CN102127603A - 丙型肝炎病毒基因分型及il28位点多态性检测试剂盒 - Google Patents
丙型肝炎病毒基因分型及il28位点多态性检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及检测丙型肝炎病毒基因型及IL28位点多态性的试剂盒，特别是涉及使用核酸反向斑点杂交技术制备一种丙型肝炎病毒基因型及IL28位点多态性检测试剂盒，该试剂盒由扩增试剂、以尼龙膜为载体的低密度芯片、杂交试剂三部分组成，可同时检测HCV基因型及与HCV治疗密切相关的IL28B基因多态性，为丙型肝炎个体化治疗提供更为可靠的依据。
Description
技术领域
本发明涉及检测丙型肝炎病毒基因型及IL28位点多态性的试剂盒，特别是涉及使用核酸反向斑点杂交技术制备一种丙型肝炎病毒基因型及IL28位点多态性检测试剂盒，本发明的试剂盒可以快速准确地区分样品中丙型肝炎病毒基因型及IL28位点多态性。
背景技术
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是严重危害人类健康的肝炎病毒之，是重要的肝脏疾病致病因子。目前，全球有超过1.7亿人感染HCV，其中每年超过10万例丙型肝炎患者发展为肝癌，进而出现消化道出血及腹水。根据WHO 2002年年报报道，在2001年，慢性肝病共引起1,400万例死亡，其中79.6万例由肝硬化引起、61.6万例由原发性肝癌引起。而在2001年，因慢性肝病引起死亡的病例中就有20％(超过2.8万)是由HCV感染引起。目前已经有大量病例可以证明在大多数国家由肝癌引起的死亡数量的增加是由于丙型肝炎感染造成。
HCV不同基因型感染者的重症化程度和几率存在明显差异，因此HCV分型检测具有重要的临床意义。研究报道在慢性HCV感染者中，与其他基因型相比，HCV 1b型感染与更严重的肝脏疾病、更迅速的疾病恶化相关(Nousbaum JB，et al.Ann Intern Med，1995，122：161-168)。Zein等(Zein NN，et al.Ann Intern Med，1996，125：634-639)发现HCV 1b基因型在肝硬化和肝脏失代偿要求肝移植的慢性活动性丙型肝炎患者中的感染率远远高于其他基因型。有证据表明，在HCV 1b感染率较高的日本，肝细胞肝癌的发生率远远高于HCV 1b感染率低的欧洲或美国，且发生时间也更早。另外，Zein等(Zein NN，et al.Ann Intern Med，1996，125：634-639)发现，在美国，感染HCV 1b基因型的患者年龄普遍高于感染其他型别的患者，HCV 1b基因型的患者感染时间更早且病程更长；相同研究结果在法国和西班牙也有报道(PolS，et al.Gastroenterology，1995，108：581-583；Davis GL，et al.Hepatology，1997，26：122S-127S)。因此，HCV 1b基因型是更严重的HCV相关性肝脏疾病的标志物。
HCV基因分型另一个重要的临床意义在于有助于预测治疗效果。丙型肝炎病毒分为急性和慢性，急性丙型肝炎虽然有部分患者可以自愈，但对所有的急性丙型肝炎患者应给予积极治疗且疗效好，其中最主要的治疗当属抗病毒治疗；慢性丙型肝炎的治疗，目前国内外公认有效的也只有干扰素。大量临床试验表明，HCV 1b及1a基因型比HCV 2型或3型对干扰素治疗的持续病毒学应答(SVR)更差(Pawlotsky JM，et al.Science，2001；292：2323-2325)。HCV2型感染患者有60-70％在干扰素治疗6个月后有应答，而HCV 1型感染者只有10-15％有应答反应。这种差别在干扰素治疗的持续性应答方面经常出现，并且不受肝脏组织学特点或治疗前HCV RNA水平的影响。相同的治疗方法对不同基因型HCV感染的治疗效果确实存在差异，检测HCV基因型将有助于HCV感染的临床诊断并预测治疗效果，为调整用药剂量及治疗时间，制定个体化抗病毒治疗方案提供指导。
此外慢性丙型肝炎患者在治疗过程中呈现很大的差异，即：个体对药物的应答程度不同。一项最新的研究表明(DL Thomas，et al.Nature.2009，461(7265)：798-801)：人体DNA(脱氧核糖核酸)分子中有一个与防感染基因IL28B相连的基因，当这一基因的碱基T被碱基C替换时，人们接受丙肝疗法的效果便会发生显著变化。研究者研究了1600多名丙肝患者后发现，碱基T被碱基C替换后，丙肝患者比没有变化的患者的治疗效果要好得多。IL28B基因该位点具有C碱基的丙肝患者80％都被治愈，而T基因的丙肝患者只有30％被治愈。这一研究结果解释了为什么有些丙肝患者的治疗效果很好，有些人却治疗无效。此前科学家一直不知道造成疗效差异的原因，将来丙肝患者可根据他们的基因来选择适当的治疗方法。
针对HCV基因型及IL28位点多态性检测目前已有一些试剂盒报道。Trugene HCV 5′NCGenotyping kit(Canada)，这一试剂盒是通过测序完成的，而测序的费用及测序对混合感染的区分能力仅能达到20％左右仍无法满足临床的要求；Inno LiPA HCV II(Innogenetics)使用的反向杂交的方法，但是病毒具有分布的区域性和民族差异，检测中国人群可能存在漏检的情况。DL Thomas检测IL28B多态性使用的是Illunina human 610-quad beadchip进行检测，即对全基因组的SNPs进行检测，检测的费用仍然是临床使用的重要考虑。
综上所述，有必要开发一种即能对HCV进行基因分型同时能对个体的治疗效果进行评估的试剂盒，通过个体化治疗提高临床疗效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测丙型肝炎病毒基因型及IL28B多态性的试剂盒，该试剂盒利用核酸反向斑点杂交技术可以快速准确的区分样品中丙型肝炎病毒基因型及患者的IL28B多态性。
为了解决上述任务，本发明的具体技术路线为：
1)利用全血进行提取，可使用商品化提取试剂盒(如：Roche的High Pure ViralNucleic Acid Kit，等)，提取的结果为RNA和DNA的混合物。
2)根据HCV基因组设计HCV基因分型的逆转录引物和PCR扩增引物，设计的引物能够包括HCV不同基因型的检测位点，IL28B多态性根据人的19号染色体基因组设计PCR扩增引物。设计的引物由专业的合成公司合成，如：上海生工等。
3)在逆转录过程中，因温度尚不足以激活耐热DNA聚合酶的活性，仅RNA参与逆转录反应；在完成逆转录反应之后进行双重不对称扩增反应，同时扩增HCV基因和IL28B基因。因此在包含所述引物的PCR试剂中，使用双重不对称PCR，扩增产物可直接用于杂交实验。PCR反应体系涉及的组分可以使用商品化试剂盒，如：NEB的Taq 5×Master Mix，Fermentas的热启动酶等。
4)根据NCBI Gene Bank已有的HCV基因组不同型别之间的同源性和区分能力设计HCV基因分型检测探针，设计的探针可以在正义链和/或反义链。IL28B多态性探针根据人的19号染色体基因组IL28B基因rs12979860位点进行设计。设计的探针由专业的合成公司合成，如：上海生工等。
5)将上述探针点在经过活化的杂交膜上，并加入扩增产物，在杂交体系中，通过高浓度的盐离子溶液非选择性的结合靶基因，然后通过低浓度的盐离子浓度进行选择性的洗脱，随后交联特性结合的酶，最后加入酶的底物显色。
为了达到上述检测步骤，本发明提供的丙型肝炎病毒基因型及IL28B多态性检测试剂盒由扩增试剂、以尼龙膜为载体的低密度芯片、杂交试剂三部分组成。
根据本发明一个优选的实施方案，扩增试剂可以是RT-PCR试剂，即利用一步法RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)技术，在RT-PCR反应体系中加入提取好的核酸、逆转录引物HCV-RT、HCV分型PCR扩增引物HCV-F和HCV-R、IL28B多态性PCR扩增引物IL28B-F和IL28B-R，其特征在于所述引物的序列如下：
| 引物名称 | 序列编号 | 序列 |
| HCV-RT | SEQ ID NO：1 | 5′-GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3′ |
| HCV-F | SEQ ID NO：2 | 5′-TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3′ |
| HCV-R | SEQ ID NO：3 | 5′-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′ |
| IL28B-F | SEQ ID NO：4 | 5’-AGTCTGGGATTCCTGGACGTGG-3’ |
| IL28B-R | SEQ ID NO：5 | 5’-GGCTCAGGGTCAATCACAGAAGGGAG-3’ |
根据本发明一个优选的实施方案，RT-PCR反应体系可采用市售的试剂盒，如QiagenOnestep RT-PCR Kit，并参照市售产品的说明书配制。
根据本发明一个优选的实施方案，扩增试剂还可以是逆转录试剂和PCR试剂，即利用两步法，先用提取的核酸进行逆转录扩增，随后用逆转录产物和提取的核酸同时进行PCR扩增反应，逆转录试剂由逆转录引物HCV-RT和逆转录体系组成，PCR试剂由PCR反应体系、HCV分型PCR扩增引物HCV-F和HCV-R、IL28B多态性PCR扩增引物IL28B-F和IL28B-R组成，其中PCR反应体系可采用热启动酶反应体系或Taq酶反应体系，其特征在于所述引物的序列如下：
| 引物名称 | 序列编号 | 序列 |
| HCV-RT | SEQ ID NO：1 | 5′-GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3′ |
| HCV-F | SEQ ID NO：2 | 5′-TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3′ |
| HCV-R | SEQ ID NO：3 | 5′-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′ |
| IL28B-F | SEQ ID NO：4 | 5’-AGTCTGGGATTCCTGGACGTGG-3’ |
| IL28B-R | SEQ ID NO：5 | 5’-GGCTCAGGGTCAATCACAGAAGGGAG-3’ |
热启动酶反应体系中的热启动酶和PCR反应的其它常规组分均可以使用市售产品，如NEB公司生产的产品，并参照市售产品的说明书配制。
Taq酶反应体系中Taq酶和PCR反应的其它常规组分均可以使用市售产品，如Fermentas公司生产的产品，并参照市售产品的说明书配制。
根据本发明的实施方案，RT-PCR试剂和逆转录试剂中的逆转录引物HCV-RT终浓度均为10μM～400μM，其中优选方案为200μM。
根据本发明的实施方案，RT-PCR试剂和PCR试剂中的引物HCV-F和IL28B-F终浓度均为5μM～400μM，其中优选方案为10μM；引物HCV-R和IL28B-R终浓度均为10μM～400μM，其中优选方案为100μM。
根据本发明一个优选的实施方案，低密度芯片由硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等材料制成的膜、点在膜上的检测HCV基因型和IL28B多态性位点的特异性探针组成，其特征在于HCV基因型特异性探针的序列如下：
| 探针名称 | 序列编号 | 序列 |
| HCV-1 | SEQ ID NO：6 | 5′-CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3′ |
| HCV-1b-1 | SEQ ID NO：7 | 5′-CCGCGAGACTGCTAGCCG-3′ |
| HCV-1b-2 | SEQ ID NO：8 | 5′-GCGAGACCGCTAGCCGAGT-3′ |
| HCV-2-1 | SEQ ID NO：9 | 5′-AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG-3’ |
| HCV-2-2 | SEQ ID NO：10 | 5′-GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC-3′ |
| HCV-2a-1 | SEQ ID NO：11 | 5′-GCCGGGAAGACTGGGTCCT-3′ |
| HCV-2a-2 | SEQ ID NO：12 | 5′-CCCACTCTATGCCCGGCCA-3′ |
| HCV-3-1 | SEQ ID NO：13 | 5′-CCCGCGAGATCACTAGCCG-3′ |
| HCV-3-2 | SEQ ID NO：14 | 5′-AATCGCTGGGGTGACCGGG-3′ |
| HCV-3b | SEQ ID NO：15 | 5′-CGCGCTCAATGCCCGGAAAT-3′ |
| HCV-PC1 | SEQ ID NO：16 | 5′-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3′ |
| HCV-PC2 | SEQ ID NO：17 | 5′-CGGAACCGGTGAGTACACC-3′ |
| HCV-IC | SEQ ID NO：18 | 5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′ |
根据本发明一个优选的实施方案，IL28B多态性位点的特异性探针的序列如下：
| 探针名称 | 序列编号 | 序列 |
| rs12979860-C | SEQ ID NO：19 | 5’-CGAAGGCGCGAACCAGGG-3’ |
| rs12979860-T | SEQ ID NO：20 | 5’-GAAGGCGTGAACCAGGGTTG-3’ |
以上的引物探针可由专门的商业公司合成(如：上海英骏生物技术有限公司)并可根据需要添加相应的基团，如在5’(或3’)标记氨基和/或3’(或5’)标记生物素等。
特异性探针的检测位点包括HCV1型，HCV1b型，HCV2型，HCV2a型，HCV3型，HCV3b型，IL28B多态性位点rs12979860(C/T)。
根据本发明的实施方案，低密度芯片中特异性探针的工作浓度分别为1μM～10μM，其中优选的方案是5μM。
根据本发明的实施方案，杂交试剂由杂交液I、杂交液II、酶、显色液组成，其中杂交液I的组成为1～6×SSC，0.1％～1％SDS，其中优选的方案是2×SSC，0.5％SDS；杂交液II的组成为0.1～1×SSC，0.1％～1％SDS，其中优选的方案是0.5×SSC，0.5％SDS。
根据本发明另一个优选的实施方案，其中酶为辣根过氧化物酶，浓度为0.005U～1U/ml，优选的用量为0.1U。使用不同的酶需要使用与之相匹配的显色系统，辣根过氧化物酶的显色底物可以是3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine(简称TMB)，显色液优选的方案为0.1M柠檬酸钠(pH4.9)，0.42mM TMB，0.004％H2O2(v/v)；也可以使用1，2-phenylenediamine(简称OPD)，显色液优选的方案为50mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH5.0，4mM OPD，0.004％H2O2(v/v)；或其它能与辣根过氧化物酶结合的底物。
本试剂盒可同时检测HCV基因型及与HCV治疗密切相关的IL28B基因多态性，为丙型肝炎个体化治疗提供更为可靠的依据。
附图说明
图1为热启动酶反应体系与Taq酶反应体系扩增效果对比。编号H1～H3为热启动酶反应体系，编号为T1～T3为Taq酶反应体系。
图2显示Streptavidin-POD/TMB显色系统杂交结果。编号1为HCV 1b和IL28Brs12979860-C，编号2为HCV 2a和IL28B rs12979860-C，编号3为HCV 3b和IL28Brs12979860-T。
图3显示Streptavidin-AP-BNBT/BCIP显色系统杂交结果。编号4为HCV 1b和IL28Brs12979860-C，编号5为HCV 2a和IL28B rs12979860-C，编号6为HCV 3b和IL28Brs12979860-T。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的本质，通过对本发明实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。实施例中使用的组分，除特殊说明外，均选用发明内容中的优选方案。
实施例1样品靶核酸的制备
选取经测序确认分别为HCV 1b型同时IL28B多态性位点rs12979860C、2a型同时IL28B多态性位点rs12979860C，3b型同时IL28B多态性位点rs12979860T的三例EDTA抗凝全血标本，按Roche公司的提取试剂High Pure Viral Nucleic Acid Kit说明书的要求提取核酸。
实施例2一步法RT-PCR反应
每人份RT-PCR反应试剂体积为50μl，按Qiagen的Onestep RT-PCR Kit(按说明书要求操作)进行配制，包含1μl 10mM HCV-RT、1μl 0.5mM HCV-F、1μl 5mM HCV-R、1μl 0.5mMIL28B-F、1μl 5mM IL28B-R。将实施例1标本提取的核酸5μl分别加入RT-PCR反应试剂中，一步法反应条件进行扩增，具体条件为50℃30分钟，95℃15分钟，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒，运行45个循环，最后72℃7min。
实施例3两步法逆转录反应
每人份逆转录试剂体积为25μl，按Ambion的RETROscriptTM试剂盒(按说明书要求操作)进行配制，包含0.5μl 10mM HCV-RT，将实施例1标本提取的核酸5μl，分别加入逆转录试剂中，逆转录反应条件进行扩增，具体条件为44℃60分钟，92℃10分钟。
实施例4两步法PCR反应
PCR试剂分别使用了两种反应体系，包括NEB Taq酶反应体系和Fermentas热启动酶反应体系，PCR试剂的制备如下：
两种PCR反应体系，其中热启动酶反应体系加入4ul实施例1提取的核酸，对应的编号为H1，H2和H3；Taq酶反应体系加入2μl实施例1样本提取的的核酸及2μl实施例2的逆转录产物，对应的编号为T1，T2和T3，瞬时(3秒)离心后，将各反应管放入PCR仪，上机条件如下：
热启动酶反应体系扩增条件：95℃15min，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒，运行45个循环，最后72℃7min。
Taq酶反应体系扩增条件：94℃5min，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒，运行45个循环，最后72℃7min。
热启动酶反应体系和Taq酶反应体系的扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，结果显示两种反应体系均能扩增出目的条带且扩增效率无差异，参见附图1。
实施例5试剂盒使用的低密度芯片的制备
低密度芯片中的膜条由尼龙膜作为固相支持材料制成。合成的探针用TE溶液稀释后参照下表所示的阵列以适当方式点在膜条的相应位置。其中两条通用探针稀释成一管，HCV-PC1浓度为10μM，HCV-PC2浓度为10μM，将合并成一管后的探针点至膜条12#位置，形成通用探针点(PC点)；其它探针浓度均为5μM，将稀释好的探针点样1μl至膜条相应位置并晾凉后用0.2mol/L NaOH溶液处理膜条并用蒸馏水充分洗涤，然后保存于4℃备用。
将探针通过紫外线交联，或用氨基标记的探针交联经40％(g/v)EDC(N-乙基-N′-[二四基氨丙基]-碳二亚胺)处理过的尼龙膜。
探针的点样阵列如下表所示：
实施例6反向斑点杂交反应(Streptavidin-POD/TMB显色系统)
选取经测序验证的核酸，对应的型别及编号是：1为HCV 1b和IL28B rs12979860-C，2为HCV 2a和IL28B rs12979860-C，3为HCV 3b和IL28B rs12979860-T。用一步法RT-PCR反应试剂及相应条件进行扩增，产物用于杂交实验，实验步骤如下：
第一步：准备5ml的塑料管，编号1～3。镊取RDB膜条并编号，对应将膜条放入塑料管中。
第二步：往塑料管中加入4ml杂交液I(2×SSC，0.5％SDS)，再加入PCR扩增产物置于50℃水浴1h。
第三步：将膜条转入装有40ml杂交液II(0.5×SSC，0.5％SDS)的塑料管中，加入2UStreptavidin-POD，50℃振荡15min。
第四步：配制显色液(0.1M柠檬酸钠(pH4.9)，0.42mM TMB，0.004％H2O2(v/v))，20～30℃条件下将膜条浸泡于显色液中避光显色3～10min。
第五步：采集电子图像。
结果显示Streptavidin-POD/TMB显色系统杂交结果与测序结果完全一致，具体杂交结果参见附图2。
实施例7反向斑点杂交反应(Streptavidin-AP-NBT/BCIP显色系统)
选取经测序验证的核酸，对应的型别及编号是：4为HCV 1b和IL28B rs12979860-C，5为HCV 2a和IL28B rs12979860-C，6为HCV 3b和IL28B rs12979860-T。用两步法的逆转录试剂和PCR试剂及相应条件进行逆转录和PCR扩增，产物用于杂交实验，实验步骤如下：
第一步：准备5ml的塑料管，编号4～6。镊取RDB膜条并编号，对应将膜条放入塑料管中。
第二步：往塑料管中加入4ml杂交液I(2×SSC，0.5％SDS)，再加入PCR扩增产物置于50℃水浴1h。
第三步：将膜条转入装有40ml杂交液II(0.5×SSC，0.5％SDS)的塑料管中，加入5UStreptavidin-AP，50℃振荡15min。
第四步：配制显色液(50mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH5.0，4mM OPD，0.004％H2O2(v/v))，20～30℃将膜条浸泡于显色液中避光显色3～10min。
第五步：采集电子图像。
结果显示Streptavidin-AP-NBT/BCIP显色系统杂交结果与测序结果完全一致，杂交结果参见附图3。
序列表
<110>中山大学达安基因股份有限公司
<120>丙型肝炎病毒基因分型及IL28位点多态性检测试剂盒
<140>
<141>
<160>20
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>1
gctcatggtgcacggtctacgagacct
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>2
tctagccatggcgttagtatgagtgt
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>3
cactcgcaagcaccctatcaggcagt
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>4
agtctgggattcctggacgtgg
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>5
ggctcagggtcaatcacagaagggag
<210>6
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>6
caatgcctggagatttgggcg
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
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ccgcgagactgctagccg
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
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gcgagaccgctagccgagt
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
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<212>DNA
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<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>10
gtcctttcttggataaacccac
<210>11
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>11
gccgggaagactgggtcct
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>12
cccactctatgcccggcca
<210>13
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>13
cccgcgagatcactagccg
<210>14
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
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<210>15
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<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>15
cgcgctcaatgcccggaaat
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>16
atttgggcgtgcccccgc
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>17
cggaaccggtgagtacacc
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>18
gccgtaaccgtcacaatccgt
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>19
cgaaggcgcgaaccaggg
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>20
gaaggcgtgaaccagggttg
Claims (7)
1.一种检测丙型肝炎病毒基因型及IL28B多态性的试剂盒，由扩增试剂、以尼龙膜为载体的低密度芯片、杂交试剂三部分组成，其特征在于扩增试剂中逆转录引物HCV-RT、HCV分型PCR扩增引物HCV-F和HCV-R、IL28B多态性PCR扩增引物IL28B-F和IL28B-R的序列分别是：
HCV-RT：5′-GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3′
HCV-F：5′-TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3′
HCV-R：5′-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′
IL28B-F：5’-AGTCTGGGATTCCTGGACGTGG-3’
IL28B-R：5’-GGCTCAGGGTCAATCACAGAAGGGAG-3’。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于扩增试剂中逆转录引物HCV-RT终浓度为200μM，引物HCV-F和IL28B-F终浓度均为10μM，引物HCV-R和IL28B-R终浓度均为100μM。
3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于点在低密度芯片的HCV基因型特异性探针的序列为：
HCV-1：5′-CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3′
HCV-1b-1：5′-CCGCGAGACTGCTAGCCG-3′
HCV-1b-2：5′-GCGAGACCGCTAGCCGAGT-3′
HCV-2-1：5′-AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG-3’
HCV-2-2：5′-GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC-3′
HCV-2a-1：5′-GCCGGGAAGACTGGGTCCT-3′
HCV-2a-2：5′-CCCACTCTATGCCCGGCCA-3′
HCV-3-1：5′-CCCGCGAGATCACTAGCCG-3′
HCV-3-2：5′-AATCGCTGGGGTGACCGGG-3′
HCV-3b：5′-CGCGCTCAATGCCCGGAAAT-3′
HCV-PC1：5′-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3′
HCV-PC2：5′-CGGAACCGGTGAGTACACC-3′
HCV-IC：5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′。
4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于点在低密度芯片的IL28B多态性位点的特异性探针的序列为：
rs12979860-C：5’-CGAAGGCGCGAACCAGGG-3’
rs12979860-T：5’-GAAGGCGTGAACCAGGGTTG-3’。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于点在低密度芯片上的HCV基因型特异性探针和IL28B多态性位点的特异性探针的工作浓度均为5μM。
6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于杂交试剂中杂交液I的组成为2×SSC，0.5％SDS，杂交液II的组成为0.5×SSC，0.5％SDS，辣根过氧化物酶的用量为0.1U。
7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于杂交试剂中显色底物包括TMB或OPD。
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