CN102816838A

CN102816838A - 用于检测丙型肝炎患者il28b snp12980275多态性的试剂盒

Info

Publication number: CN102816838A
Application number: CN2012102340846A
Authority: CN
Inventors: 李文静; 徐建成; 王淑一; 孙翠莲
Original assignee: JILIN ADICON CLINICAL LABORATORY Co Ltd
Current assignee: JILIN ADICON CLINICAL LABORATORY Co Ltd
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2012-12-12

Abstract

本发明公开了用于检测丙型肝炎患者IL28BSNP12980275多态性的试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、检测体系PCR反应液,其特征在于：检测体系PCR反应液包括dNTP，用于PCR反应的Tag酶及其缓冲反应液、检测IL28Brs12980275多态性用上下游引物，其中，IL28B上游引物序列：GTAGGGGGAATCATACAGCATT；IL28B下游引物序列：GAGAGTTCTGGAGATTGCTTGC。通过使用针对IL28BSNP位点rs12980275的特异性引物进行检测，具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。

Description

用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种临床检验用途的基因检测试剂盒，采用基因测序技术，对IL28B SNP rs12980275多态性位点进行检测，可以用于预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果。

背景技术

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的肝脏急慢性炎症，自从1989年被美国发现以来，HCV感染逐渐成为一个世界性公卫生问题。我国感染者约有4200万人，每年的新发病例约300-400万。80%感染者会发展成慢性肝炎，30%进展为终末期肝病，包括肝硬化、肝癌等。目前临床上主要是应用干扰素合用利巴韦林来进行丙肝的治疗，但是这种联合治疗方案，不同的病人对这种联合治疗应答的效果差异很大。

IL28B基因编码IFN-λ3，为Ⅲ型干扰素，位于19号染色体上，包含6个外显子，属于IFN-λs家族。IFN-λ主要是通过JAK-STAT信号途径，诱导STAT1和STAT2的磷酸化,使ISGF3复合物产生，而且使2'，5'-寡腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylatesynthetase,OAS)基因家族和MxA(也称Mx1)蛋白的表达明显提高，从而其抗病毒效应才发挥出来。2009年，美国杜克大学Goldstein等研究发现，编码IFNλ3的IL28B基因附近有一些单核苷酸多态性(SNP)位点与HCV病毒自发清除能力及对干扰素的应答有关。当这些等位基因发生突变后，患者的丙肝病毒自发清除和对干扰素应答能力发生明显变化。

近期在欧洲人群和非洲人群之间进行的针对1型丙型肝炎基因组范围相关性研究中发现，其单核苷酸多态性（SNP）位点rs12979860，rs12980275，rs8099917等的变异与病毒的清除和干扰素治疗的应答高度相关，而位于IL28B基因下游3kb位置上的rs12980275位点和治疗无应答(NVR)也密切相关。有报道指出IL28B SNP位点rs12980275基因型为AA的患者的持续病毒学应答（sustained virological response，SVR）百分比明显高于GG基因型患者。通过研究rs12980275位点的基因多态性，从而进一步完善临床对患者的丙肝病毒自发清除能力及丙型肝炎治疗效果的评估。

目前可用SNP多态性检测的方法有限制性片段长度多态性（sscp）,基因测序，荧光定量PCR等，sscp技术相对简单，但酶切位点易受基因变异影响，影响结果判断。本发明考虑到节约成本及时间等因素，选用基因测序法检测IL28B基因多态性位点rs12980275。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒，可用于检测rs12980275位点是否发生突变。

用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、检测体系PCR反应液,其特征在于：

检测体系PCR反应液包括dNTP，用于PCR反应的Tag酶及其缓冲反应液、检测IL28Brs12980275多态性用上下游引物，其中，

IL28B上游引物序列：GTAGGGGGAATCATACAGCATT

IL28B下游引物序列：GAGAGTTCTGGAGATTGCTTGC。

进一步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

(i)采集待测血液样本，提取DNA；

(ii)以该DNA为模板，用IL28B上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物；

(ⅲ)对PCR反应产物测序，与IL28B正常基因序列进行比较，确定是否存在突变位点。

优选地，步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增：94℃5min；98℃10s、58℃20s、68℃2min、40个循环。

本发明通过设计一对与IL28B基因特异结合的引物,扩增片段包括SNP12980275序列。采用聚合酶链式反应（PCR）技术,对特定核苷酸片断进行指数扩增,并以扩增出的高浓度目的基因进行基因测序，检测IL28B SNP位点rs12980275多态性，该位点的基因型有AA，AG及GG三种。

本发明引物通过如下的方案进行设计：

使用Primer 6.0r软件协助设计引物，通过PCR扩增，将IL28B rs12980275多态性位点位点完全扩增，然后进行直接测序，通过测序检测rs12980275位点是否发生突变。

IL28B上游引物序列：GTAGGGGGAATCATACAGCATT

IL28B下游引物序列：GAGAGTTCTGGAGATTGCTTGC

用上述设计的引物对送检样本进行PCR扩增，并对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以精确的检测IL28B SNP位点rs 12980275多态性。

本发明的有益效果：通过使用针对IL28B SNP位点rs12980275的特异性引物进行检测，具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。

附图说明

图1是IL28B基因扩增后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳后的电泳图。其中，从左至右泳道1为TAKARA2000的Marker，泳道2-3为受检样本。

图2是样本1测序结果图。

图3是样本2测序结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒，包括

（1）红细胞裂解液；

（2）TIANGEN组织/血液/细胞基因组DNA抽提试剂盒；

（3）检测体系PCR反应液,包括dNTP，用于PCR反应的Tag酶及其缓冲反应液、检测IL28B rs12980275多态性用上下游引物，其中，

IL28B上游引物序列：GTAGGGGGAATCATACAGCATT

IL28B下游引物序列：GAGAGTTCTGGAGATTGCTTGC。

实施例2

本发明试剂盒的使用方法：

1.1抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1分钟（若离心机最高转速不允许，可3000rpm离心5min），吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。

1.2加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

1.3加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

1.4加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

1.5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

1.6向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

1.7向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

1.8向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。

1.9将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

1.10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

2）实验过程

2.1按样品数n（样品数=待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个）取预混PCR反应液每管20ul分装于反应管中。

2.2将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取2ul分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系如下：

2.3PCR条件：见下表。

Stage1:预变性 Stage2:PCR反应

2.4电泳鉴定

1.5%琼脂糖凝胶电泳，140V，20min，凝胶成像系统观察。目的片段168bp，Marker为DL2000。

2.5PCR产物纯化

被检测样本PCR扩增产物按下述条件进行第一步纯化：

加入0.5倍体积醋酸钠（PH=5.2）、3倍体积100%酒精，室温放置30分钟，12000rpm离心30min，弃上清；

加入75%酒精200ul，12000rpm离心20min，弃上清，95℃烘干1min；

加入20ul ddH₂O溶解；经NANO drop定量后，将其稀释至2-5ng/ul的浓度。

2.6测序反应

每个样本取0.2ml PCR反应管2个，分别标记上下游（双向测序），每管分别加入1μlBigdye Terminator，1μl水，酶纯化产物2μl，及上游或下游引物1μl，共5μl体系。反应条件为：95℃4分钟，95℃15秒；50℃20秒；60℃2分钟，25个循环。

2.7酒精纯化

测序反应结束，打开管盖，每管先加入2μl EDTA，静置5分钟，终止测序反应，随后加入15μl无水乙醇，13500rpm离心30分钟，离心结束倒去液体，并甩干，加入50μl75%乙醇，13500rpm离心15分钟，离心结束倒去液体，甩干，为了避免剩余酒精对后续实验的影响，需烘干。

2.8 3130基因测序仪测序

在烘干的离心管中加入10μl HiDi，振荡混匀，短暂离心收集，将液体全部转移至96空板上上机。

2.9实验结果：将测序结果同标准序列进行比对确认。

目的基因序列：IL28B（GeneBankNo.：NT_011109），划线区域是从SNP上查到rs12980275的序列。

aatgctgtatgattccccctacatgaggtgctgagagaagtcaaattcctagaaac[a/g]gacgtgtctaaatatttgccggggtagcgggaggggttaataggaagttgttgtttaatgggtacagagattcaattttgtaagatgaagagagttctggagattgcttgc。

3）数据分析

突变分析：应用DNAStar7.0软件进行序列比对分析。将测序得到的序列与NCBI中检索到的标准序列进行比对，找出突变位点，分析结果。

实施例3

临床样品检测

取待检的临床样品1和样品2，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。

每份样品加入检测体系PCR反应液中2ul，进行PCR扩增，1.5%琼脂糖电泳检测，结果如图1所示。PCR产物纯化后直接测序，将所得序列与GeneBank中的标准序列比对，判断结果。

样品1的测序结果图如图2所示，从图中可以看出，与标准序列进行比对，其基因型是AA。

样品2的测序结果图如图3所示，从图中可以看出，与标准序列进行比对，其基因型是AG。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林艾迪康医学检验所有限公司

<120> 用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtagggggaa tcatacagca tt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagagttctg gagattgctt gc 22

<210> 3

<211> 169

<212> DNA

<213> IL28B

<400> 3

aatgctgtat gattccccct acatgaggtg ctgagagaag tcaaattcct agaaacagga 60

cgtgtctaaa tatttgccgg ggtagcggga ggggttaata ggaagttgtt gtttaatggg 120

tacagagatt caattttgta agatgaagag agttctggag attgcttgc 169

Claims

1.用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、检测体系PCR反应液,其特征在于：

检测体系PCR反应液包括dNTP，用于PCR反应的Tag 酶及其缓冲反应液、检测IL28B rs12980275多态性用上下游引物，其中，

IL28B上游引物序列：GTAGGGGGAATCATACAGCATT

IL28B 下游引物序列：GAGAGTTCTGGAGATTGCTTGC。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

(i) 采集待测血液样本，提取DNA；

(ii) 以该DNA为模板，用IL28B上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物；

(ⅲ) 对PCR反应产物测序，与IL28B正常基因序列进行比较，确定是否存在突变位点。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10s、58 ℃ 20s、68 ℃ 2 min、40个循环。