CN109504763A

CN109504763A - 用于预测α干扰素治疗乙肝患者疗效的分子标记

Info

Publication number: CN109504763A
Application number: CN201811541107.1A
Authority: CN
Inventors: 童梅; 程永庆; 刘金毅; 王潞; 陈晨
Original assignee: Beijing Tri-Prime Gene Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Beijing Tri-Prime Gene Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2019-03-22
Anticipated expiration: 2038-12-17
Also published as: CN109504763B

Abstract

本发明提供用于预测α干扰素治疗乙肝患者疗效的分子标记，所述分子标记选自HLA‑DPA1 rs3077、CYP27B1 rs4646536、IFNAR1‑3 rs2850015、PAK4 rs9676717或它们的组合。其中，HLA‑DPA1 rs3077 GG型、CYP27B1 rs4646536 AG型、IFNAR1‑3 rs2850015 N‑TT型、PAK4 rs9676717 CC型是与α干扰素治疗乙肝患者应答相关的优势基因型。利用分子标记或其组合判断为HBsAg转阴的患者在经IFN‑α治疗后发生HBsAg转阴的可能性增加。本方法可用于接受IFN‑α治疗的乙肝患者治疗有效性的精准评估。

Description

用于预测α干扰素治疗乙肝患者疗效的分子标记

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及一种用于预测α干扰素治疗乙肝患者疗效的分子标记。

背景技术

干扰素(interferon,IFN)、长效干扰素(Pegylated interferon,PEG-IFN)和核苷类似物(nucleoside analogues,NAs)是乙肝主要治疗药物。α干扰素(IFN-α)治疗乙型肝炎的原理和特点：具有免疫调节和抗病毒作用，能有效抑制病毒的产生，治愈后复发概率低，治疗慢性乙型肝炎疗程明确；可达到乙型肝炎e抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)血清学转阴和乙肝表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)清除以实现临床治愈；耐药变异较少，疗效相对持久，停药后可维持疗效。缺点是不良反应较多，不适用于肝功能失代偿者。

干扰素诱导的信号通路除了最初的Jak-Stat途径以外，很多新发现的信号途径对干扰素反应也是必需的。干扰素反应最终激活抗病毒的效应蛋白通路,包括TYK2/JAK1/ISGF/OAS1，Mx1，PKR、IFN-αR/PKC/STAT1，IFN-αR/MAPKs，IRS-1/PI3K-p70S6激酶等途径。这些效应蛋白通过抑制病毒转录、降解病毒RNA、抑制翻译和修饰蛋白的功能来控制病毒复制的过程。干扰素对宿主免疫细胞活性也有影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞和NK细胞等均有调节和激活作用。以往的国内外研究只检测IFN-α经典信号通路中1-3种相关的基因位点。由于干扰素在免疫系统中的复杂作用，迫切需要分析多个基因位点构成的基因调控网络来预测乙肝患者使用干扰素治疗的临床结果。

中国丙型肝炎防治指南(2015版)中提到IL-28基因多态性。包括IL-28B基因、人类白细胞抗原(HLA)I类分子HLA B57、Ⅱ类分子HLA DRB1和DQB1的等位基因多态性可影响HCV清除。例如，IL-28B基因rs12979860CC型有利于HCV病毒清除，而TT型病毒清除率很低。使用PEG-IFN-α治疗，宿主的IL-28B基因多态性与持续病毒学应答(SVR)相关，特别是感染了HCV基因1型或4型病毒的患者。IL-28B rs12979860的CC基因型、rs8099917的TT基因型以及rs12980275的AA基因型与HCV感染的自发清除和IFN治疗应答具有良好相关性。

随着精准医学的进步，药物基因组生物标志物的存在和定量与患者对特定药物或药物种类的预测反应相关。研究表明乙型肝炎患者对IFN-α治疗应答存在一定差异，现有文献中公开了一些对乙型肝炎患者宿主基因多态性的研究结果，例如发表在Antiviralresearch,2014；102:35-43.上的文献Role of IL-28B polymorphisms in the treatmentof chronic hepatitis B HBeAg-negative patients with peginterferon公开了IL-28B(rs12979860、rs12980275)基因多态性与HBeAg阴性的慢性乙肝患者接受PEG-IFN-α2a治疗所产生的HBsAg清除有关，其中rs12979860CC型、rs12980275AA型为PEG-IFN-α2a治疗应答的优势基因型。发表在Journal of Viral Hepatitis,2015,22(3):318-327.上的文献Roleof CYP27B1+2838promoter polymorphismin the treatment of chronic hepatitis BHBeAg negative with PEG-interferon公开了CYP27B1rs4646536位点AA型是对PEG-IFN-α2a引起HBsAg清除具有明显优势的乙肝患者基因型。

目前乙肝治疗领域面临的问题：一是疗程较长。长期注射IFN-α只有约30％的HBeAg转换率，即临床发现只有30-40％的患者能够对IFN-α的治疗产生血清学应答，而且只有用药24-48周后才能明确判断是否有效。与其他类型药物相比，干扰素是HBsAg清除率最高的药物，但清除率也只能达到5％。二是目前上市的PEG-IFN-α不良反应大。以发热最常见，其次为乏力，食欲减低、肝区疼痛、肌肉痛、腰痛、脱发、严重恶心、皮疹等。三是治疗易复发。NAs的作用为抑制病毒复制环节，在免疫调节方面没有作用。NAs有较好的耐受性，抗病毒能力强，不易产生耐药，停药易复发。HBsAg清除是逐步接近的过程，不同个体接近理想终点所需时间不同，许多已经达到HBsAg低水平的优势人群在固定时间节点停止了治疗，结果导致现有疗效的倒退，甚至出现复发及病毒进展。现有固定疗程很难使多数人群获益。四是使用NAs降低病毒载量后联合或序贯PEG-IFN的方案，较NAs单药能提高HBeAg转换率和HBsAg清除率。但序贯使用PEG-IFN治疗可能带来更多不良反应和更大经济负担。

尽管以往研究揭示了乙肝患者对IFN-α治疗的应答存在基因多态性差异，但每篇文献只检测少量IFN-α相关基因位点，而且不同对比文献的研究对象基线情况、人群、观察的应答终点各不一致。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于预测α干扰素(IFN-α)治疗乙肝患者疗效的分子标记。

本发明的另一目的是提供一种用于预测中国汉族原发性慢性乙型肝炎患者使用IFN-α治疗效果的基因检测预测模型及其构建方法。特别涉及通过对HBsAg转阴组和非转阴组的慢性乙肝患者进行基因多态性比较分析，找到不同SNP在HBsAg转阴组和非转阴组发生频率的差异来预测使用IFN-α治疗的临床结果。

本发明构思如下：1、针对中国汉族原发性慢性乙型肝炎患者进行研究数据收集，既包括基因数据，也包括临床的人口学、病理生理、免疫学以及用药反应等长期随访数据。2、由于IFN-α在免疫系统中的复杂作用，迫切需要综合分析多个基因位点构成的基因调控网络来预测乙肝患者对IFN-α治疗的临床效果。给IFN-α用药人群的筛选提供直接、准确的指导依据。3、现有乙肝药物HBsAg清除率小于5％，本发明涉及的方法以HBsAg清除为研究指标，筛选出与该指标相关的SNP位点，在治疗前进行基因检测以预测乙肝疗效。一是可加快筛选“有潜力获得乙肝HBsAg清除的优势人群”的速度，二是能筛选出使用IFN-α后获得HBsAg高清除率(>60％)的患者人群。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于预测IFN-α治疗乙肝患者疗效的分子标记，所述分子标记为以下方案I～IV中的任一个：

方案I：HLA-DPA1rs3077和PAK4rs9676717的组合；

方案II：HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536和IFNAR1rs2850015的组合；

方案Ⅲ：PAK4rs9676717和IFNAR1-3rs2850015的组合；

方案Ⅳ：PAK4rs9676717；

其中，HLA-DPA1rs3077GG型、CYP27B1rs4646536AG型、IFNAR1-3rs2850015N-TT型、PAK4rs9676717CC型是与α干扰素治疗乙肝患者应答相关的优势基因型。

所述乙肝患者包括中国汉族原发性慢性乙型肝炎患者。

所述疗效的评价指标至少包括乙肝患者体内的HBsAg水平。

可选地，所述疗效的评价指标还包括乙肝患者体内的HBeAg、HBV DNA、ALT等水平。

所述IFN-α包括但不限于IFN-α1、IFN-α2及其长效产品，如IFN-α1b、IFN-α2a等。

第二方面，本发明提供用于检测所述分子标记的引物，所述引物如下：

检测HLA-DPA1rs3077的引物为：5′-ACGTTGGATGGCTTGAAGGGTCAGCAA TTC-3′和5′-ACGTTGGATGACTCCAGCTGCCCTACAAAC-3′(SEQ ID NO:1-2)

检测CYP27B1rs4646536的引物为：5′-ACGTTGGATGGTTGGAAACAATGAGA AGGG-3′和5′-ACGTTGGATGCAGTCTAGGTTGCAAAGCAC-3′(SEQ ID NO:3-4)

检测PAK4rs9676717的引物为：5′-ACGTTGGATGTCAGTCCTGCCTCTCTGTC-3′和5′-ACGTTGGATGCCCAGATACAAACCACAGAG-3′(SEQ ID NO:5-6)

检测IFNAR1-3rs2850015的引物为：5′-CAGGGGTGCTGCAATTAGGA-3′和5′-CGCAGATCCCACCAGTTACA-3′(SEQ ID NO:7-8)

第三方面，本发明提供含有所述引物的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供所述分子标记、检测所述分子标记的引物和/或含有所述引物的检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

1)使用IFN-α后有潜力获得乙肝HBsAg清除的优势人群的筛选；

2)使用IFN-α后获得HBsAg高清除率(>60％)的患者人群的筛选。

第五方面，本发明提供一种临床慢性乙肝患者经IFN-α治疗后达到HBsAg转阴人群的早期预测及筛选方法，其是根据HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1-3rs2850015四个位点在HBsAg转阴的患者和未转阴的患者之间发生频率的差异，来预测乙肝患者在经过IFN-α治疗后发生HBsAg转阴的可能性。其中，HLA-DPA1rs3077GG型、CYP27B1rs4646536AG型、IFNAR1-3rs2850015N-TT型、PAK4rs9676717CC型是与α干扰素治疗乙肝患者应答相关的优势基因型。

第六方面，本发明提供一种用于预测中国汉族原发性慢性乙型肝炎患者使用IFN-α治疗效果的基因检测预测模型，特别是原发性慢性乙型肝炎患者经过IFN-α治疗后能否获得HBsAg转阴的预测模型及其构建方法。

首先收集已使用IFN-α治疗的慢性乙肝患者临床血液样本，为候选基因的序列测定提供标本。采集患者病历数据信息，收集患者治疗前后的病历信息如HBsAg(主要考察指标)、HBeAg、HBV DNA、ALT水平等。采用飞行时间质谱技术和第一代DNA测序技术(Sanger法)测定HLA-DPA1rs3077、HLA-DPB1rs9277535、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1-3rs2850015，IL-28B rs12979860六种单核苷酸多态性(SNP)，将治疗后能达到HBsAg转阴的患者设为HBsAg转阴组，未能达到HBsAg转阴的患者设为非转阴组，统计所述几种位点SNP等位基因在HBsAg转阴组和非转阴组发生频率的显著性差异。用作经IFN-α治疗的慢性乙肝患者分为HBsAg转阴和非转阴两类的分类标准。

以HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1-3rs2850015四种位点的SNP在转阴组和非转阴组发生频率的差异作为分类标准。统计分析慢性乙肝患者SNP在HBsAg转阴组和非转阴组的频率差异可通过使用公认的各种统计工具进行。

将HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1-3rs2850015四种位点的SNP在HBsAg转阴组和非转阴组发生的频率计算成百分比，如患者某SNP在HBsAg转阴组发生的频率高于非转阴组发生的频率，分类成HBsAg转阴组的可能性增加。而另外某SNP在非转阴组发生的频率高于HBsAg转阴组发生的频率，分类成非转阴组的可能性增加。

在本发明的一个具体实施方式中，HBeAg基线水平阳性和HBeAg基线水平阴性的两类患者相比，在HBsAg转阴发生的可能性上无显著性差异。

在对所有患者进行统计分析形成的预测模型中，HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1-3rs2850015四种SNP在HBsAg转阴组和非转阴组发生频率的差异具有统计学意义，通过Fisher′s判别分析进行慢性乙肝患者分为HBsAg转阴和非转阴组的预测分类。Fisher′s判别分析可通过使用公认的各种统计工具进行。在一个优选的实施方案中，统计分析HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717两种SNP得到的判断分类准确率优于其他几种SNP组合。在另一个优选的实施方案中，统计分析PAK4rs9676717、IFNAR1rs2850015两种SNP得到的HBsAg转阴判断分类准确率优于其他几种SNP组合。

在对基线HBeAg阴性患者进行统计分析形成的预测模型中，HLA-DPA1rs3077、CYP27B1rs4646536两种SNP在两组发生的频率差异具有统计学意义。

在对基线HBeAg阳性患者进行统计分析形成的预测模型中，PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536两种SNP在两组发生的频率差异具有统计学意义，通过Fisher′s判别分析进行预测分类。在一个优选的实施方案中，统计分析PAK4rs9676717一种SNP得到的HBsAg转阴判断分类准确率优于其他几种SNP组合。

若无特殊说明，本发明中使用的技术和科学术语与本领域技术人员的通常理解具有相同的意义。

本发明中使用的术语“α干扰素”，是人体天然免疫系统的关键细胞因子，Ⅰ型干扰素包括IFN-α和IFN-β，其中IFN-α有二十余个亚型，IFN-β仅有一个亚型。Ⅰ型干扰素通过与Ⅰ型干扰素受体结合触发下游信号通路。正常人体白细胞经病毒刺激后诱生IFN-α的主要亚型为IFN-α1，其次是IFN-α2，IFN-α1和IFN-α2具有相同的信号通路。本发明中临床患者使用的IFN-α是一种通过基因工程技术重组表达生产的生物治疗制剂，既可以是IFN-α1亚型的制剂，又可以是IFN-α2亚型的制剂。

本发明中使用的术语“乙肝表面抗原(HBsAg)”是乙肝病毒的外壳蛋白，是已感染乙肝病毒的标志。慢性乙型肝炎患者该指标可持续阳性。

本发明中使用的术语“乙型肝炎E抗原(HBeAg)”是乙肝病毒核心颗粒中的一种可溶性蛋白质。出现迟于HBsAg，而消失却早于HBsAg，是人体感染HBV后跟随HBsAg出现的血清学抗原标志物。HBeAg在乙肝活动期检出率升高，表明患者有很强的传染性。

本发明中使用的术语“血清学转换”是指在某些乙肝抗原转阴的同时，相应抗体的出现。如HBsAg转阴，同时抗—HBs转阳，或者HBeAg转阴，同时抗—HBe转阳，这叫做“抗原、抗体的血清学转换”。

本发明中使用的术语“单核苷酸多态性”(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。几乎所有常见的SNP位点只有两个等位基因。SNP位点的分布是不均匀的，在非编码区比在编码区更常见。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。每一个rs SNPID(reference SNP ID)为独特的SNP编号。相关SNP编号可登录NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询。

本发明中使用的术语“基因位点”(基因座)是指染色体上的固定位置，例如某个基因的所在。一条染色体上含有许多基因。基因在染色体上呈单行直线排列。一个基因位点的表述包括染色体编号，染色体上的短臂(p)或长臂(q)位置，染色体臂上的所在位置。

本发明中使用的术语“等位基因”，又称对偶基因，是一些占据染色体基因座的可以复制的脱氧核糖核酸。一对染色体同一个位置的基因称为等位基因，等位基因如果完全一样，并且控制一种性状称为纯合子，由于SNP的存在，相同基因座上含有不同的等位基因，称为杂合子。等位基因的存在会有两个碱基，即基因型。

若无特殊说明，可使用现有的分子生物学、微生物学、细胞生物学及生物化学的技术来实施本发明。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)已有研究只检测了一少部分IFN-α相关基因位点，揭示了乙型肝炎患者对IFN-α治疗的应答存在基因多态性差异，但不同对比文献所述研究对象的基线情况、人群、观察的应答终点各不一致，并没有形成多个基因位点构成的基因调控网络来预测乙肝患者对IFN-α治疗的临床效果。本发明首次提供由多个IFN-α敏感基因位点组成的预测模型，有助于预测使用IFN-α治疗的慢性乙肝患者能否获得HBsAg转阴，既可以是HBeAg基线水平阴性的患者，也可以是HBeAg基线水平阳性的患者。整体患者在HBsAg转阴组和非转阴组SNP发生频率的差异显著性和预测模型准确率上优于HBeAg基线水平阴性的患者，也优于HBeAg基线水平阳性的患者。

(二)本发明建立的预测模型，经使用后判断为HBsAg转阴组表示在经过IFN-α治疗48-96周后发生HBsAg转阴的可能性增加。判断为非转阴组表示在经过IFN-α治疗48-96周后不发生HBsAg转阴的可能性增加。

(三)本发明建立的预测模型，在治疗开始前就可以对患者进行基因检测，两周内得到结果和解读，速度远超于用药24-48周后再判断是否有效，加快了筛选“使用IFN-α后有潜力获得乙肝HBsAg清除的优势人群”的速度。

(四)本发明建立的预测模型，经使用后一旦判断某个群体为优势治疗人群，该群体中有大于60％的个体可能获得HBsAg清除。能够有效提高IFN-α用药人群的HBsAg清除率。使用本发明建立的预测模型对目标乙肝患者进行精准筛选、精准评估，可以使IFN-α治疗慢性乙肝更具有针对性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1原发性慢性乙型肝炎患者经过IFN-α治疗后能否获得HBsAg转阴的预测模型及其构建方法

一、中国汉族原发性慢性乙肝患者样本采集及分组

研究对象为2014年1月至2018年8月在北京佑安医院就诊接受IFN-α治疗的224例中国汉族原发性慢性乙肝患者。纳入标准：1)性别不限，年龄在18到60岁之间；2)慢性乙肝的诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》(2015版)；3)患者基线情况符合：HBV DNA≥2000IU/ml，ALT≥1×正常值上限；4)既往被诊断为慢性乙型肝炎符合抗病毒治疗指征，接受干扰素为基础的治疗，疗程48-96周，获得或未获得HBsAg转阴。排除标准：①IFN、NAs过敏史、IFN禁忌症；②合并感染HCV、HDV、HIV；③孕期或哺乳期；失代偿肝硬化；酗酒，自身免疫性疾病；肝癌；④疗程不完整，随访失联。采集患者病历数据信息如患者性别、年龄、家族史、乙肝病毒基因亚型分类。收集患者治疗前后的病历信息如HBsAg(主要考察指标)、HBeAg、HBV DNA、ALT水平等。

患者用药方案为IFN-α，包括派罗欣(聚乙二醇干扰素α-2a注射液，上海罗氏制药有限公司)或运德素(重组人干扰素α1b注射液，北京三元基因药业股份有限公司)联合口服抗病毒药治疗48-96周。PEG-IFN-α2a：根据体重选择剂量，体重<70kg的患者服药剂量为135μg/周，皮下注射，体重≥70kg的患者服药剂量为180μg/周，皮下注射。IFN-α1b：50μg/次，皮下或肌内注射，隔日1次。抗病毒药：恩替卡韦(ETV)0.5mg/日，口服。

疗效评估指标为：随访时HBV DNA抑制率(HBV DNA<20IU/ml)；HBsAg清除和转换率；肝功能改善情况。疗效评估方法为：治疗效果分为HBsAg转阴组及非转阴组。

1、HBsAg转阴组：通过干扰素治疗，在疗程96周前达到HBsAg清除或转换(伴有抗-HBs产生)且HBeAg血清学转换的慢性乙肝患者。治疗结束后24周随访时：ALT<正常值下限，HBV DNA<20IU/ml，HBsAg清除或转换(伴有抗-HBs产生)。

2、非转阴组：治疗96周未出现HBsAg清除的患者。

二、临床慢性乙肝患者血液样本基因组DNA提取

临床样本血液基因组DNA的提取，采用试剂盒(北京天根生物科技有限公司DP318)处理。使用天根血液基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书，进行基因组DNA提取操作。每例血液样本取400μl用于DNA提取，加入20μl Proteinase K溶液酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中，充分颠倒混匀，56℃放置10min。最终产物溶于120μl洗脱液中保存。通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、纯度和降解程度，通过紫外分光光度计检测OD₂₆₀/OD₂₈₀数值，调整DNA终浓度为30ng/μl。用作质谱方法检测SNP的模板。

三、使用飞行时间质谱技术Sequenom Mass 进行SNP分型检测

将提取的临床样本基因组DNA送上海生工生物工程股份有限公司和北京毅新博创生物科技有限公司进行飞行质谱分析。检测4个SNP位点，HLA-DPA1rs3077、CYP27B1rs4646536、PAK4rs9676717、HLA-DPB1rs9277535。技术方案概述如下：通过软件根据位点信息设计特异性的PCR引物和延伸引物并进行合成，通过PCR反应对SNP位点序列进行扩增，扩增产物以SAP酶去除多余dNTPs，加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上延伸一个碱基并终止。延伸引物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。将制备的样本分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管中经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样本分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。

PCR反应体系为：ddH₂O 1.8μl，10×PCR Buffer 0.5μl，MgCl₂(25mM)0.4μl，dNTP(25mM)0.1μl，Hotstar Taq(5U/ul)0.2μl，上、下游引物各0.5μl。待测DNA样品1μl(30ng)。体系为5μl。PCR反应条件为：循环开始前95℃2分钟，循环开始后95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒，共45个循环；循环结束后72℃5分钟。

具体采用的引物如下：

HLA-DPA1rs3077：

上游引物：5′-ACGTTGGATGGCTTGAAGGGTCAGCAATTC-3′

下游引物：5′-ACGTTGGATGACTCCAGCTGCCCTACAAAC-3′

CYP27B1rs4646536：

上游引物：5′-ACGTTGGATGGTTGGAAACAATGAGAAGGG-3′

下游引物：5′-ACGTTGGATGCAGTCTAGGTTGCAAAGCAC-3′

PAK4rs9676717：

上游引物：5′-ACGTTGGATGTCAGTCCTGCCTCTCTGTC-3′

下游引物：5′-ACGTTGGATGCCCAGATACAAACCACAGAG-3′

HLA-DPB1rs9277535：

上游引物：5′-ACGTTGGATGAAAACATGCTCTCAGTAAG-3′

下游引物：5′-ACGTTGGATGTGGTGAGCAGACTGCAAATC-3′

单碱基延伸反应体系为：ddH₂O 0.619μl，iplex Buffer 0.2μl，Terminator mix0.2μl，Extend primer mix 0.94μl，iplex Enzyme 0.041μl，体系为2μl(美国Sequenom公司)。单碱基延伸反应条件为：循环开始前94℃30秒，循环开始后94℃5秒，52℃5秒，80℃25秒，72℃3分钟，共40个循环。

具体采用的延伸引物如下：

HLA-DPA1rs3077：5′-caagTCAGTCAGCCACTGG-3′

HLA-DPB1rs9277535：5′-gATTAGTGCTGTGGGAATA-3′

PAK4rs9676717：5′-CCCTGCAGGGTGAAG-3′

CYP27B1rs4646536：5′-CCCTAGCCTCATCTTG-3′

四、使用一代测序方法(Sanger法)进行SNP分型检测

两个SNP位点IFNAR1-3rs2850015，IL-28B rs12979860采用Sanger测序方法检测。

技术方案可概述为：

通过PCR反应扩增包含rs2850015位点的一段约400bp的患者基因组DNA序列，具体的PCR反应体系为：DNA样品(30ng/μl)3μl，上、下游引物(100ng/μl)各0.5μl，PCR反应混合液(北京天根生物科技有限公司)10μl，加dd H₂O至20μl；PCR反应条件为：循环开始前94℃3分钟，循环开始后94℃30秒，62℃30秒，72℃1分钟，共35个循环，循环结束后72℃10分钟。

具体采用的引物如下：

上游引物：5′-CAGGGGTGCTGCAATTAGGA-3′

下游引物：5′-CGCAGATCCCACCAGTTACA-3′

通过PCR方式扩增包含rs12979860位点的一段约400bp的患者基因组DNA序列，具体的PCR反应体系为：DNA样品(30ng/μl)3μl，上、下游引物(100ng/μl)各0.5μl，PCR反应混合液(北京天根生物科技有限公司)10μl，加dd H₂O至20μl；PCR反应条件为：循环开始前94℃3分钟，循环开始后94℃30秒，62℃30秒，72℃1分钟，共35个循环，循环结束后72℃10分钟。

具体采用的引物如下：

上游引物：5′-GGGATTCCTGGACGTGGATGGGTACTGG-3′

下游引物：5′-ACAATTCCCACCACGAGACCCCCGCA-3′

将PCR产物送至北京中美泰和生物技术有限公司或北京擎科生物技术有限公司进行Sanger测序。技术方案可概述为：Sanger测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)、双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)、测序引物及DNA聚合酶等。测序反应的核心是其使用的ddNTP缺少3′-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，可以被自动化的仪器或凝胶成像系统检测到。

五、统计学分析方法

采用上述方案检测224例临床样本基因组DNA。应用SPSS 22.0软件(IBM公司)进行统计学处理。非转阴组与HBsAg转阴组中IFNAR1-3rs2850015，IL-28B rs12979860，CYP27B1rs4646536，HLA-DPB1rs9277535，HLA-DPA1rs3077以及PAK4rs9676717SNP基因型发生频率的比较采用χ2卡方检验。慢性乙肝患者分为HBsAg转阴组和非转阴组的预测分类通过Fisher′s判别分析进行。χ2卡方检验、Fisher′s判别分析、计算P值、OR值以及95％CI可通过使用公认的各种统计工具来进行。P<0.05为差异具有统计学意义。

六、干扰素疗效与基因多态性分析

用SPSS对现有的224例临床样本数进行χ2检验，其中非转阴组145例，HBsAg转阴组79例。如表1所示，基线水平HBeAg(-)患者131例，基线水平HBeAg(+)患者93例。非转阴组中包括基线水平HBeAg(-)患者84例，基线水平HBeAg(+)患者61例；HBsAg转阴组中包括基线水平HBeAg(-)患者47例，基线水平HBeAg(+)患者32例。基线水平HBeAg(+)和基线水平HBeAg(-)的两类患者相比较，HBsAg清除率未见统计学意义(P＝0.467)。

表1临床患者分组情况

分析结果如表2所示，HLA-DPA1rs3077GG型与N-GG型相比，GG基因型的慢性乙肝患者对IFN-α具有更高的应答率，[P＝0.00554,OR＝2.194,C.I.＝(1.253-3.839)]，具有统计学意义；PAK4rs9676717CC型与TT型相比，CC基因型的慢性乙肝患者对IFN-α具有更高的应答率，[P＝0.00240,OR＝3.545,C.I.＝(1.533-8.201)]，具有统计学意义；CYP27B1rs4646536AG型与N-AG型相比，AG基因型的慢性乙肝患者对IFN-α具有更高的应答率[P＝0.00526,OR＝2.202,C.I.＝(1.259-3.849)]，具有统计学意义；IFNAR1-3rs2850015N-TT型与TT型相比，N-TT基因型的慢性乙肝患者对IFN-α具有更高的应答率[P＝0.02228,OR＝7.740,C.I.＝(0.993-60.318)]，具有统计学意义。

HLA-DPB1rs9277535的GG型与N-GG型相比，IFN-α疗效未见统计学意义(P＝0.53224)；IL-28B rs12979860的TT型与CT型相比，IFN-α疗效未见统计学意义(P＝0.44556)。

表2HBsAg转阴组和非转阴组干扰素疗效的基因多态性分析

在224例样本中(其中非转阴组145例，HBsAg转阴组79例)，既包括基线HBeAg(+)患者，也包括基线HBeAg(-)患者，对显著性最好的四种基因HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1rs2850015进行分析，根据优势基因型所占百分比进行评分转换，计算公式如下：

一种基因型的数据评分＝[n(HBsAg转阴组该基因型患者数量)÷n(HBsAg转阴组患者总数)×100％]－[n(非转阴组该基因型患者数量)÷n(非转阴组患者总数)×100％]

随后对两组共224例患者的四个位点HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1rs2850015所对应的基因型评分进行统计分析。Fisher’s判别分类分析采用SPSS statistics.22(Statistical Product and Service Solutions，IBM公司)进行，使用方法为该领域专业技术人员所熟知的。根据不同基因位点SNP分型评分获得Fisher’s判别函数，如表3所示交叉表格中，类别1和2为实际分类的病例数。预测组1和2为根据模型预测的分类病例数。预测为组1且分类为组1，或预测为组2且分类为组2是判断正确的病例数。该病例数占总病例数的百分比为预测准确率。根据一个新病例评分可预测该病例所归属的类别。

将HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1rs2850015排列组合成Fisher’s判别分析函数，预测慢性乙肝患者经IFN-α治疗能否达到HBsAg转阴(表3)。在优选的实施方案中，组合1预测准确率为63.4％。判断为非转阴组且实际为非转阴组准确率为63.4％，判断为HBsAg转阴组且实际为HBsAg转阴组准确率为63.3％。组合2预测准确率为62.5％。判断为非转阴组且实际为非转阴组准确率为60.7％，判断为HBsAg转阴组且实际为HBsAg转阴组准确率为65.8％。组合3预测准确率为56.7％。判断为非转阴组且实际为非转阴组准确率为49.0％，判断为HBsAg转阴组且实际为HBsAg转阴组准确率为70.9％。

表3HBsAg转阴组和非转阴组干扰素疗效的预测模型分类结果

七、基线HBeAg阴性患者干扰素疗效与基因多态性分析

用SPSS对131例基线HBeAg阴性患者临床样本数进行χ2检验，其中非转阴组84例，HBsAg转阴组47例。分析结果见表4，HLA-DPA1rs3077GG型与N-GG型相比，GG基因型的慢性乙肝患者对IFN-α具有更高的应答率，[P＝0.04539,OR＝2.086,C.I.＝(1.010-4.309)]，具有统计学意义。CYP27B1rs4646536AG型与N-AG型相比，AG基因型的慢性乙肝患者对IFN-α具有更高的应答率[P＝0.04665,OR＝2.087,C.I.＝(1.006-4.331)]，具有统计学意义。

PAK4rs9676717CC型与TT型相比，IFN-α疗效未见统计学意义(P＝0.06247)；IFNAR1-3rs2850015N-TT型与TT型相比，IFN-α疗效未见统计学意义(P＝0.05912)。HLA-DPB1rs9277535的GG型与N-GG型相比，IFN-α疗效未见统计学意义(P＝0.38293)；IL-28Brs12979860的TT型与CT型相比，IFN-α疗效未见统计学意义(P＝0.83828)。

表4HBeAg(-)亚组患者基因多态性分析

在优选的实施方案中，HLA-DPA1rs3077、CYP27B1rs4646536两个位点组合成Fisher’s判别分析函数(表5)。其中，组合1预测准确率为59.5％。判断为非转阴组且实际为非转阴组准确率为60.7％，判断为HBsAg转阴组且实际为HBsAg转阴组准确率为57.4％。组合2预测准确率为61.1％。判断为非转阴组且实际为非转阴组准确率为66.7％，判断为HBsAg转阴组且实际为HBsAg转阴组准确率为51.1％。组合3预测准确率为60.3％。判断为非转阴组且实际为非转阴组准确率为59.5％，判断为HBsAg转阴组且实际为HBsAg转阴组准确率为61.7％。

表5HBeAg(-)亚组患者干扰素疗效的预测模型分类结果

八、基线HBeAg阳性患者干扰素疗效与基因多态性分析

用SPSS对93例基线HBeAg阳性患者临床样本数进行χ2检验，其中非转阴组61例，HBsAg转阴组32例。分析结果见表6，PAK4rs9676717CC型与TT型相比，CC基因型的慢性乙肝患者对IFN-α具有更高的应答率，[P＝0.00991,OR＝6.125,C.I.＝(1.425-26.328)]，具有统计学意义。CYP27B1rs4646536AG型与N-AG型相比，AG基因型的慢性乙肝患者对IFN-α具有更高的应答率[P＝0.04605,OR＝2.415,C.I.＝(1.007-5.793)]。

HLA-DPA1rs3077GG型与N-GG型相比，IFN-α疗效未见统计学意义(P＝0.05018)。IFNAR1-3rs2850015N-TT型与TT型相比，IFN-α疗效未见统计学意义(P＝0.17245)。HLA-DPB1rs9277535的N-GG型与GG型相比，IFN-α疗效未见统计学意义(P＝0.96230)；IL-28Brs12979860的TT型与CT型相比，IFN-α疗效未见统计学意义(P＝0.16857)。

表6HBeAg(+)亚组患者基因多态性分析

在优选的实施方案中，PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536两个位点组合成Fisher’s判别分析函数(表7)。其中，组合1预测准确率为61.3％。判断为非转阴组且实际为非转阴组准确率为62.3％，判断为HBsAg转阴组且实际为HBsAg转阴组准确率为59.4％。组合2预测准确率为55.9％。判断为非转阴组且实际为非转阴组准确率为45.9％，判断为HBsAg转阴组且实际为HBsAg转阴组准确率为75.0％。组合3预测准确率为64.5％。判断为非转阴组且实际为非转阴组准确率为75.4％，判断为HBsAg转阴组且实际为HBsAg转阴组准确率为43.8％。

表7HBeAg(+)亚组患者干扰素疗效的预测模型分类结果

九、预测使用IFN-α治疗的慢性乙肝患者所需检测位点

利用本发明建立的预测模型，可以预测将使用IFN-α治疗的慢性乙肝患者于疗程48-96周时的HBsAg清除情况(表8)，对整体患者来说预测准确率最高的数值是63.4％，为检测2个位点HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717的组合。其次预测准确率较高的数值是62.5％，为检测4个位点HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1rs2850015的组合。

对整体患者来说，预测HBsAg转阴准确率较高的数值是70.9％，为检测2个位点PAK4rs9676717、IFNAR1rs2850015的组合。其次预测HBsAg转阴准确率较高的数值是65.8％，为检测4个位点HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1rs2850015的组合。

在HBeAg基线水平阳性的患者中，预测HBsAg转阴准确率最高的数值是75.0％，为检测1个位点PAK4rs9676717。

表8预测使用IFN-α治疗的慢性乙肝患者HBsAg转阴模型结果汇总

本发明提供的预测模型可用于预测中国汉族原发性慢性乙型肝炎患者使用IFN-α治疗后能否获得HBsAg转阴。所述的预测模型涉及HLA-DPA1rs3077、PAK4rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1-3rs2850015四种SNP在HBsAg转阴的患者和未转阴的患者之间发生频率的差异。使用本发明的预测模型判断为HBsAg转阴的患者在经过IFN-α治疗后发生HBsAg转阴的可能性增加。采用该方法在乙肝治疗中精准评估接受IFN-α治疗的患者，有提高HBsAg清除率的潜力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京三元基因药业股份有限公司

<120> 用于预测α干扰素治疗乙肝患者疗效的分子标记

<130> KHP181118374.4

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg gcttgaaggg tcagcaattc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg actccagctg ccctacaaac 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgttggatg gttggaaaca atgagaaggg 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgttggatg cagtctaggt tgcaaagcac 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgttggatg tcagtcctgc ctctctgtc 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgttggatg cccagataca aaccacagag 30

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caggggtgct gcaattagga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcagatccc accagttaca 20

Claims

1.用于预测α干扰素治疗乙肝患者疗效的分子标记，其特征在于，所述分子标记为以下方案I～IV中的任一个：

方案I：HLA-DPA1 rs3077和PAK4 rs9676717的组合；

方案II：HLA-DPA1 rs3077、PAK4 rs9676717、CYP27B1 rs4646536和IFNAR1 rs2850015的组合；

方案Ⅲ：PAK4 rs9676717和IFNAR1-3 rs2850015的组合；

方案Ⅳ：PAK4 rs9676717；

其中，HLA-DPA1 rs3077 GG型、CYP27B1 rs4646536 AG型、IFNAR1-3 rs2850015 N-TT型、PAK4 rs9676717 CC型是与α干扰素治疗乙肝患者应答相关的优势基因型。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述乙肝患者包括中国汉族原发性慢性乙型肝炎患者。

3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述疗效的评价指标至少包括乙肝患者体内的HBsAg水平。

4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于，所述疗效的评价指标还包括乙肝患者体内的HBeAg、HBV DNA、ALT水平。

5.根据权利要求1-4任一项所述的分子标记，其特征在于，所述α干扰素包括IFN-α1、IFN-α2及其长效产品，优选IFN-α1b、IFN-α2a。

6.用于检测权利要求1-5任一项所述分子标记的引物，其特征在于，所述引物如下：

检测HLA-DPA1 rs3077的引物为：5′-ACGTTGGATGGCTTGAAGGGTCAGCAATTC-3′和5′-ACGTTGGATGACTCCAGCTGCCCTACAAAC-3′；和/或

检测CYP27B1 rs4646536的引物为：5′-ACGTTGGATGGTTGGAAACAATGAGAAGGG-3′和5′-ACGTTGGATGCAGTCTAGGTTGCAAAGCAC-3′；和/或

检测PAK4 rs9676717的引物为：5′-ACGTTGGATGTCAGTCCTGCCTCTCTGTC-3′和5′-ACGTTGGATGCCCAGATACAAACCACAGAG-3′；和/或

检测IFNAR1-3 rs2850015的引物为：5′-CAGGGGTGCTGCAATTAGGA-3′和5′-CGCAGATCCCACCAGTTACA-3′。

7.含有权利要求6所述引物的检测试剂或试剂盒。