制备用于预测药物疗效的产品中的用途，其中，所述产品包括检测芯片、检测试剂盒或检测装置。

本发明的第三方面，提供一种用于预测药物疗效的系统，其包括：

数据获取单元，其用于获取受试者生物样本中的核酸的以下SNP位点信息；(a)rs67453154和rs79663242；(b)选自rs214594、rs1207042、rs4712328和rs7740550组成的组中的至少之一的位点；(c)选自rs7519753和rs12021785组成的组的至少之一的位点；(d)选自rs12576054、rs34271604、rs35678303和rs11827974组成的组中的至少之一的位点；和(e)选自rs10808842、rs12550844和rs78775926组成的组中的至少之一的位点；

数据处理单元，其用于将所述数据获取单元的数据输入预测模型并进行数据处理，其中所述预测模型由若干机器学习算法构建得到；

输出单元，其用于输出药物对于乙型肝炎的治疗效果。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测药物疗效的系统，其中，所述机器学习包括线性回归算法、逻辑回归算法、朴素贝叶斯算法、k-近邻算法、支持向量机算法、决策树算法、随机森林算法、k-平均算法、梯度增强算法。

本发明的第四方面，提供一种用于筛选化合物的方法，其包括将待测化合物施用至动物模型或细胞模型的步骤，其中，所述动物模型或细胞模型含有以下SNP位点：(a)rs67453154和rs79663242；(b)选自rs214594、rs1207042、rs4712328和rs7740550组成的组中的至少之一的位点；(c)选自rs7519753和rs12021785组成的组的至少之一的位点；(d)选自rs12576054、rs34271604、rs35678303和rs11827974组成的组中的至少之一的位点；和(e)选自rs10808842、rs12550844和rs78775926组成的组中的至少之一的位点。

本发明通过全基因组测序以及全基因组关联分析，在差异显著SNP中选取了若干差异显著性排名靠前的SNP位点，同时对这些位点的连锁不平衡进行了研究。此外，本发明人通过进一步深入研究发现，这些SNP位点通过影响基因的蛋白质编码或mRNA表达水平发挥作用。总之，本发明采用较大样本高通量的全基因组关联技术实现了对干扰素应答相关遗传标识的无偏移筛选，结果更加可靠，能够在干扰素治疗前预测干扰素应答和临床治疗效果，实现了对慢乙肝患者的个性化治疗。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳检样示意图。

图2为测序分型结果示意图。

图3为所有显著差异SNP位点的曼哈顿图。

图4为全基因组关联分析的质量评估。

图5示例性地示出了rs7515753与TP53BP2表达的eQTL分析结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明中，术语“量”的含义包含含量、水平、绝对量、相对量等。表达蛋白或多肽的基因的量或水平包括mRNA的含量或水平。

本发明中，术语“试剂”和“检测剂”可互换地用于指包括那些能够显示特定基因位点或其mRNA的量的任何试剂。

用于预测药物疗效的组合物及方法

本发明提供一种用于预测药物疗效的组合物，包括用于检测生物样本中核酸的选自(a)-(e)的SNP位点信息的试剂：

在某些实施方案中，本发明涉及的位点物理位置及基因型信息如表1所示。

本发明中，药物包括干扰素类和核苷(酸)类似物及可能的免疫调节类药物和/或直接抗病毒药物。干扰素类药物包括普通干扰素IFN和聚乙二醇干扰素(也称为长效干扰素)。免疫调节类药物包括那些能够用于免疫增强，治疗免疫缺陷疾病、慢性感染和作为肿瘤的辅助治疗的任何免疫增强药。直接抗病毒药物(有时也称为“DAAs”)包括那些能够直接作用于丙肝病毒蛋白酶、RNA聚合酶等病毒复制的任何能够抑制病毒复制的药物，其实例包括但不限于利巴韦林、索非布韦(sofosbuvir)、司美匹韦(simeprevir)、雷迪帕韦(ledipasvir)、奥比他韦(ombitasvir)、帕利普韦(paritaprevir)、利托那韦(ritonavir)、达塞布韦(dasabuvir)、达卡他韦(daclatasvir)、阿那匹韦(asunaprevir)或它们的组合。

在某些实施方案中，本发明使用的药物为聚乙二醇干扰素。核苷(酸)类似物的实例包括但不限于拉米夫定(LMV)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)、替比夫定(LdT)和替诺福韦。在某些实施方案中，本发明使用的药物为阿德福韦酯(ADV)。本发明的组合物及系统和预测方法不仅适用于上述药物单用，而且适用于两者联用或联合治疗，例如聚乙二醇干扰素和阿德福韦酯联用以用于乙型肝炎病毒抗原血清学转换或以乙型肝炎病毒表面抗原血清学阴转。

在某些实施方案中，疗效包括至少下述情形之一：

(a’)降低、抑制、减少或降低HBV的复制；

(b’)增强或提高干扰素应答效果，优选地，所述干扰素应答效果包括抗HBV效果；

(c’)降低病毒量和/或活性，或持续的病毒学应答；

(d’)降低HBsAg和/或HBeAg的量和/或活性。

本发明中，“HBsAg和/或HBeAg的量和/或活性”包括HBsAg的量、HBsAg的活性、HBeAg的量、HBeAg的活性中至少任何之一的含义。可通过本领域已知的方法测定获得。测定方法包括但不限于化学发光免疫分析、酶联免疫吸附测定、实时荧光定量PCR、基因芯片技术或免疫印迹等。

本发明中，样品的类型不限定，其实例包括但不限于组织样品或流体样品。组织样品包括体细胞样品，流体样品包括血液或其成分例如血浆、血清等。生物样品可以是任何哺乳动物来源的样品，优选为来源于人的样品。可用于本发明的生物样品类型的实例包括但不限于以下的一种或多种：尿、粪便、泪液、全血、血清、血浆、血液成分、骨髓、细胞、组织、器官、体液、唾液、脸颊拭子、淋巴液、脑脊髓液、病变渗出物和由身体产生的其他流体。生物样品也可以是冷冻、固定、石蜡包埋或新鲜的活检样品。

本发明中，涉及SNP检测方法不特别限定，可以采用以下方法中至少一种或它们的联合检测进行测定：聚合酶链反应PCR、毛细管电泳、质谱、单链构象多态性SSCP、电化学分析、变性HPLC及凝胶电泳、限制性片段长度多态性、单碱基延伸SBE、等位基因特异性引物延伸ASPE、限制酶消化、链置换扩增SDA、转录介导的扩增TMA、连接酶链反应LCR、基于核酸序列的扩增NASBA、引物延伸、滚环扩增RCA、自主序列复制3SR、环介导的等温扩增LAMP、核酸测序和微阵列。

在某些实施方案中，所述核酸测序选自由以下组成的组：Maxam-Gilbert测序、链终止方法、鸟枪测序、桥式PCR、单分子实时测序、离子半导体或离子流测序、合成测序、SOLiD测序、链终止或Sanger测序、大规模平行测序MPSS、聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、DNA纳米球测序、单分子实时测序、纳米孔DNA测序、隧穿电流DNA测序、杂交测序、质谱测序、微流体Sanger测序、基于显微镜的测序、RNAP测序和体外病毒高通量测序。

可以理解的是，本发明的组合物可以包含能够用于上述检测过程的任何合适的试剂，这些试剂的类型包括但不限于例如引物、探针或基因测序试剂。本发明的试剂除了上述试剂外还可包括其它成分。其它成分的实例包括但不限于稀释液、显色液、终止液、洗涤液等。在某些实施方案中，任何上述物质之一可以与其他物质分离的状态单独存在分别存放于不同的容器(例如，小瓶)中，只要在使用时它们能够相互接触即可。另外，优选地，任何两种以上的上述物质可混合作为混合物存在。

在某些实施方案中，其它成分可以溶液形式提供，例如水溶液的状态存在。在以水溶液状态存在的情况下，这些物质的浓度或量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，物质的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。

本发明中的试剂可被进一步制备为预测或评价干扰素抗病毒治疗效果的诊断剂。该诊断剂的形式或为诊断组合物、诊断试剂盒，或者多种单独存在的试剂组合使用的其他任何形式。

本发明还提供一种用于预测药物疗效的方法，有时也称为“一种用于体外预测药物疗效的方法”或(“预测或评价干扰素治疗慢性乙肝治疗应答的方法”)，其包括使用上述试剂或组合物的步骤，或以从受试者或模型采集的生物样品中的SNP位点作为标志物的步骤，其中SNP位点如表1所示。

组合物在制备用于预测药物疗效的产品中的用途

本发明进一步提供组合物在制备用于预测药物疗效的产品中的用途。在某些实施方案中，所述产品包括但不限于例如检测芯片、检测试剂盒、微阵列或检测装置。

用于预测药物疗效的系统

本发明提供一种用于预测药物疗效的系统，其包括：

数据获取单元，其用于获取受试者生物样本中的核酸的以下SNP位点信息中的至少一个位点或组合；(a)rs67453154和rs79663242；(b)选自rs214594、rs1207042、rs4712328和rs7740550组成的组中的至少之一的位点；(c)选自rs7519753和rs12021785组成的组的至少之一的位点；(d)选自rs12576054、rs34271604、rs35678303和rs11827974组成的组中的至少之一的位点；和(e)选自rs10808842、rs12550844和rs78775926组成的组中的至少之一的位点；

数据处理单元，其用于将所述数据获取单元的数据输入预测模型并进行数据处理，其中所述预测模型由若干机器学习算法构建得到；

输出单元，其用于输出药物对于乙型肝炎的治疗效果。

在某些实施方案中，所述机器学习包括线性回归算法、逻辑回归算法、朴素贝叶斯算法、k-近邻算法、支持向量机算法、决策树算法、随机森林算法、k-平均算法和/或梯度增强算法。

预测模型的构建不特别限定，可以采用本领域已知的方法，例如将SNP位点作为重要因素或变量，或将能够预测对于乙型肝炎的治疗具有影响的其他因素纳入学习集和训练集中，进一步得到预测模型。可以理解的是，本领域技术人员也可对上述因素或变量进行排序或不同的排列组合进一步构建预测模型。

本发明中的输出单元用于输出药物对于乙型肝炎的治疗效果，这里的效果包括上面所描述的(a’)-(e’)中的至少一种情况。

在示例性实施方案中，本发明的系统体现为电子设备。电子设备可以通用计算设备的形式表现。电子设备的组件可以包括但不限于：至少一个处理器、至少一个存储器、连接不同系统组件(包括存储器和处理器)的总线。

其中，所述存储器存储有程序代码，所述程序代码可以被所述处理单元执行，使得所述处理单元执行本发明所述的方法，其中处理器至少包括本发明所述的数据处理单元(也可以称为“模块”)。存储器可以包括易失性存储单元形式的可读介质，例如随机存取存储单元(RAM)和/或高速缓存存储单元，还可以进一步包括只读存储单元(ROM)。

本发明的存储器还可以包括具有一组(至少一个)程序模块的程序/实用工具，这样的程序模块包括但不限于：操作系统、一个或者多个应用程序、其它程序模块以及程序数据，这些示例中的每一个或某种组合中可能包括网络环境的实现。

总线可以为表示几类总线结构中的一种或多种，包括存储器总线或者存储器控制器、外围总线、图形加速端口、处理单元或者使用多种总线结构中的任意总线结构的局域总线。

电子设备也可以与一个或多个外部设备(例如键盘、指向设备、蓝牙设备等)通信，还可与一个或者多个使得用户能与该电子设备交互的设备通信，和/或与使得该电子设备能与一个或多个其它计算设备进行通信的任何设备(例如路由器、调制解调器等等)通信。

这种通信可以通过输入/输出(I/O)接口进行。并且，电子设备还可以通过网络适配器与一个或者多个网络(例如局域网(LAN)，广域网(WAN)和/或公共网络，例如因特网)通信。网络适配器通过总线与电子设备的其它模块通信。应当明白，尽管本文未示出，可以结合电子设备使用其它硬件和/或软件模块，包括但不限于：微代码、设备驱动器、冗余处理单元、外部磁盘驱动阵列、RAID系统、磁带驱动器以及数据备份存储系统等。

用于筛选化合物的方法

本发明进一步提供一种用于筛选化合物的方法，本文有时简称为“筛选方法”。

在某些实施方案中，本发明的筛选方法包括：

将待测化合物施用至受试者、动物模型或细胞模型的步骤，其中，所述动物模型或细胞模型含有以下SNP位点：(a)rs67453154和rs79663242；(b)选自rs214594、rs1207042、rs4712328和rs7740550组成的组中的至少之一的位点；(c)选自rs7519753和rs12021785组成的组的至少之一的位点；(d)选自rs12576054、rs34271604、rs35678303和rs11827974组成的组中的至少之一的位点；和(e)选自rs10808842、rs12550844和rs78775926组成的组中的至少之一的位点。

本发明中，受试者或模型包括HBV感染的动物模型或体外细胞，例如，大鼠、小鼠、狗、猪、猴、猩猩等。此类动物可通过人工方式诱导HBV感染。体外细胞的实例包括但不限于人肝癌组织细胞，其包括HepG2、Huh7、Hep3B、SMMC-7721、MHCC97及它们培养的后代细胞株。

试剂盒

本发明进一步提供一种用于预测或评价干扰素抗病毒治疗效果的试剂盒，其包括用于检测生物样本中核酸的以下SNP位点信息的试剂。本发明的试剂盒中的试剂可使用前面所述的试剂，在此不再赘述。

实施例

一、实验方法

1.患者的纳入排除标准

所有患者都是在首都医科大学佑安医院接受peg-IFNa单药或者peg-IFNa联合NAs治疗的慢性乙型肝炎患者。慢性乙型肝炎的诊断均符合《慢性乙型肝炎防治指南》的定义。本发明纳入发生HBsAg阴转的慢性乙肝患者50例和未发生HBsAg阴转的慢性乙肝患者50例。HBsAg阴转组是指在治疗过程中及治疗结束后随访中发生血清HBsAg持续阴转或血清学转换的患者，即HBsAg阴性且持续6个月及以上、伴随或者不伴随抗-HBs产生、HBeAg阴性、HBVDNA阴性；HBsAg未阴转组是指治疗过程中及治疗结束后随访中未发生血清HBsAg阴转者，即HBsAg阳性、HBeAg阴/阳性、HBV DNA阴/阳性。本发明已通过首都医科大学佑安医院伦理委员会的批准，所有患者均签署知情同意书并提供外周血样本一份(20ml)。

1.1纳入标准：

(1)性别不限，年龄18-65岁。

(2)有详细的血清学(肝功能、血常规等)及病历信息。

(3)定期随诊。

1.2排除标准：

(1)合并HIV、HCV或HDV感染。

(2)自身免疫性疾病，肝硬化，肝功能失代偿，严重代谢性疾病及并发肝细胞癌或其他系统肿瘤。

2.患者的治疗方案

对于HBV DNA低于检测下限(<20IU/ml)的受试者，给予皮下注射peg-IFNα(180μg/周)治疗；对于HBV DNA阳性的受试者在接受皮下peg-IFNα注射同时还需口服ADV(10mg/天)。如果受试者在治疗开始后72周内HBsAg阴转，则该受试者将接受24周的巩固治疗；如果受试者在72-96周内HBsAg阴转，则该受试者将继续接受巩固治疗至第96周。如果受试者在治疗期间HBsAg未阴转，则受试者将被治疗至第96周，然后停止干扰素治疗。以上所有患者均在停止干扰素治疗后接受的一定时长的随访。

3.全基因组测序技术检测单核苷酸多态性

(1)gDNA提取和质量检测。

(2)构建测序文库：根据Illumina PE流程建库。取约1μg的gDNA对其进行打断，进而对DNA片段进行：末端修复、3’末端加A碱基、PE接头连接，对所需片段进行切胶回收，再对纯化后的连接产物进行循环扩增(10-12次)，最终构建成上机文库。

(3)全基因组测序

按照Illumina公司推荐的方式进行文库构建：

a)取3-5μg DNA，采用Covaris E210/LE220/S2将其随机打断为800bp以下的片段；

b)使用T4 DNA聚合酶对5’端进行修剪，对3’端进行填补从而完成末端修复；

c)对DNA片段的3’端加‘A’；

d)采用T4 DNA连接酶对DNA片段的两头加接头；

e)使用2％的琼脂胶对DNA片段进行电泳，回收并纯化450-550bp长度的DNA片段；

f)进行PCR扩增，以确保足够的DNA量进行上机，使用的引物是Illumina1.1和2.1；

g)最后，在Hiseq 2000平台上对DNA片段进双端测序。通过Illumina Basecalling软件BclConverter-1.9.0和OLB-1.9.4将测序图像文件转化成下机数据fastq格式，读长为90bp。

4.PCR扩增后直接测序法验证单核苷酸多态性

(1)鉴定引物的设计和合成

根据Genebank中各SNP位点在相关基因中的位置和序列，使用Primer5.0引物设计软件鉴定引物的设计，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物设计时尽量保证含有目的SNP位点的扩增片段长度为200-400bp，且其退火温度接近60℃。

(2)PCR反应体系和条件

采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增各目的片段。以外周血DNA为模板，反应条件为95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，30个循环；72℃延伸7min。具体反应体系如下：

(3)PCR产物的鉴定

采用2％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行初步的鉴定。每孔加样3-4μl，电泳20min左右，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像仪下观察条带并保存。阴性对照除引物二聚体外，没有任何条带，目的条带无拖尾现象且为明亮清晰的单一条带(如图1所示)。

(4)PCR产物纯化回收和测序

按Axygen PCR产物纯化回收试剂盒的说明回收目的片段，送上海生工生物公司测序。

(5)测序结果的判读

使用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)下载含有各SNP位点的标准序列，通过BioEdit7.01软件进行基因型分析，依据测序峰图确定待检测位点的基因型。纯合型为单一峰，杂合型为复合峰(如图2所示)。

二、实验结果

1.高通量全基因组分析结果

本发明采用全基因组测序的方法对100例样本进行基因分型，并通过GWAS和eQTL分析寻找与干扰素治疗下HBsAg阴转相关的SNP位点。通过全基因组测序，一共将7,013,456(如图3所示)个SNP纳入到了接下来的GWAS分析。采用主成分分析方法进行群体分层分析，结果显示，本发明中纳入的100例慢性乙肝患者并不存在明显的群体分层(如图4所示)，符合全因组关联分析的要求。

在这306差异显著SNP中，本发明选择了差异显著性排名前15的SNP位点(根据p值排序)。即rs214594的C基因型、rs7519753的C基因型、rs12576054的C基因型、rs34271604的C基因型、rs35678303的G基因型、rs10808842的G基因型、rs12550844的A基因型、rs78775926的T基因型、rs12021785的T基因型、rs67453154的C基因型、rs11827974的T基因型、rs120704的T基因型、rs4712328的T基因型、rs7740550的A基因型及rs79663242的C基因型。以上结果也部分通过了直接测序法验证(如表1所示)。

表1显著差异SNP

2.显著差异SNP间的连锁不平衡分析

本发明还分析了15个差异显著SNP位点间的连锁不平衡(表2，图4)。其中，有5个SNP分布在6号染色体上，分别是rs214594、rs1207042、rs4712328、rs77405组50和rs67453154。rs214594与rs1207042、rs4712328和rs7740550均位于KDM1B基因的内含子区，且呈明显的连锁不平衡(r2＞0.85，D＝0.96)；rs67453154位于6号染色体的基因间区，与上述4个SNP位点不存在连锁。有2个SNP位点位于1号染色体上，分别是rs7519753和rs12021785，均位于TP53BP2基因的上游，且存在较强连锁(r2＝0.97，D＝0.99)。有4个SNP位点位于11号染色体上，分别是rs12576054、rs34271604、rs35678303和rs11827974，都位于基因的内含子区，11号染色体上的这4个SNP之间也存在较强的连锁(r2＞0.80，D＞0.98)。有3个SNP位点位于8号染色体上，分别是rs10808842、rs12550844和rs78775926，均位于基因间区，三个SNP位点之间存在连锁(r2＝1，D＝1.00)。此外，还有1个SNP位点rs79663242位于12号染色体ERC1的内含子区。

上述结果表明，15个SNP位点可以进一步通过6个位点替代，通过检测6号染色体的rs214594和rs67453154、1号染色体的rs7519753、11号染色体的rs12576054以及8号染色体的rs10808842，可达到基本相同的效能，从而减少检测位点数，降低成本。

表2差异最显著的15个SNP位点相关信息的连锁不平衡分析

3.SNP位点通常通过影响基因的蛋白质编码或影响基因的mRNA表达水平来发挥作用

通过分析可知，本发明发现的15个干扰素治疗下慢性乙肝患者HBsAg阴转相关的SNP位点都位于基因内含子和基因间区，因此推测它们可能通过影响周围基因的表达来影响干扰素的治疗效果。为探索这些SNP是否与邻近基因的表达水平有关，本发明对差异显著的15个SNP位点进行了eQTL定位分析，即确定这15个SNP位点的基因型与周围基因表达的相关性。

GTEx Portal数据库保存有44种组织、数千例样本的表达谱数据和对应的测序数据，是eQTL分析的常用数据库。本发明基于GTEx Portal数据库的肝脏组织和全血组织样本数据，分析了15个显著差异SNP上下游500kb范围内所有蛋白编码基因的表达水平与SNP基因型之间的相关性。结果显示，rs7519753的C基因型与肝脏TP53BP2的高表达相关(如图5所示)。由于基因关联分析结果显示rs7519753的C基因型的C基因型和患者的高转阴率正相关。因此本发明的结果提示，肝脏TP53BP2高表达有利于干扰素治疗下慢乙肝患者的HBsAg清除。已知TP53BP2可通过抑制自噬来抑制HBV的复制。上述结果进一步提示，本发明筛选到的15个SNP位点，与干扰素治疗慢乙肝HBsAg阴转存在关联。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (10)

1.一种用于预测药物疗效的组合物，其特征在于，包括用于检测生物样本中核酸的以下SNP位点信息的试剂：

(a)rs67453154和rs79663242；

(b)选自rs214594、rs1207042、rs4712328和rs7740550组成的组中的至少之一的位点；

(c)选自rs7519753和rs12021785组成的组的至少之一的位点；

(d)选自rs12576054、rs34271604、rs35678303和rs11827974组成的组中的至少之一的位点；和

(e)选自rs10808842、rs12550844和rs78775926组成的组中的至少之一的位点。

2.根据权利要求1所述的用于预测药物疗效的组合物，其特征在于，所述药物包括干扰素类、核苷(酸)类似物、免疫调节类药物和/或直接抗病毒药物。

3.根据权利要求2所述的用于预测药物疗效的组合物，其特征在于，所述疗效包括药物对于乙型肝炎的治疗效果。

4.根据权利要求3所述的用于预测药物疗效的组合物，其特征在于，所述乙型肝炎包括慢性乙肝。

5.根据权利要求4所述的用于预测药物疗效的组合物，其特征在于，所述SNP通过以下方法中至少一种或它们的联合检测进行测定：聚合酶链反应PCR、毛细管电泳、质谱、单链构象多态性SSCP、电化学分析、变性HPLC及凝胶电泳、限制性片段长度多态性、单碱基延伸SBE、等位基因特异性引物延伸ASPE、限制酶消化、链置换扩增SDA、转录介导的扩增TMA、连接酶链反应LCR、基于核酸序列的扩增NASBA、引物延伸、滚环扩增RCA、自主序列复制3SR、环介导的等温扩增LAMP、核酸测序和微阵列；

任选地，其中所述核酸测序选自由以下组成的组：Maxam-Gilbert测序、链终止方法、鸟枪测序、桥式PCR、单分子实时测序、离子半导体或离子流测序、合成测序、SOLiD测序、链终止或Sanger测序、大规模平行测序MPSS、聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、DNA纳米球测序、单分子实时测序、纳米孔DNA测序、隧穿电流DNA测序、杂交测序、质谱测序、微流体Sanger测序、基于显微镜的测序、RNAP测序和体外病毒高通量测序。

6.根据权利要求5所述的用于预测药物疗效的组合物，其特征在于，所述试剂包括引物、探针或基因测序试剂。

7.根据权利要求1-6任一项所述的组合物在制备用于预测药物疗效的产品中的用途，其特征在于，所述产品包括检测芯片、检测试剂盒或检测装置。

8.一种用于预测药物疗效的系统，其特征在于，包括：

数据获取单元，其用于获取受试者生物样本中的核酸的以下SNP位点信息；(a)rs67453154和rs79663242；(b)选自rs214594、rs1207042、rs4712328和rs7740550组成的组中的至少之一的位点；(c)选自rs7519753和rs12021785组成的组的至少之一的位点；(d)选自rs12576054、rs34271604、rs35678303和rs11827974组成的组中的至少之一的位点；和(e)选自rs10808842、rs12550844和rs78775926组成的组中的至少之一的位点；

数据处理单元，其用于将所述数据获取单元的数据输入预测模型并进行数据处理，其中所述预测模型由机器学习算法构建得到；

输出单元，其用于输出药物对于乙型肝炎的治疗效果。

9.根据权利要求8所述的用于预测药物疗效的系统，其特征在于，所述机器学习包括线性回归算法、逻辑回归算法、朴素贝叶斯算法、k-近邻算法、支持向量机算法、决策树算法、随机森林算法、k-平均算法和/或梯度增强算法。

10.一种用于筛选化合物的方法，其特征在于，包括将待测化合物施用至动物模型或细胞模型的步骤，其中，所述动物模型或细胞模型含有以下SNP位点：

(a)rs67453154和rs79663242；

(b)选自rs214594、rs1207042、rs4712328和rs7740550组成的组中的至少之一的位点；

(c)选自rs7519753和rs12021785组成的组的至少之一的位点；(d)选自rs12576054、rs34271604、rs35678303和rs11827974组成的组中的至少之一的位点；和

(e)选自rs10808842、rs12550844和rs78775926组成的组中的至少之一的位点。

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