CN102482664A

CN102482664A - 用于预测c型肝炎的治疗效果的标记物和预测c型肝炎的治疗效果的方法以及c型肝炎的预防或治疗剂

Info

Publication number: CN102482664A
Application number: CN2010800365956A
Authority: CN
Inventors: 田中靖人; 沟上雅史; 德永胜士
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation; Nagoya City University
Current assignee: Japan Health Sciences Foundation; Nagoya City University
Priority date: 2009-08-21
Filing date: 2010-08-05
Publication date: 2012-05-30
Also published as: JP5727694B2; WO2011021508A1; JP2011041526A

Abstract

本发明提供更高精度的治疗效果预测标记物，以及使用其的在“PEG化IFN/RBV并用疗法”中更高精度地预测C型肝炎治疗效果的方法等；一种用于预测C型肝炎的治疗效果的标记物，以及使用其的C型肝炎的治疗效果预测方法，其是人基因组上存在的寡核苷酸或多核苷酸，包括选自下述的基因多态性或与它们处于连锁不平衡状态(R2＞0.8)的基因多态性中的1种或2种以上：rs12043519、rs1986953、rs13392065、rs16987149、rs16987155、rs2374341、rs2374342、rs7566701、rs12713624、rs10208788、rs10208883、rs9876122、rs2036081、rs13122167、rs4488950、rs13150115、rs7663113、rs1379606、rs913500、rs6458003、rs6906840、rs2224068、rs9390164、rs4512312、rs757844、rs4876271、rs7942675、rs17787293、rs917334、rs6489019、rs6489020、rs6489021、rs11610391、rs9528038、rs341554、rs2325219、rs1353348、rs2076954、rs12907066、rs8075713、rs4795794、rs955155、rs12972991、rs12980275、rs8105790、rs11881222、rs8103142、rs28416813、rs4803219、rs8099917、rs7248668、rs10853728、rs4803223、rs12980602、rs4803224、序列编号59所示的存在于多核苷酸内的基因多态性。

Description

用于预测C型肝炎的治疗效果的标记物和预测C型肝炎的治疗效果的方法以及C型肝炎的预防或治疗剂

技术领域

本发明涉及在整个宿主基因组进行了全面验证的、用于预测C型肝炎的治疗效果的标记物，使用其的以更高精度预测C型肝炎的治疗效果方法，以及在该预测中使用的探针、引物或包含它们的试剂盒，以及C型肝炎的预防或治疗剂等。

本申请请求通过参照而在此引用的日本申请特愿2009-192615号的优先权。

背景技术

以往针对预测C型肝炎的治疗效果的方法进行了各种研究，但其中大多数情况下，以根据患者感染的“病毒因子”进行判断的方法为主流。

具体而言，通过病毒基因型或特定区域(核心区或非结构区(NS5A))的变异来预测干扰素(IFN)的治疗效果。

近年报道了利用“患者(宿主)本身的单碱基多态性(SNP)”的方法，但均是预测“IFN单独疗法”中的治疗效果的方法，不是以现在正成为主流的“PEG化IFN/RBV并用疗法”为基准的方法，不可能直接转用(专利文献1，非专利文献1，2等)。

这是由于：“IFN单独疗法”和“PEG化IFN/RBV并用疗法”中，成为SNP的判断基准的治愈效率(显著效率)本身完全不同，因此，不能将针对“IFN单独疗法”所导出的SNP转用到以“PEG化IFN/RBV并用疗法”为对象的SNP中。

另外，这些以往的方法只不过是将特定的基因作为候补来进行研究，并不是对整个宿主基因组进行了全面验证，因此在精度方面还存在问题。

这是由于：大多数情况下，药物的治疗效果与多种因素相关，如果不对整个基因组进行全面的SNP验证，则不能称为对治疗效果的正确预测。

专利文献

专利文献1：日本专利特开2004-298011号公报

非专利文献

非专利文献1：Matsuyama，N.等.Hepatol Res 25，221-225，2003

非专利文献2：Tsukada，H.等.Gastroenterology 136，1796-1805，2009

发明内容

本发明人等为了解决上述问题，在以日本人为中心的亚洲系人群中，对整个宿主基因组全面实施了关于“PEG化IFN/RBV并用疗法”的SNP分析(全基因组关联研究(Genome-Wide Association Study：GWAS))，结果发现了大量危险率高(难以获得治疗效果)的SNP，同时发现了该SNP集中的基因区域，于是达到了本发明，本发明的目的在于提供利用了SNP或其他的基因多态性的精度更高的C型肝炎治疗效果预测用标记物、该预测中使用的探针、引物或试剂盒、使用了该标记物的C型肝炎治疗效果的预测方法以及该治疗效果预测标记物的搜索用基因、及使用了本发明的SNP或其他基因多态性的集中区域所编码的蛋白质的C型肝炎的预防或治疗剂。

上述的目的是通过下述的第一方面发明至第十四方面的发明而达到的。

<第一方面发明>

一种用于预测C型肝炎的治疗效果的标记物，其是人基因组上存在的寡核苷酸或多核苷酸，包括选自下述的基因多态性或与它们处于连锁不平衡状态(R2＞0.8)的基因多态性中的1种或2种以上：

rs12043519、rs1986953、rs13392065、rs16987149、rs16987155、rs2374341、rs2374342、rs7566701、rs12713624、rs10208788、rs10208883、rs9876122、rs2036081、rs13122167、rs4488950、rs13150115、rs7663113、rs1379606、rs913500、rs6458003、rs6906840、rs2224068、rs9390164、rs4512312、rs757844、rs4876271、rs7942675、rs17787293、rs917334、rs6489019、rs6489020、rs6489021、rs11610391、rs9528038、rs341554、rs2325219、rs1353348、rs2076954、rs12907066、rs8075713、rs4795794、rs955155、rs12972991、rs12980275、rs8105790、rs11881222、rs8103142、rs28416813、rs4803219、rs8099917、rs7248668、rs10853728、rs4803223、rs12980602、rs4803224、序列编号59所示的存在于多核苷酸内的基因多态性。

<第二方面发明>

根据第一方面发明所述的用于预测C型肝炎的治疗效果的标记物，其中，寡核苷酸或多核苷酸的长度为40k碱基长以下。

<第三方面发明>

根据第一方面发明或第二方面发明所述的用于预测C型肝炎的治疗效果的标记物，其中，C型肝炎的治疗效果是基于使用了干扰素和/或PEG化干扰素进行治疗的治疗效果。

<第四方面发明>

根据第一方面发明至第三方面发明中任一项所述的用于预测C型肝炎的治疗效果的标记物，其中，C型肝炎的治疗效果是基于PEG化干扰素/RBV并用疗法的治疗效果。

<第五方面发明>

一种寡核苷酸或多核苷酸或其标识物，其与包含选自第一方面发明所述基因多态性中的1种或2种以上的人基因组上存在的寡核苷酸或多核苷酸杂交。

<第六方面发明>

一种探针，其含有第五方面发明所述的寡核苷酸或多核苷酸或其标识物。

<第七方面发明>

一种引物，其含有第五方面发明所述的寡核苷酸或多核苷酸或其标识物。

<第八方面发明>一种C型肝炎的治疗效果预测用试剂盒，其中包括第六方面发明所述的探针和/或第七方面发明所述的引物。

<第九方面发明>

一种预测C型肝炎的治疗效果的方法，其具有下述(1)及(2)的工序：

(1)根据从患者得到的样品确定下述(X)的基因型的工序；

(X)第一方面发明所述基因多态性中的至少1种

(2)从由(1)确定的基因型对C型肝炎的治疗效果进行预测的工序。

<第十方面发明>

根据第九方面发明所述的预测C型肝炎的治疗效果的方法，其中，C型肝炎的治疗效果是基于使用了干扰素和/或PEG化干扰素进行治疗的治疗效果。

<第十一方面发明>

根据第十方面发明所述的预测C型肝炎的治疗效果的方法，其中，C型肝炎的治疗效果是基于PEG化干扰素/RBV并用疗法的治疗效果。

<第十二方面发明>

一种C型肝炎的治疗效果预测标记物的搜索用基因，其具有下述(A)或(B)的序列：

(A)、含有序列编号59所示的多核苷酸的至少一部分的寡核苷酸或多核苷酸，

(B)、(A)中1个至数个核苷酸经缺失、替代、添加和/或插入后的寡核苷酸或多核苷酸。

<第十三方面发明>

一种C型肝炎治疗药的筛选方法，其使用下述(A)至(C)中的至少1种：

(A)、含有序列编号59所示的多核苷酸中的至少一部分的寡核苷酸或多核苷酸，

(B)、(A)中1个至数个核苷酸经缺失、替代、添加和/或插入后的寡核苷酸或多核苷酸，

(C)、人基因组上存在的包含rs8103142的寡核苷酸或多核苷酸。

<第十四方面发明>

一种C型肝炎的预防或治疗剂，其含有IL28B蛋白质和/或编码其的基因。

发明效果

由于本发明的“用于预测C型肝炎的治疗效果的标记物”基于在整个宿主基因组进行了全面验证的结果，因此成为能够更加正确预测C型肝炎的治疗、特别是干扰素疗法、其中尤其作为最新治疗的“PEG化IFN/RBV并用疗法”的治疗效果。

另外，危险度值比以往的标记物更明确(P值非常小)，容易判断。

通过本发明的“探针”、“引物”、使用它们的“C型肝炎的治疗效果预测用试剂盒”以及“预测C型肝炎的治疗效果的方法”，能够更加正确地预测C型肝炎的治疗、特别是干扰素疗法、其中尤其作为最新治疗的“PEG化IFN/RBV并用疗法”的治疗效果。

通过更加详尽地研究本发明的“C型肝炎的治疗效果预测标记物的搜索用基因”内部，可以更加迅速地发现C型肝炎治疗效果预测用的新标记物。

通过本发明的“C型肝炎治疗药的筛选方法”，也可以进行除干扰素或RBV以外的C型肝炎治疗药的筛选。

通过本发明的预防或治疗剂，可以期待对C型肝炎的有效的预防或治疗。

附图说明

[图1]是对分别从PEG-IFN/RBV并用疗法中治疗无效的患者以及有效的患者的末梢血单核细胞提取的RNA中的IL28 mRNA水平进行比较的图。

[图2]是示出作为序列编号59所示的多核苷酸的一部分的“TATA的重复序列(以IL28B的起始密码子为起点的-595～-568位)”的位置以及在该序列中的2个SNP的位置(主要等位基因)的图。

[图3]是示出作为序列编号59所示的多核苷酸中的一部分的2个SNP的位置(主要等位基因)的图(图2的续图)。

具体实施方式

以下，对本发明详细地进行说明。

另外，本发明中的“基因”、“寡核苷酸”及“多核苷酸”含有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)等嘌呤碱基，胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)等嘧啶碱基或它们的修饰碱基作为构成要素；其是指单链或双链的DNA、单链或双链的RNA、包含单链DNA和单链RNA的杂合体、RNA与DNA结合而形成单链的嵌合体中的任一种或数种。另外，DNA中也包括cDNA。

[本发明的用于预测C型肝炎的治疗效果的标记物]

《标记物的定义》

本发明的“用于预测C型肝炎的治疗效果的标记物”成为用于预测C型肝炎的治疗效果的指标，其是在人基因组上存在的寡核苷酸或多核苷酸，包括选自下述所示基因多态性或与它们处于连锁不平衡状态(R2＞0.8)的基因多态性中的1种或2种以上。

另外，与特定的基因多态性“处于连锁不平衡状态(R2＞0.8)的基因多态性”是指可以与该特定的基因多态性进行同样的治疗效果预测的基因多态性，例如可以利用Haploview软件等按照公知的方法来检测。

具体而言，标记物是指在C型肝炎的感染者或疑似感染的对象者的血液等样品中存在的基因或基因片段，其成为用于利用后述的探针等而被测出、通过研究其基因型(SNP等基因多态性)来预测C型肝炎的治疗效果的试剂。

rs12043519、rs1986953、rs13392065、rs16987149、rs16987155、rs2374341、rs2374342、rs7566701、rs12713624、rs10208788、rs10208883、rs9876122、rs2036081、rs13122167、rs4488950、rs13150115、rs7663113、rs1379606、rs913500、rs6458003、rs6906840、rs2224068、rs9390164、rs4512312、rs757844、rs4876271、rs7942675、rs17787293、rs917334、rs6489019、rs6489020、rs6489021、rs11610391、rs9528038、rs341554、rs2325219、rs1353348、rs2076954、rs12907066、rs8075713、rs4795794、rs955155、rs12972991、rs12980275、rs8105790、rs11881222、rs8103142、rs28416813、rs4803219、rs8099917、rs7248668、rs10853728、rs4803223、rs12980602、rs4803224：(SNP编号1～55：参考表1、3)、序列编号59所示的存在于多核苷酸内的基因多态性。

上述rs编号所示的基因多态性表示SNP。

另外，序列编号59是人基因组中存在的编码IL28B的基因及包含其周边的序列的一个示例。

另外，IL28B是在2条染色体中的所谓反义链中载有的基因。

另一方面，表3中等位基因利用染色体的有义链来表现。

因此，序列编号59内存在的4个SNP(rs11881222、rs8103142、rs28416813、rs4803219)的主要等位基因的记载(被图2、3的框包围的部分)与表3所示的主要等位基因互补。

上述“基因多态性”是与普通基因型不同的基因型，其频率是指群体的1％以上，不仅包括SNP，还包括除了1个至数个核苷酸的缺失、替代、添加和/或插入等变异之外的VNTR(variable number of tandemrepeat：可变数目串联重复序列)或STRP(short tandem repeatpolymorphism：短串联重复序列多态性)等，也包括重复多态性部分的一部分经缺失、替代、添加和/或插入等变异后的基因多态性。

这样的SNP以外的基因多态性也包含于本发明的标记物是由于以下原因：在序列编号59所示的多核苷酸的启动子区有时会存在缺失数个核苷酸的情况，可以看到该缺失与上述SNP中的一部分SNP的风险等位基因的连锁，很有可能会被认为是与对C型肝炎治疗的抵抗性相关的基因多态性。

具体而言，在存在于序列编号59内的、存在于IL28B基因的起始密码子上游的启动子区的“TATA的重复序列(-595～-568位)”(图2中被框包围的第300号～第327号的序列)中，有时可以看到缺失4个，而且可以看到，该缺失与上述SNP中P值非常低的rs11881222、rs8103142、rs28416813、rs4803219的低频等位基因(风险等位基因)的连锁。

另外，“序列编号59所示的存在于多核苷酸内的基因多态性”是“序列编号59所示的存在于多核苷酸内的各种基因多态性中，除上述列举的SNP之外的基因多态性”，是指其它的公知或未知的SNP以外的基因多态性。

包含上述基因多态性是由于认为：上述SNP大多存在于序列编号59的多核苷酸区域内，因此，序列编号59本身与C型肝炎的治疗效果相关的可能性高，如果为该区域内的基因多态性，则与C型肝炎的治疗效果预测相关的可能性高。

另外，包含“序列编号59所示的存在于多核苷酸内的基因多态性”的本发明的标记物中，当然也包括序列编号59所示的多核苷酸中(表示基因多态性部分以外的)1个至数个核苷酸经缺失、替代、添加和/或插入后的寡核苷酸或多核苷酸。

原则而言，序列编号59所示的基因是存在于人基因组中的编码IL28B的基因及包含其周围的序列的一个示例(染色体的反义链)，这是因为在人基因组上这些变异体(缺失、替代、添加和/或插入)的存在因人而异。

另外，表示上述SNP的数值(rs编号)或序列表中记载的序列酌量了NCBI的数据库(Build 35)中公开的人的基因信息。

在上述中，认为

rs955155、rs12972991、rs12980275、rs8105790、rs11881222、rs8103142、rs28416813、rs4803219、rs8099917、rs7248668、rs10853728：(SNP编号42～52：参照表3)

的11SNPs的作为治疗效果的重要指标的所谓P值(P value)小(＝“-log P”大)，在C型肝炎的治疗效果中容易出现差别，因此优选作为标记物，其中，

rs8105790、rs11881222、rs8103142、rs28416813、rs4803219、rs8099917、rs7248668：(SNP编号45～51：参照表3)

的7SNPs满足全基因组关联研究的有意义水平(Bonferroni criterion P＜8.05×10^-8(0.05/621,220))，并且存在于相同的单倍型块(haploblock)内，因此特别优选作为重要的标记物。

P值与有意义的概率意思相同，是用于表示统计学检验的有意义性的概率值。

除此之外，包含序列编号59所示的存在于多核苷酸内的基因多态性的寡核苷酸或多核苷酸作为优选的标记物的一个示例被列举。

选择包含序列编号59所示的存在于多核苷酸内的基因多态性的寡核苷酸或多核苷酸作为优选的标记物的一例是由于如下原因：如上所述，序列59所示的多核苷酸即IL28B区域内及其附近发现了SNP编号1～55的SNP中的大多数(SNP编号42～55)。

SNP等的基因多态性连锁的情况很多，因此并不是仅1个SNP等基因多态性而是组合相邻并连锁的多个SNP等基因多态性，而在制作单倍体型后来进行研究是非常重要的。这是因为：例如通过将表现该标记物(基因)内的单倍体型的tag(代表)SNP等基因多态性组合来进行验证，C型肝炎的治疗效果的预测很可能进一步变得高效且可靠。

这些包含寡核苷酸或多核苷酸的C型肝炎的治疗效果预测标记物可以利用从患者样品采集以及根据需要精制而得的寡核苷酸或多核苷酸，但当所得样品中存在的基因或基因片段为mRNA时，可以用逆转录酶制备cDNA，作为C型肝炎的治疗效果的标记物使用。

《标记物的大小》

作为上述本发明的标记物的寡核苷酸或多核苷酸的大小，优选为～40k碱基长(或碱基对(bp))，更优选为～16k碱基长(或bp)，再更优选为1500～3000碱基长(或bp)。

《标记物的种类》

包含选自上述的1种或2种以上的基因多态性的、存在于人基因组上的寡核苷酸或多核苷酸只要是包含至少1种的基因多态性的寡核苷酸或多核苷酸即可，多个基因多态性可以存在于1个寡核苷酸或多核苷酸中，也可以分散存在于多个寡核苷酸或多核苷酸中。

《成为利用标记物预测治疗效果的对象的治疗方法》

成为使用本发明的用于预测C型肝炎的治疗效果的标记物来预测治疗效果的对象的具体的治疗方法，可以举出IFN单独疗法、PEG化IFN单独疗法、PEG化IFN/RBV(2剂并用)疗法、PEG化IFN/RBV/其他的药剂(3剂或4剂并用)疗法等使用了IFN或PEG化IFN的治疗等。

这是因为：本发明的标记物是从2剂并用疗法的实际结果发现的，然而有报告指出，这些标记物中的若干个存在于IL28B蛋白质的基因区域，该IL28B通过ISG(interferon-stimulated genes，干扰素刺激基因)诱导及TLR(Toll-Like Receptor，Toll样受体)发挥抗病毒效果(Ank，N.等.J Immunol 180，2474-2485(2008)；Marcello，T.等.Gastroenterology131，1887-1898(2006))，因此对于以IFN为基础的治疗整体产生影响的可能性高，在使用了IFN的治疗方法的效果确认中有用的可能性非常高。

在本发明的标记物包含的基因多态性中，在IL28B区域内及其周边存在的SNP(SNP编号42～55)或其他基因多态性的上述可能性特别高。

另外，使用了“PEG化IFN/RBV/其他的药剂1种或2种”的3剂并用疗法或4剂并用疗法是以PEG化IFN/RBV2剂并用疗法为基础的治疗法，这是指，其是PEG化IFN/RBV2剂并用疗法的一种。

但是，当本发明的标记物包含除上述IL28B关联寡(或多)核苷酸之外的编码蛋白质的区域时，有可能在除了IFN以外的其他的C型肝炎治疗药的效果判定中也能够使用。

这是由于这些基因多态性所编码的蛋白质本身有可能与C型肝炎相关。

[本发明的寡核苷酸或多核苷酸、或其标识物]

本发明的“寡核苷酸或多核苷酸、或其标识物”与含有选自上述基因多态性中1种或2种以上的人基因组上存在的寡核苷酸或多核苷酸杂交。

“上述的基因多态性”是指本发明的标记物中包含的各种基因多态性。

这些寡核苷酸或多核苷酸、或其标识物具有在含有上述基因多态性的区域杂交的性质，因此，在预测C型肝炎的治疗效果时，可以作为从扩增患者样品中的基因时使用的引物或扩增后的基因中钓取本发明的预测标记物用的探针来使用。

标识物是指通过使其与探针或引物等结合，可以容易地检测出目标标记物基因。

作为标识物，可列举如生物素、地高辛配基(digoxigenin)、放射性标识、酶标识、荧光标识等。

[本发明的探针]

本发明的探针含有上述本发明的寡核苷酸或多核苷酸、或其标识物。

标识物对寡核苷酸或多核苷酸的结合可以通过公知的方法来进行。

《探针的定义》

探针用于钓取特定的寡核苷酸或多核苷酸(在本申请中，相当于包含基因多态性的标记物)，与成为检测目标的寡(或多)核苷酸进行特异性杂交。

探针的序列优选与目标碱基序列完全形成互补对，但杂交程度只要与完全的互补对具有同源性即可。

《探针的作用》

本发明的探针可以在预测C型肝炎的治疗效果时，用于检测相当于标记物的寡(或多)核苷酸。

《探针的确定方法》

可以对照成为检测目标的寡(或多)核苷酸(标记物)的碱基序列，以与其进行杂交的方式，对探针进行适当设计。

《探针的大小》

探针的大小根据成为检测目标的寡(或多)核苷酸而不同，不能一概而论，例如为～1000碱基长，优选为5～500碱基长，更优选10～40碱基长左右即可。

另外，通常作为探针，从核酸分子的稳定性方面等考虑，适合使用DNA，但在使用实时PCR法之一的循环探针(cycling probe)法来扩增目标时，使用嵌合探针(chimeric probe)。

《探针的示例》

作为具体的探针，例如当作为检测目标的寡(或多)核苷酸为IL28B关联寡(或多)核苷酸时，可列举如下表3所示的探针。

[本发明的引物]

本发明的引物含有上述本发明的寡核苷酸或多核苷酸、或其标识物。

《引物的定义》

引物是在扩增特定的寡核苷酸或多核苷酸(本申请中，相当于包含基因多态性的标记物)时使用，是指与成为检测目标的寡(或多)核苷酸的反义链及有义链的3’末端分别特异性杂交的同义(正向)引物和反义(反向)引物。

引物的序列优选与目标碱基序列完全形成互补对，但与目标的杂交程度只要与完全的互补对具有同源性即可。

《引物的作用》

本发明的引物能够用于在预测C型肝炎的治疗效果时，使样品中与标记物相当的寡(或多)核苷酸增幅、检测容易进行。

《引物的确定方法》

可以对照成为检测目标的寡(或多)核苷酸(标记物)的末端碱基序列，适当设计引物。

《引物的大小》

引物的大小根据成为检测目标的寡(或多)核苷酸而不同，不能一概而论，例如为5～100碱基长，优选为10～70碱基长，更优选15～50碱基长左右即可。

另外，通常作为引物，从核酸分子的稳定性方面等考虑，适合使用DNA，但在等温基因扩增法(ICAN法)中使用嵌合引物。

《引物的示例》

作为具体的引物，例如当作为检测目标的寡(或多)核苷酸为IL28B关联寡(或多)核苷酸时，可列举如下表3所示的引物。

[本发明的C型肝炎的治疗效果预测用试剂盒]

本发明的C型肝炎的治疗效果预测用试剂盒的特征在于，包含上述本发明的探针和/或引物。

《试剂盒的作用》

C型肝炎的治疗效果预测用试剂盒是用于预测C型肝炎的治疗效果的试剂盒。

《试剂盒的构成要素》

本发明的试剂盒中可列举如探针、引物、其他的PCR中必要的试剂(耐热性DNA聚合酶)，基因型分型中一般必需的装置、试剂、软件、计算机等，可以选择这些中适当、必需的。

[本发明的预测C型肝炎的治疗效果的方法]

本发明的预测C型肝炎的治疗效果的方法的特征在于，具有下述(1)及(2)的工序。

(1)根据从患者得到的样品，确定下述(X)的基因型的工序；

(X)上述基因多态性中的至少1种

(X)中，“上述基因多态性”是指本发明的标记物中包含的各种基因多态性。

另外，(X)中包含的“序列编号59所示的存在于多核苷酸内的基因多态性”是指除上述SNP以外的在序列编号59的多核苷酸内存在的、包括其他公知或未知的SNP以外的基因多态性(包括多态性部分的缺失、替代、添加和/或插入)的基因多态性。

这是由于：如果是SNP集中的序列编号59的多核苷酸区域内的基因多态性，则与C型肝炎的治疗效果相关的可能性高。

《患者的定义》

患者是指感染C型肝炎或疑似感染的患者，除人之外包括黑猩猩或人肝细胞移植嵌合体小鼠等，但由于本发明的标记物是利用以人为对象的GWAS而得到的，因此优选人。

《来自患者的样品收集方法》

从上述患者采集例如如下所列举的样品。

《样品的定义》

样品是指血液、血清、淋巴液、精液、尿、唾液(含有口腔粘膜细胞)、其他体液以及机体组织等，由于血液(淋巴细胞)最容易采集、侵袭性低，因此优选。

《来自样品的寡(或多)核苷酸或蛋白质的制备》

由上述样品制备寡(或多)核苷酸。作为寡(或多)核苷酸，可列举如以基因组DNA或mRNA为基础利用逆转录酶而制备的cDNA等。

另外，当基因多态性伴随氨基酸替代时，使用以上述核酸为基础而获得的蛋白质也可以进行基因型的确认。

寡(或多)核苷酸的制备利用公知的方法进行即可，但当寡(或多)核苷酸为DNA时，可以例如从作为样品的血液中的淋巴细胞或粒细胞等血细胞，通过盐析、PCI(酚氯仿提取)法、使用市售的DNA提取试剂盒等的方法、其他公知的方法来进行。

另外，当寡(或多)核苷酸为mRNA时，可以使用在PCI法中将溶液变为酸性从水层提取的方法、利用Oligo-dT柱等的方法、使用市售的RNA提取试剂盒的方法、其他公知的方法。

《核酸的扩增》

当从样品获得的核酸的量少时，可以根据需要利用公知的方法进行扩增。

当核酸为DNA时，可以使用PCR法等。

当核酸为mRNA时，可以使用RT-PCR法。

另外，作为定量PCR法，也可以使用利用了TaqMan探针或SYBR绿(Power SYBR)的实时PCR法等。

《基因型的确定方法》

使用所得核酸确定基因多态性部分的基因型。

基因型的确定方法可以使用公知的序列确定法等，例如除了使用测序仪等确定直接碱基序列的直接测序法(双脱氧法)之外，可例举如利用RELP(限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism))的PCR-RELP法、TaqMan法、DigiTag2法、单核苷酸引物延伸法、SnaPshot法(ABI)，ASP-PCR法、PCR-SSO(聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸(sequence specific oligonucleotide))法、PCR-SSP(聚合酶链反应-序列特异性引物(specific sequence primer))法、PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性分析(single-strandedconformational polymorphism analysis))法、利用电泳等的核酸长度的确认以及使用DNA芯片等基因多态性检测用仪器等的方法等，但并不限定于这些方法。

《利用基因型的治疗效果的预测方法》

根据上述获得的基因型的信息，参考后述的表1～表3等，从而可以预测C型肝炎的治疗效果。

即可以认为，在从患者获得的样品中，如检测到各基因多态性的风险等位基因时，则治疗效果低的可能性高，特别是越是P值低的基因多态性的风险等位基因，治疗效果低的概率越高。

《通过本发明的方法成为预测治疗效果的对象的治疗方法》

通过本发明的预测C型肝炎的治疗效果的方法而成为预测治疗效果的对象的具体的治疗方法可例举如IFN单独疗法、PEG化IFN单独疗法、PEG化IFN/RBV(2剂并用)疗法、PEG化IFN/RBV/其他药剂(3剂或4剂并用)疗法等使用了IFN或PEG化IFN的治疗等。

但是，本发明的标记物包含除上述IL28B关联寡(或多)核苷酸之外的编码蛋白质的区域时，也可以在IFN以外的其他的C型肝炎治疗药的效果的判定中使用。

这是因为这些基因多态性编码的蛋白质本身有可能与C型肝炎相关。

[本发明的C型肝炎的治疗效果预测标记物的搜索用基因]

本发明的“C型肝炎的治疗效果预测标记物的搜索用基因”的特征在于，具有下述(A)或(B)的序列。

(A)、含有序列编号59所示的多核苷酸的至少一部分的寡核苷酸或多核苷酸

(B)、(A)中1个至数个核苷酸经缺失、替代、添加和/或插入后的寡核苷酸或多核苷酸

序列编号59所示的基因是包含编码L28B的基因及其周边的序列(IL28B关联寡(或多)核苷酸)。

将其选择到标记物搜索用基因中是因为上述SNP中的多数在包含IL28B的该区域内被发现。这是由于可以认为，SNP连锁的情况很多，因此左右C型肝炎的治疗效果的未表达的基因多态性集中在该区域的可能性非常高。

也包括(B)的变异体是因为，根据患者的不同，包括编码IL28B的基因及其周边的序列通过基因多态性或其他变异等，有时会与序列编号59的情况产生多少不同。

[本发明的C型肝炎治疗药的筛选方法]

本发明的C型肝炎治疗药的筛选方法的特征在于使用下述(A)至(C)中的至少1种。

(A)、含有序列编号59所示的多核苷酸中的至少一部分的寡核苷酸或多核苷酸

(C)、存在于人基因组上的包含rs8103142的寡核苷酸或多核苷酸这是因为：作为SNP的rs8103142存在的基因所编码的蛋白质(IL28B)本身有可能与C型肝炎相关，因此含有IL28B等的rs8103142的寡(或多)核苷酸有可能在其他的C型肝炎治疗药的效果的判定中使用。

另外，作为筛选方法，可以使用选择将基因、蛋白质的表达量、蛋白质的活性增减的物质的各种公知的方法，也可以在“体内”、“体外”、“无细胞体系”等任一种实验系统下进行。

[本发明的C型肝炎的预防或治疗剂]

本发明的C型肝炎的预防或治疗剂的特征在于，包括IL28B蛋白质和/或编码其的基因。

这是因为，以纯合或杂合具有本发明的SNP标记物的低频等位基因(风险等位基因)的患者(治疗效果低的组)，与以纯合具有主要等位基因的患者(治疗效果高的组)相比，IL28的mRNA表达水平有统计学意义地下降，因此，IL28B的表达量也有统计学意义地下降的可能性高，另外，如上所述，由于IL28B本身与C型肝炎相关的可能性高等，因此认为给予IL28B或编码其的基因有助于C型肝炎治疗的可能性高。

实施例

[利用GWAS对C型肝炎的治疗效果预测]

使用安装了90万种以上的SNP分析用探针的AffymetrixGenome-Wide Human SNP Array 6.0(以下，称为SNP Array 6.0)，针对对C型慢性肝炎实施了PEG-IFN/RBV并用疗法的154人进行SNP分型，根据药剂敏感性分成亚组(GWAS阶段(GWAS Stage)：第1板(1st panel)：无效(NVR)组82人对有效(VR)组72人)，进行全基因组关联研究(GWAS)。

将选择P值为10^-5水平或其以下水平的情况的结果示于表1。

另外，P值主要通过卡方检验算出。

另外，无效组是指治疗中病毒一次也没有消失的示例。

由其结果可知，尤其是位于染色体第19号的IL28B附近的SNPs(rs12980275和rs8099917)低频等位基因而言，P值低，有助于治疗无效(表2)。

(分别为：P＝1.93×10^-13；OR＝20.3和3.11×10^-15；OR＝30.0)。

因此，使用其他的样品组，对于下述的14个SNP(序列编号42～55)进行验证。

(M)从IL28基因附近的HapMap数据获得的、包含上述2个(rs12980275和rs8099917)SNPs的11SNPs，以及

(N)通过包括IL28B的区域的序列确认的3SNPs

使用上述GWAS阶段的154人以及与其不同的利用了DigiTag2法的作为复制阶段(Replication Stage)的172人(NVR：50人对VR：122人)的第2板(2nd panel)，计算将他们合并的314人的组合(combined)的P值，将结果示于表3。

合计为314人是因为：GWAS阶段的154人中，质量控制呼叫率(QCcall rate)未满95％的12人(NVR：4人+VR：8人)被从GWAS阶段排除，加到复制阶段的172人中。

质量控制呼叫率(QC call rat)是指可能分析SNP的比例。

将其结果示于表3。

表3所示的多个SNPs的P＝10^-5以下，与治疗无效相关。

这些14SNPs的验证结果显示，除了rs12980275(SNP44)及rs8099917(SNP50)之外，位于IL28B的9SNPs(rs955155(SNP42)、rs12972991(SNP43)、rs8105790(SNP45)、rs11881222(SNP46)、rs8103142(SNP47)、rs28416813(SNP48)、rs480321(SNP49)、rs7248668(SNP51)、rs10853728(SNP52))尤其与C型肝炎的治疗无效紧密相关。

另外，在上述验证中，以GWAS数据的确认(Validation)以及复制(Replication)为目的，使用DigiTag2法确定了SNP的基因型。

DigiTag2法是对成为分析对象的每个SNP使用SNP特异的普通探针(common probe)以及等位基因特异的信息探针(query probe)可以一次性对多处的SNP确定基因型的多重SNP分型法的一种(AnalyticalBiochemistry vol.364，No.1，2007，P.78-85等)。

检测用探针分为与SNP位置邻接、存在于下游的3′侧探针(普通探针)及在3′末端包含SNP、存在于上游的5′侧探针′(信息探针)。

信息探针对每个SNP准备与等位基因对应的2种。根据与信息探针的3′末端对应的SNP的基因型，仅具有与其互补碱基的信息探针才可以与在3′侧邻接存在的普通探针相结合。

在反义链设计的信息探针成为与NCBI数据库的Fasta序列(Fastasequence)相同的碱基序列，在有义链设计时，成为互补的碱基序列。

另外，为了检测，在各信息探针的5′末端连接有与等位基因对应的2种的查询标签(query tag)，另外在普通探针的3′末端连接有每个SNP不同的普通标签(common tag)。

使用DNA芯片进行检测。其中，该DNA芯片固定了具有与连接到普通探针的普通标签相互补的碱基序列的寡聚DNA。与检测体的基因型相对应生成的信息探针与普通探针的结合产物被具有与DNA芯片上的普通标签相互补的碱基序列的寡聚DNA捕获。对应于与等位基因相应的查询标签，导入2种荧光分子，从而确定各SNP的基因型。

[表1]

[表2]

另外，表2中的a是指引自Nishida，N.等Evaluating the performance ofAffymetrix SNP Array 6.0platform with 400Japanese individuals.BMCGenomics 9，431(2008)的日本人健康正常者184人中的各SNP的低频等位基因的频率(MAF：Minor Allele Frequency)。

表2中的b是指从显性模型中的2×2列联表获得的低频等位基因的优势比(odds ratio)，将某种疾病发生的风险设为X时，优势比如下所示。

Odds＝X(1-X)

表2中c是指显性效应模型中的通过泊松(Pearson)的卡方检验算出的P值。

[表3]

另外，在该表3中，等位基因利用染色体的有义链来表示。

因此，实际上载有IL28B基因的利用反义链所表示的序列编号59与该表3中rs11881222、rs8103142、rs28416813及rs4803219的4SNPs的主要等位基因相互补(参考图2、3中被框包围的部分)。

表3中的“SNP型”指如下的意思。

gSNP：基因组SNP(genomic SNP)，位于表达基因区域以外的区域的SNP

iSNP：内含子SNP，位于内含子区域的SNP

nsSNP：非同义SNP，在翻译区域内、产生氨基酸替代的SNP

rSNP：调节SNP，位于表达基因的启动子区中的SNP

另外，如表3所示，将具体的引物或探针的序列作为序列编号1～58进行了示例，但本发明的引物或探针不受这些限制，这些序列中的1个至数个核苷酸经缺失、替代、添加和/或插入后的且能与本发明的标记物进行杂交的序列当然也包含在本发明的引物或探针中。

另外，表3的引物或探针是如序列表中也表示的DNA，但也可以是具有相同碱基的RNA、DNA与RNA的嵌合体。然而从稳定性等的方面出发，优选DNA。

由上述表1～3等可知，可以说本发明的标记物与以往的C型肝炎的治疗效果预测标记物相比较，P值非常小，预测准确率高。

其中，表3中所示的SNP编号42～52的11SNPs的P值特别小，其中，SNP45～51的7SNPs的P值非常小，它们的预测准确率非常高。

[C型肝炎的预防或治疗剂]

从以纯合或杂合具有SNP编号42～51的低频等位基因(风险等位基因)的患者10人(主要是在PEG-IFN/RBV并用疗法中治疗无效的患者：NVR)及以纯合具有主要等位基因的患者10人(主要是在PEG-IFN/RBV并用疗法中治疗有效的患者：VR)的治疗前的末梢血单核细胞分别提取RNA，通过实时RT-PCR法验证IL28mRNA水平，将结果示于图1。

由图1可知，与以纯合具有主要等位基因的组(主要为VR)相比，以纯合或杂合具有低频等位基因的组(主要为NVR)中，IL28的mRNA表达水平有统计学意义地下降，因此IL28B的表达量也有统计学意义地下降的可能性高。

即，这种情况意味着IL28B或其基因等作为C型肝炎的预防或治疗剂起作用的可能性高。

产业上利用的可能性

本发明中，可以对C型肝炎的治疗效果进行精度更高的预测，特别是在“IFN疗法”中，尤其是在该疗法中近来成为主流的“PEG化IFN/RBV并用疗法”中可以进行以往没有的正确预测，因此对于临床意义重大。

序列表自由内容

(序列编号59中，小写字母表示非翻译区域，大写字母表示翻译区域的DNA。)

序列编号1：用于SNP42的同义引物：5′TATAAAGAAAAGGACAGGCCACTTTGGTACGCCAA 3′

序列编号2：用于SNP42的反义引物：5′TAACCTCTCTGAGTACCAGCTTCTTCATTTTCAAGGTAGAA 3′

序列编号3：用于SNP43的同义引物：5′TGGGTTGTCCACCTGGACCCAATGTCATCACAAAA 3′

序列编号4：用于SNP43的反义引物：5′GGAGGGAAGGAAGTTCTGACACATGCTACAATAAAAATGAA 3′

序列编号5：用于SNP44，45，46的同义引物：5′GTCAGCCATCCTCCAATCCCATCAGAGTGGTCTAA 3′

序列编号6：用于SNP44，45，46的反义引物：5′TCTCAGGTTGCATGACTGGCGGAAGGGTCAGACACA 3′

序列编号7：用于SNP47，48，49的同义引物：5′TCAGTTTCTCTTTCCCTCCAGCTGCTCATCTGGCTCA 3′

序列编号8：用于SNP47，48，49的反义引物：5′GAGGGACAATGGAGAAGGAGAAGGTGAAGGGGCCA 3′

序列编号9：用于SNP50，51的同义引物：5′CCAACAAAGTGAGACTGCATCTCTGGGGAAAAAAA 3′

序列编号10：用于SNP50，51的反义引物：5′AGTAACACTTGTTCCTTGTAAAAGATTCCATCCATACAAAAA 3′

序列编号11：用于SNP52的同义引物：5′CGCAGCTCTGAACAAGATCTTGTTTCTTGGAAAAGTCA 3′

序列编号12：用于SNP52的反义引物：5′TGGGTAAAGTAATGAAGCAACAGCCGCTTTCCTAA 3′

序列编号13：用于SNP53的同义引物：5′TGGCCAACGTGGTGAAACCCCATCTGTACTAAAAATA 3′

序列编号14：用于SNP53的反义引物：5′TTCTTACAATTGCACGTGAATCCACAATTATGTCAAAGTA 3′

序列编号15：用于SNP54，55的同义引物：5′ATATCCTGTTTTACTTACATTGAGTGTGTGTGCAGATGAA 3′

序列编号16：用于SNP54，55的反义引物：5′ATACACACACAAAACAGTAGTTGAGAAAAACATGTCTGTA 3′

序列编号17：用于SNP42的信息探针：5′ATTTTGTGTATTTTGTTCTCTGC 3′

序列编号18：用于SNP42的信息探针：5′GAATTTTGTGTATTTTGTTCTCTGT 3′

序列编号19：用于SNP43的信息探针：5′ATGCTGTATGATTCCCCCTA3′

序列编号20：用于SNP43的信息探针：5′GCTGTATGATTCCCCCTC 3′

序列编号21：用于SNP44的信息探针：5′GAGAAGTCAAATTCCTAGAAACA 3′

序列编号22：用于SNP44的信息探针：5′AGAAGTCAAATTCCTAGAAACG 3′

序列编号23：用于SNP45的信息探针：5′CGGAAGATGTAACCACAGAAG 3′

序列编号24：用于SNP45的信息探针：5′CGGAAGATGTAACCACAGAAA 3′

序列编号25：用于SNP46的信息探针：5′AGCCAGTGTGGTCAGGTA 3′

序列编号26：用于SNP46的信息探针：5′CCAGTGTGGTCAGGTG 3′

序列编号27：用于SNP47的信息探针：5′TCTGCTGAAGGACTGCAG 3′

序列编号28：用于SNP47的信息探针：5′TCTGCTGAAGGACTGCAA 3′

序列编号29：用于SNP48的信息探针：5′GTGGGCAGCCTCTG 3′

序列编号30：用于SNP48的信息探针：5′GTGGGCAGCCTCTC 3′

序列编号31：用于SNP49的信息探针：5′CTGCCCTTCTGTCAGG 3′

序列编号32：用于SNP49的信息探针：5′ACTGCCCTTCTGTCAGA 3′

序列编号33：用于SNP50的信息探针：5′GGTTCCAATTTGGGTGAC 3′

序列编号34：用于SNP50的信息探针：5′GGTTCCAATTTGGGTGAA 3′

序列编号35：用于SNP51的信息探针：5′TGTGCCACTACTATGCTCT 3′

序列编号36：用于SNP51的信息探针：5′TGCCACTACTATGCTCC 3′

序列编号37：用于SNP52的信息探针：5′CATCCTCACCAAAGCTTAG3′

序列编号38：用于SNP52的信息探针：5′CATCCTCACCAAAGCTTAC3′

序列编号39：用于SNP53的信息探针：5′CCTAAATATGATTTCCTAAATCATACA 3′

序列编号40：用于SNP53的信息探针：5′CCTAAATATGATTTCCTAAATCATACG 3′

序列编号41：用于SNP54的信息探针：5′TGTCTCAGACGAGCTG 3′

序列编号42：用于SNP54的信息探针：5′GTGTCTCAGACGAGCTA 3′

序列编号43：用于SNP55的信息探针：5′AGAATTATCTGGGCATGC 3′

序列编号44：用于SNP55的信息探针：5′AGAATTATCTGGGCATGG 3′

序列编号45：用于SNP42的普通探针：5′TGGGCCCTCAGTGCACAGGAC 3′

序列编号46：用于SNP43的普通探针：5′CATGAGGTGCTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAAAC 3′

序列编号47：用于SNP44的普通探针：5′GACGTGTCTAAATATTTGCCGGGGTAGCG 3′

序列编号48：用于SNP45的普通探针：5′CAGGACATTGGAGTGATGTCAGGAAGGG 3′

序列编号49：用于SNP46的普通探针：5′GGAGCAGAGGGAAGGGGTAGCAG 3′

序列编号50：用于SNP47的普通探针：5′GTGCCGCTCCCGCCTCTTCC3′

序列编号51：用于SNP48的普通探针：5′CATTCCCTCAGCTCCCTTTCTCTCTGTGACACA 3′

序列编号52：用于SNP49的普通探针：5′GATAAAAGCTGCCCCATGGAGCTCAGG 3′

序列编号53：用于SNP50的普通探针：5′ATTGCTCACAGAAAGGAAAACAAAAGGAGGAAC 3′

序列编号54：用于SNP51的普通探针：5′AGCTTGGGCTACAGACTGAGACCAT 3′

序列编号55：用于SNP52的普通探针：5′GCCCACATCTCCCAGGCTGCT 3′

序列编号56：用于SNP53的普通探针：5′GACATATTTCCTTGGGAGCTATACATGCATTATGCA 3′

序列编号57：用于SNP54的普通探针：5′TCTCTGGCTTTCATATTGTTATATGAATATAATATTTATT 3′

序列编号58：用于SNP55的普通探针：5′TGGTGGGTGCCTGCAGCTCC3′

序列编号59：人19号染色体的44425112-44428451位：5′attaagaaatattggcctctgggcatggtggctcacactgaaatcccagcaatttgggaggcctagacagagagatgacttgacatcaggaatttgagaccagccttgccaacatggtgaaacgccatctctactaaaaatataaaaattagctgggaatggtggcacaaatctgtaatctcagctacttgggaggctaaggcaagagaattgcttgaacccaggaggcggaggttgcagttagccaagattttgcactgcactccagcctgggtgaccgaacaagaccctgtctcaaaatatatatatatatatatatatatatatgccaggagtggtggctcaggcctgtaatctcagcactttaataggctgggtgaggaggatggcttgagcccaggagtttgaggctgcagtgagctgtgatcatgccattgcactgcagtgacagagtgagaccctgtcttaaacaacaacaaaaccagagcaggtggaatcctcttgggaacataccttcctgtaggttacccctgagtctccatcagtttctctttccctccagctgctcatctggctcactagccctgccctgctctgggctttcccagcctggggctcccctggtggccggtgtcttacctgaggctgtgttttcacttttcctacatcagctgggactgcccttctgtcagggataaaagctgccccatggagctcaggcaggaattacatcccagacagagctcaaaactgacagaaagagtcaaagccaggacacagtctgagatccagaagaggggactgaaaagaacagagactccagacaagacccaaacagaccctgggtgacagcctcagagtgtttcttctgctgacaaagaccagagatcaggaATGAAACTAGgtgagtcccacatctctgtccgtgctcagctcctgcagcccctgccctcagtgggcagcctctgcattccctcagctccctttctctctgtgacacagACATGACCGGGGACTGCATGCCAGTGCTGGTGCTGATGGCCGCAGTGCTGACCGTGACTGGAGCAGTTCCTGTCGCCAGGCTCCGCGGGGCTCTCCCGGATGCAAGGGGCTGCCACATAGCCCAGTTCAAGTCCCTGTCTCCACAGGAGCTGCAGGCCTTTAAGAGGGCCAAAGATGCCTTAgtgagtctccccctgccctcctgccatggactagcctccacccgcactccaagggtcaccatgctttcccactcccagcttccttcactgggctagcctccaccctccctgcagtgggctatctcatgctcctactgcagggactgactcatgttttcctgaagaagagggtcctctaccatcctcccagcagttaacctcccctatcctgttgtcagccatcctccaatcccatcagagtggtctaacctccacccctcctgctggggctaacctgtgcctttgctgtctagGAAGAGTCGCTTCTGCTGAAGGACTGCAAGTGCCGCTCCCGCCTCTTCCCCAGGACCTGGGACCTGAGGCAGCTGCAGgtgagagggggagtcaggcccacccctgccctcccagccctgctcacctggctctgtagtggccccttcaccttctccttctccattgtccctctctcctctccccacacctgctaccccttccctctgctcctacctgaccacactggctgtgccctctcccctgtgcctgtcaccttcacttgttcctctctatcctcctcccccaacctgttcccctcacctcccccctcacctgctctttctcacctctcctcagGTGAGGGAGCGCCCCGTGGCTTTGGAGGCTGAGCTGGCCCTGACGCTGAAGGTTCTGGAGGCCACCGCTGACACTGACCCAGCCCTGGGGGATGTCTTGGACCAGCCCCTTCACACCCTGCACCATATCCTCTCCCAGCTCCGGGCCTGTgtgagtcgtcagggcccgggcacccaggtctgtgagctctgagcagcgtccttcccctggccaaggccccggctcacacaccgccctcctctgcccacagATCCAGCCTCAGCCCACGGCAGGGCCCAGGACCCGGGGCCGCCTCCACCATTGGCTGCACCGGCTCCAGGAGGCCCCAAAAAAGgtgagtgacccgggaagagagggactgaggtctggggagccactgggagcccagaacccagacagcccctgacccatcccctcctccctacagGAGTCCCCTGGCTGCCTCGAGGCCTCTGTCACCTTCAACCTCTTCCGCCTCCTCACGCGAGACCTGAATTGTGTTGCCAGCGGGGACCTGTGTGTCTGAcccttccgccagtcatgcaacctgagattttatttataaattagccacttggcttaatttattgtcacccagtcgctatttatgtatttgtgtatgtaaatccaactcacctccaggaaaatgtttatttttctactttttgaaatccttgttgaaataaacaatgaggaaaagacacccatgacgtgggactgtgtgtgcgttggtgtgtatttcctttgcattgctgccataacaaattaccctaaaagtagcatctagaacagcaggttcattgagtctgtgctgtccactggggtccccaggtcacatgtcactatcgagcacctggaatgtaggtggtgcaacctcattttttcagtgagtgtaaaacataccccagaatttgaagatttactgtggagaaaaaaaaaaaagtaaaacagcttaattataatttatatattcattagatgttgaaatgatagcactttggatgtattgggtgaaatgaagcatctttaaaattaatttagagcctggatgtgattgctcaagcctgtaatcacagcactttgggtggctgagttgggaggatcacttgagcccagaccagcctgggcaacatagcaagatcctgtctctataaaaaattagagaattggctgggtgtggtggcacaagcccataatcccagctactggtggaagctgagatgggaggactgtttgaggtcaggagttcacgaccagcctgagcaacagcaagatcctgtctcttgcgtgatcacatctcactgtagcctcaaactcctgggctcaagtgattctctctcctcggcaccatcctccaccctctccagcccctccccgaactgggattacaggcttgagtcaccgggtccagcccattctctttccaagaagcccctgaattgtataagcaaacatgaggtctcactaaccctggataagcccctacagatgaggaggacaacttggatcagggacccctgctgagt 3′