CN103710464A - 一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒。该试剂盒用磁珠法提取样本核酸，采用实时荧光定量PCR技术，以HCV基因组的高度保守区域为扩增靶目标，设计特异性引物及TaqMan探针，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对HCV基因进行快速、准确分型检测，体系中加入内标，可以有效预防假阴性结果。
Description
技术领域
本发明属于丙型肝炎病毒基因型检测技术领域，涉及一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒。
背景技术
磁珠法是近年发展迅速且被广泛应用的一种核酸提取方法，其优于传统方法的特点可以总结为以下几点：提取体积可变性大、吸附核酸专一性强、纯度高、可实现自动化操作。
实时荧光PCR技术（FQ-PCR）把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行。实时荧光PCR技术与其它检测技术相比具有以下优势：（1）与免疫学检测比较，具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来。（2）根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应。（3）能对病毒进行定量检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况。定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况。这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键。（4）可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查。对手足口病这类自然感染率极高的病原微生物尤其适用。（5）将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤。（6）全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染。（7）实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中荣耀信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。
国内少有基于实时荧光定量PCR技术定量检测HCV（丙型肝炎病毒，hepatitisC virus）基因型的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的HCV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处：1）检测灵敏度低，约在10000IU/ml左右；检测范围窄，一般在1.00E+04IU/ml～1.00E+07IU/ml之间，对于临床高值（大于5.00E+07IU/ml）和低值（小于1.00E+04IU/ml）的样本无法检测；2）对于HCV基因型覆盖不全，只能检测其中某种基因型下的亚型；3）酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；4）无法有效去除样本中的PCR抑制物（如：血脂、强溶血等）；5）国外试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。
因此，目前存在的问题是针对现有丙型肝炎病毒基因型荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，研究开发一种覆盖型别全面、RNA提取得率高、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的HCV基因型荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒可以对血浆等未知样本中的HCV-RNA进行快速、准确分型检测，检测结果可用于HCV分型的辅助诊断。
发明内容
本发明提供了一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒。该试剂盒用磁珠法提取样本核酸，采用实时荧光定量PCR技术，以HCV基因组的高度保守区域为扩增靶目标，设计特异性引物及TaqMan探针，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对HCV基因进行快速、准确分型检测。
为此，本发明一方面提供了一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒，其包括3种丙型肝炎病毒PCR反应液，其中，HCV1/3型PCR反应液含有两种用于靶多核苷酸检测的探针和用于靶多核苷酸扩增的上下游引物，且所述引物和探针的序列为，
上游引物HCV1-F：5'-AGGAAGACTTCCGAGCGGTC-3'；
下游引物HCV1-R：5'-TGCCATAGAGGGGCCAAGG-3'；
探针HCV1-P：5’FAM-TACCCGGGCTGCGCCCAGG-BHQ13’；
上游引物HCV3-F：5'-GTCCTTTCTTGGAACAACCCGC-3'；
下游引物HCV3-R：5'-GACCCAACACTACTCGGCTAGTGA-3'；
探针HCV3-P：5’FAM-CAATACCCAGAAATTTGGGCGTGCC-BHQ13’；
HCV2/6型PCR反应液含有两种用于靶多核苷酸检测的探针和用于靶多核苷酸扩增的上下游引物，且所述引物和探针的序列为，
上游引物HCV2-F：5'-CGGAATTGCCGGGAAGACT-3'；
下游引物HCV2-R：5'-GCCTTTCGCAACCCAACG-3'；
探针HCV2-P：5’FAM-ATAAACCCACTCTATGCCCGGTCATTTGG-BHQ13’；
上游引物HCV6-F：5'-CATGGGGTACATTCCCGTCG-3'；
下游引物HCV6-R：5'-TTGATCCCGTCCTCGATTGC-3'；
探针HCV6-P：5’FAM-ACACCATGTGCGAGCGCAGCCG-BHQ13’。
HCV1b/内标型PCR反应液含有用于靶多核苷酸扩增的上游引物HCV1b-F、下游引物HCV1b-R及用于靶多核苷酸检测的探针HCV1b-P，并含有用于检测内标的上游引物IC-F、下游引物IC-R及用于检测内标的探针IC-P，且所述引物和探针的序列为，
上游引物HCV1b-F：5'-ACCTCGTGGAAGGCGACAA-3'；
下游引物HCV1b-R：5'-CCATAGAGGGGCCAAGGGTA-3'；
探针HCV1b-P：5’FAM-CCAAGGCTCGCCAGCCCGAG-BHQ13’；
上游引物IC-F：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’；
下游引物IC-R：5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’；
探针IC-P：5’HEX-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA-BHQ13’。
根据本发明，所述3种丙型肝炎病毒PCR反应液中均含有PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸。
在本发明的一个实施例中，所述HCV1/3型PCR反应液中含有5×PCR反应缓冲液10μl（Tth聚合酶附带的），0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物HCV1-F、HCV1-R、HCV3-F、HCV3-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针HCV1-P、HCV3-P，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针。
在本发明的另一个实施例中，所述HCV2/6型PCR反应液中5×PCR反应缓冲液10μl（Tth聚合酶附带的），0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物HCV2-F、HCV2-R、HCV6-F、HCV6-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针HCV2-P、HCV6-P。所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针。
在本发明的又一实施例中，所述HCV1b/内标型PCR反应液中含有5×PCR反应缓冲液10μl（Tth聚合酶附带的），0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物HCV1b-F、HCV1b-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针HCV1b-P。0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的上下游引物IC-F与IC-R，0.05μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针IC-P，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针。
根据本发明，所述试剂盒中还包括丙型肝炎病毒分型酶混合液、丙型肝炎病毒分型阴性对照和丙型肝炎病毒分型阳性对照，其中，所述丙型肝炎病毒分型酶混合液包括Tth酶、H-Taq DNA聚合酶。
在本发明的一个实施例中，所述HCV分型酶混合液含有Tth酶10U/μl～150U/μl，1U/μl～10U/μl H-Taq DNA聚合酶。
在本发明另一个实施例中，所述HCV分型阳性对照为标定已知浓度的假病毒，其浓度为1.00～5.00E+05IU/ml。所述HCV分型阴性对照为灭菌生理盐水。
根据本发明，所述试剂盒还包括丙型肝炎病毒分型内标，其为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，所述100碱基对的序列为：
5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCT
GACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。
在本发明的一个实施例中，所述丙型肝炎病毒分型内标的浓度为1.00E+03IUs/ml～1.00E+06IUs/ml。
根据本发明，所述试剂盒还包括RNA提取溶液和RNA洗脱液，其中，所述RNA提取溶液包括，
RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠；
RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠，且pH6.5±0.2；
RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠；
RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油。
在本发明的一个实施例中，所述RNA提取溶液I由十二烷基硫酸钠0.2%～1.0%（质量/体积）、曲拉通1.0%～4.0%(体积/体积)、异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L、100～400μg/ml的磁珠组成。
在本发明的一个实施例中，所述RNA提取溶液II含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L和氯化钠100～300mmol/L，且pH6.5±0.2。
在本发明的一个实施例中，所述RNA提取溶液III曲拉通0.1%～1.0%(体积/体积)、氯化钠100～300mmol/L。
在本发明的一个实施例中，所述RNA洗脱液含有Tris-HCl0.8～1.2mol/L和EDTA0.1～1.0mol/L。
本发明另一方面提供了一种使用如上所述的试剂盒进行丙型肝炎病毒基因型检测的方法，其包括：
步骤K,将3种丙型肝炎病毒PCR反应液分别与丙型肝炎病毒分型酶混合液混合后制成3种PCR混合液；
步骤L，将3种PCR混合液分别进行离心处理，然后将经过离心处理的3种PCR混合液分别加入3组反应管，分别向每组含有PCR混合液的各反应管中加入待测样本RNA、丙型肝炎病毒分型阴性对照、丙型肝炎病毒分型阳性对照，制成PCR反应样品，盖好管盖；
步骤M，将各反应管置于荧光定量PCR扩增仪上进行荧光PCR反应，检测并记录样品的扩增曲线与阈值线；
步骤N，根据样品的扩增曲线与阈值线是否存在交点Ct，以及Ct值进行丙型肝炎病毒分型分析；
其中，在步骤K中，丙型肝炎病毒PCR反应液的加入量为43μl/人份，丙型肝炎病毒分型酶混合液的加入量为2μl/人份。
根据本发明，在步骤L中，PCR混合液的加入量45μl，待测样本RNA、丙型肝炎病毒分型阴性对照、丙型肝炎病毒分型阳性对照的加入量均为5μl。
在一个实施例中，将含有PCR反应样品的反应管放入荧光定量PCR扩增仪的扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度，选择FAM通道（Reportere:FAM,Quencher:None）检测HCV分型；选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None）检测内标，然后进行荧光PCR反应，并检测并记录样品的扩增曲线与阈值线。
本发明中所述用语“Ct”（即cycle threshold）是指扩增曲线与阈值线的交点，而Ct值是指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。
FAM Ct值为选择FAM通道检测HCV分型时得到的Ct值。
HEX Ct值为选择HEX通道检测HCV分型时得到的Ct值
在本发明的一个实施例中，在步骤N中，
如果各基因型反应液的检测结果均为无Ct或Ct值≥36，且内标检测为阳性（Ct值≤36），则判断为HCV1b、1、2、3、6阴性；
如果HCV1/3型反应液的检测结果FAMCt值≤36，报告为HCV1型阳性，HEX Ct值≤36，报告为HCV3型阳性；
如果HCV2/6型反应液的检测结果FAMCt值≤36，报告为HCV2型阳性，HEX Ct值≤36，报告为HCV6型阳性；
如果HCV1b/内标型反应液的检测结果FAMCt值≤36，报告为HCV1b型阳性，HEX Ct值≤36，报告为内标阳性；
如果各基因型检测为阴性，且内标检测为阴性（Ct值＞36），则该样本的检测结果无效，查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
根据本发明方法，所述方法还包括提取RNA的操作，其包括，
步骤A，裂解病毒：将RNA提取溶液Ⅰ与相应的丙肝病毒分型内标充分混合后制成提取试剂混合液1离心处理后与待测样品一起在离心管中震荡混合均匀再进行离心处理制成提取样品混合液1；
步骤B，磁珠吸附核酸并去除杂质：向步骤A中制得的含有提取样品混合液1的离心管中加入RNA提取溶液Ⅱ，震荡混合均匀、静置10～30分钟，再将离心管置于磁珠分离器上处理2～5分钟后缓慢将溶液吸出；
步骤C，洗涤：向离心管中加入RNA提取溶液Ⅲ和RNA提取溶液Ⅳ震荡混合均匀、离心处理后置于磁珠分离器上处理2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；
步骤D，洗脱：向离心管中加入RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于磁珠分离器上处理2～5分钟，然后将洗脱下来的待测样本RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中。
本发明在对HCV分型所有已知基因型的序列进行比对的基础上，在HCV分型的最保守区域设计了多对引物和探针，经定量PCR优化，筛选出了扩增效果最好的5对引物和探针，可检测出全面的HCV基因型，同时不能检测出非HCV病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。同时，对HCV-RNA的提取方法进行了比较和优化，选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，检测灵敏度可达1000IU/ml，检测范围为1.0E+03～1.0E+08IUs/m。另外，对PCR反应体系进行了优化组合，在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控RNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。荧光PCR扩增结束后，经仪器自带软件自动分析样本的Ct值，可用于HCV分型的辅助诊断，指导临床治疗方法。
特异性试验表明：检测相似病状或相近部位的病原体均为阴性。
目前常用的酚-氯仿法和柱提取法中，有PCR抑制物存在，而导致HCV分型阳性样本检测为阴性，即为假阴性，提示应该进行重新检测或者改进方法进行检测。本发明的磁珠法提取纯化HCV RNA，血浆样本的HCV分型检测的结果均有Ct值（即都为阳性），体系中没有PCR抑制物的存在；因此，本试剂盒所采用的磁珠法提取核酸，能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适合于血浆等样本的RNA提取和PCR检测。
临床样本的检测试验表明：本发明的磁珠法提取纯化试剂盒的检测范围为1.0E+03IU/mL～1.0E+08IU/mL，检测下限即灵敏度为1000IU/mL。
本发明的丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒用磁珠法提取样本核酸，采用实时荧光定量PCR技术，以HCV基因组的高度保守区域为扩增靶目标，设计特异性引物及TaqMan探针，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对HCV基因进行快速、准确分型检测，体系中加入内标，可以有效预防假阴性结果。
附图说明
图1为HCV分型试剂检测近似病原体扩增曲线图。
图2为HCV分型试剂内源干扰物质扩增曲线图。
图3为HCV分型试剂外源干扰物质扩增曲线图。
图4为1型1.0E+08IU/ml～1.0E+03IU/ml梯度样本检测结果。
图5为2型1.0E+08IU/ml～1.0E+03IU/ml梯度样本检测结果。
图6为3型1.0E+08IU/ml～1.0E+03IU/ml梯度样本检测结果。
图7为6型1.0E+08IU/ml～1.0E+03IU/ml梯度样本检测结果。
图8为1b型1.0E+08IU/ml～1.0E+03IU/ml梯度样本检测结果。
图9为1型检测限20次检测结果。
图10为2型检测限20次检测结果。
图11为3型检测限20次检测结果。
图12为6型检测限20次检测结果。
图13为1b型检测限20次检测结果。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例
实施例1：提供一种HCV基因型检测试剂盒
一种HCV基因型检测试剂盒，其本至少由以下几种独立存在的组分组成：
HCV1型、3型PCR反应液：5×PCR反应缓冲液10μl（Tth聚合酶附带的），0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物HCV1-F、HCV1-R、HCV3-F、HCV3-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针HCV1-P、HCV3-P，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物HCV1-F：5'-AGGAAGACTTCCGAGCGGTC-3'；
下游引物HCV1-R：5'-TGCCATAGAGGGGCCAAGG-3'；
探针HCV1-P：5’FAM-TACCCGGGCTGCGCCCAGG-BHQ13’；
上游引物HCV3-F：5'-GTCCTTTCTTGGAACAACCCGC-3'；
下游引物HCV3-R：5'-GACCCAACACTACTCGGCTAGTGA-3'；
探针HCV3-P：5’FAM-CAATACCCAGAAATTTGGGCGTGCC-BHQ13’；
HCV2型、6型PCR反应液：5×PCR反应缓冲液10μl（Tth聚合酶附带的），0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物HCV2-F、HCV2-R、HCV6-F、HCV6-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针HCV2-P、HCV6-P。所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物HCV2-F：5'-CGGAATTGCCGGGAAGACT-3'；
下游引物HCV2-R：5'-GCCTTTCGCAACCCAACG-3'；
探针HCV2-P：5’FAM-ATAAACCCACTCTATGCCCGGTCATTTGG-BHQ13’；
上游引物HCV6-F：5'-CATGGGGTACATTCCCGTCG-3'；
下游引物HCV6-R：5'-TTGATCCCGTCCTCGATTGC-3'；
探针HCV6-P：5’FAM-ACACCATGTGCGAGCGCAGCCG-BHQ13’；
HCV1b型、内标PCR反应液：5×PCR反应缓冲液10μl（Tth聚合酶附带的），0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物HCV1b-F、HCV1b-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针HCV1b-P。0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的上下游引物IC-F与IC-R，0.05μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针IC-P，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物HCV1b-F：5'-ACCTCGTGGAAGGCGACAA-3'；
下游引物HCV1b-R：5'-CCATAGAGGGGCCAAGGGTA-3'；
探针HCV1b-P：5’FAM-CCAAGGCTCGCCAGCCCGAG-BHQ13’；
针对100碱基对的序列设计了非竞争性内标的引物探针，其碱基对序列分别为：
上游引物IC-F：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’；
下游引物IC-R：5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’；
探针IC-P：5’HEX-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA-BHQ13’。
实施例2：提供一种HCV基因型检测试剂盒
一种HCV基因型检测试剂盒，其除了含有实施例1中独立存在的各组分外还含有以下几种独立存在的组分：
内标（阳性内对照）：为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为1.00E+03IUs/ml～1.00E+06IUs/ml；100碱基对的序列如下所示：
5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’
实施例3：提供一种HCV基因型检测试剂盒
一种HCV基因型检测试剂盒，其除了含有实施例2中独立存在的各组分外还含有以下几种独立存在的组分：
HCV分型酶混合液：Tth酶10U/μl～150U/μl，1U/μl～10U/μl H-Taq DNA聚合酶；
HCV分型阳性对照：标定已知浓度的假病毒，其浓度为1.00～5.00E+05IU/ml。
HCV分型阴性对照：灭菌生理盐水。
实施例4：提供一种HCV基因型检测试剂盒
一种本发明的HCV基因型检测试剂盒，其本至少由以下十几种独立存在的组分组成：
RNA提取溶液I：由十二烷基硫酸钠0.2%～1.0%（质量/体积）、曲拉通
1.0%～4.0%(体积/体积)，异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L、100～400μg/ml的磁珠组成；
RNA提取溶液II：RNA提取溶液I：由十二烷基硫酸钠0.2%～1.0%（质量/体积）、曲拉通
1.0%～4.0%(体积/体积)、异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L、100～400μg/ml的磁珠组成；
RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠100～300mmol/L；
RNA提取溶液III：曲拉通0.1%～1.0%(体积/体积)、氯化钠100～300mmol/L；
RNA提取溶液IV：矿物油；
RNA洗脱液：Tris-HCl0.8～1.2mol/L、EDTA0.1～1.0mol/L
内标（阳性内对照）：为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为1.00E+03IUs/ml～1.00E+06IUs/ml；100碱基对的序列如下所示：
5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’
HCV1型、3型PCR反应液：5×PCR反应缓冲液10μl（Tth聚合酶附带的），0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物HCV1-F、HCV1-R、HCV3-F、HCV3-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针HCV1-P、HCV3-P，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物HCV1-F：5'-AGGAAGACTTCCGAGCGGTC-3'；
下游引物HCV1-R：5'-TGCCATAGAGGGGCCAAGG-3'；
探针HCV1-P：5’FAM-TACCCGGGCTGCGCCCAGG-BHQ13’；
上游引物HCV3-F：5'-GTCCTTTCTTGGAACAACCCGC-3'；
下游引物HCV3-R：5'-GACCCAACACTACTCGGCTAGTGA-3'；
探针HCV3-P：5’FAM-CAATACCCAGAAATTTGGGCGTGCC-BHQ13’；HCV2型、6型PCR反应液：5×PCR反应缓冲液10μl（Tth聚合酶附带的），0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物HCV2-F、HCV2-R、HCV6-F、HCV6-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针HCV2-P、HCV6-P。所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物HCV2-F：5'-CGGAATTGCCGGGAAGACT-3'；
下游引物HCV2-R：5'-GCCTTTCGCAACCCAACG-3'；
探针HCV2-P：5’FAM-ATAAACCCACTCTATGCCCGGTCATTTGG-BHQ13’；
上游引物HCV6-F：5'-CATGGGGTACATTCCCGTCG-3'；
下游引物HCV6-R：5'-TTGATCCCGTCCTCGATTGC-3'；
探针HCV6-P：5’FAM-ACACCATGTGCGAGCGCAGCCG-BHQ13’；
HCV1b型、内标PCR反应液：5×PCR反应缓冲液10μl（Tth聚合酶附带的），0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物HCV1b-F、HCV1b-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针HCV1b-P。0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的上下游引物IC-F与IC-R，0.05μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针IC-P，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物HCV1b-F：5'-ACCTCGTGGAAGGCGACAA-3'；
下游引物HCV1b-R：5'-CCATAGAGGGGCCAAGGGTA-3'；
探针HCV1b-P：5’FAM-CCAAGGCTCGCCAGCCCGAG-BHQ13’；
针对100碱基对的序列设计了非竞争性内标的引物探针，其碱基对序列分别为：
上游引物IC-F：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’；
下游引物IC-R：5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’；
探针IC-P：5’HEX-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA-BHQ13’；
HCV分型酶混合液：Tth酶10U/μl～150U/μl，1U/μl～10U/μl H-Taq DNA聚合酶；
HCV分型阳性对照：标定已知浓度的假病毒，其浓度为1.00～5.00E+05IU/ml。
HCV分型阴性对照：灭菌生理盐水。
实施例5：使用实施例4的试剂盒提取血浆等未知样本中RNA
1试剂准备
1）按比例（RNA提取溶液I200μl～1ml/人份+HCV分型内标1μl/人份）取相应量的RNA提取溶液I及HCV分型内标，充分混匀成提取样品混合液1，瞬时离心后备用。
2RNA提取操作
1）裂解病毒：每管加入200μl～1ml RNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本（血浆生理盐水洗脱液等待测样本），盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心（肠道病毒阴性对照以及阳性对照参照相同步骤提取）；
2）磁珠吸附核酸：每管加入50μl～400μl RNA提取溶液2，震荡混匀10秒钟后，室温静置10～30分钟；
3)去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出；
4）洗涤：每管加入400μl～1ml RNA提取溶液3和100μl～500μl RNA提取溶液4，震荡混匀3～7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；
5）2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃。
6）加入10μl～100ul RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中。
实施例6：使用实施例4的试剂盒检测血浆等未知样本中丙型肝炎病毒基因型
1试剂准备
根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例（PCR反应液43μl/人份+酶混合液2μl/人份）取相应量的HCV分型PCR反应液及酶混合液，充分混匀成PCR-mix，2个型一种反应液，共3种反应液，瞬时离心后备用。
2.PCR反应及HCV分型分析
（1）根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，分别将经过离心处理的PCR混合液加入3组反应管，每个反应管加入45μlPCR-mix。吸取已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照按每个反应液点样5μl加入3种PCR-mix中，盖好管盖。
（2）将含有PCR反应样品的反应管放入荧光定量PCR扩增仪的扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度，选择FAM通道（Reportere:FAM,Quencher:None）检测HCV分型；选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None）检测内标，然后进行荧光PCR反应，并检测并记录样品的扩增曲线与阈值线，荧光定量PCR反应条件见表1。
表1
（3）反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析（也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析），然后记录样本Ct值结果。对于各基因型反应液的检测结果为无Ct或Ct值≥36，且内标检测为阳性（Ct值≤36），则判断为HCV1b、1、2、3、6阴性；HCV1/3型反应液的检测结果FAMCt值≤36，报告为HCV1型阳性，HEX Ct值≤36，报告为HCV3型阳性；HCV2/6型反应液的检测结果FAMCt值≤36，报告为HCV2型阳性，HEXCt值≤36，报告为HCV6型阳性；HCV1b/内标型反应液的检测结果FAMCt值≤36，报告为HCV1型阳性，HEX Ct值≤36，报告为HCV1b型阳性；弱各型检测为阴性，且内标检测为阳性（Ct值＞36），则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
实施例7：特异性试验
用磁珠法核酸提取试剂提取下列样本的核酸，然后用HCV分型试剂检测甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒、梅毒螺旋体、EB病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均为阴性，结果见图1。
上述试验结果表明，检测相似病状或相近部位的病原体均为阴性。
实施例8：RNA不同提取方法对HCV分型检测的影响试验
向正常样本中添加内源性干扰物（胆红素28mg/dL、甘油三酯3000mg/dL、血红蛋白2g/dL、总IgG40g/L），用磁珠法核酸提取试剂提取样本的核酸，然后用HCV分型试剂检测均正常，见图2。
向正常样本中添加外源性干扰物（干扰素2a(派罗欣)9ng/mL、利巴韦林300ug/mL、干扰素2b250IU/mL、派罗欣联合利巴韦林（9ng+45ug）/mL），用磁珠法核酸提取试剂提取样本的核酸，然后用HCV分型试剂检测均正常，见图3。
上述试验结果表明，目前常用的酚-氯仿法和柱提取法中，有PCR抑制物存在，而导致HCV分型阳性样本检测为阴性，即为假阴性，提示应该进行重新检测或者改进方法进行检测。本发明的磁珠法提取纯化HCV RNA，血浆样本的HCV分型检测的结果均有Ct值（即都为阳性），体系中没有PCR抑制物的存在；因此，本试剂盒所采用的磁珠法提取核酸，能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适合于血浆等样本的RNA提取和PCR检测。
实施例9：临床样本的检测试验，临床HCV阳性样本经定值后，经梯度稀释成1.0E+08IU/ml～1.0E+03IU/ml。用磁珠法核酸提取试剂提取样本的核酸，然后用HCV分型试剂检测。
1.检测范围试验
1型1.0E+08IU/ml～1.0E+03IU/ml梯度样本检测结果见图4。
2型1.0E+08IU/ml～1.0E+03IU/ml梯度样本检测结果见图5。
3型1.0E+08IU/ml～1.0E+03IU/ml梯度样本检测结果见图6。
6型1.0E+08IU/ml～1.0E+03IU/ml梯度样本检测结果见图7。
1b型1.0E+08IU/ml～1.0E+03IU/ml梯度样本检测结果见图8。
2.灵敏度试验
1型检测限20次检测结果见图9。
2型检测限20次检测结果见图10。
3型检测限20次检测结果见图11。
6型检测限20次检测结果见图12。
1b型检测限20次检测结果见图13。
上述试验结果表明，本发明的磁珠法提取纯化试剂盒的检测范围为1.0E+03IU/mL～1.0E+08IU/mL，检测下限即灵敏度为1000IU/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒，其包括3种丙型肝炎病毒PCR反应液，其中，
HCV1/3型PCR反应液含有两种用于靶多核苷酸检测的探针和用于靶多核苷酸扩增的上下游引物，且所述引物和探针的序列为，
上游引物HCV1-F：5'-AGGAAGACTTCCGAGCGGTC-3'；
下游引物HCV1-R：5'-TGCCATAGAGGGGCCAAGG-3'；
探针HCV1-P：5’FAM-TACCCGGGCTGCGCCCAGG-BHQ13’；
上游引物HCV3-F：5'-GTCCTTTCTTGGAACAACCCGC-3'；
下游引物HCV3-R：5'-GACCCAACACTACTCGGCTAGTGA-3'；
探针HCV3-P：5’FAM-CAATACCCAGAAATTTGGGCGTGCC-BHQ13’；
HCV2/6型PCR反应液含有两种用于靶多核苷酸检测的探针和用于靶多核苷酸扩增的上下游引物，且所述引物和探针的序列为，
上游引物HCV2-F：5'-CGGAATTGCCGGGAAGACT-3'；
下游引物HCV2-R：5'-GCCTTTCGCAACCCAACG-3'；
探针HCV2-P：5’FAM-ATAAACCCACTCTATGCCCGGTCATTTGG-BHQ13’；
上游引物HCV6-F：5'-CATGGGGTACATTCCCGTCG-3'；
下游引物HCV6-R：5'-TTGATCCCGTCCTCGATTGC-3'；
探针HCV6-P：5’FAM-ACACCATGTGCGAGCGCAGCCG-BHQ13’。
HCV1b/内标型PCR反应液含有用于靶多核苷酸扩增的上游引物HCV1b-F、下游引物HCV1b-R及用于靶多核苷酸检测的探针HCV1b-P，并含有用于检测内标的上游引物IC-F、下游引物IC-R及用于检测内标的探针IC-P，且所述引物和探针的序列为，
上游引物HCV1b-F：5'-ACCTCGTGGAAGGCGACAA-3'；
下游引物HCV1b-R：5'-CCATAGAGGGGCCAAGGGTA-3'；
探针HCV1b-P：5’FAM-CCAAGGCTCGCCAGCCCGAG-BHQ13’；
上游引物IC-F：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’；
下游引物IC-R：5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’；
探针IC-P：5’HEX-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA-BHQ13’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述3种丙型肝炎病毒PCR反应液中均含有PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括丙型肝炎病毒分型酶混合液、丙型肝炎病毒分型阴性对照和丙型肝炎病毒分型阳性对照，其中，所述丙型肝炎病毒分型酶混合液包括Tth酶、H-Taq DNA聚合酶。
4.根据权利要求1到3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括丙型肝炎病毒分型内标，其为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，所述100碱基对的序列为：
5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述丙型肝炎病毒分型内标的浓度为1.00E+03IUs/ml～1.00E+06IUs/ml。
6.根据权利要求1到5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取溶液和RNA洗脱液，其中，
所述RNA提取溶液包括，
RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠；
RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠，且pH6.5±0.2；
RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠；
RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油。
7.一种使用如权利要求1～6中任意一项所述的试剂盒进行丙型肝炎病毒基因型检测的方法，其包括：
步骤K,将3种丙型肝炎病毒PCR反应液分别与丙型肝炎病毒分型酶混合液混合后制成3种PCR混合液；
步骤L，将3种PCR混合液分别进行离心处理，然后将经过离心处理的3种PCR混合液分别加入3组反应管，分别向每组含有PCR混合液的各反应管中加入待测样本RNA、丙型肝炎病毒分型阴性对照、丙型肝炎病毒分型阳性对照，制成PCR反应样品，盖好管盖；
步骤M，将各反应管置于荧光定量PCR扩增仪上进行荧光PCR反应，检测并记录样品的扩增曲线与阈值线；
步骤N，根据样品的扩增曲线与阈值线是否存在交点Ct，以及Ct值进行丙型肝炎病毒分型分析；
其中，在步骤K中，丙型肝炎病毒PCR反应液的加入量为43μl/人份，丙型肝炎病毒分型酶混合液的加入量为2μl/人份。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤L中，PCR混合液的加入量45μl，待测样本RNA、丙型肝炎病毒分型阴性对照、丙型肝炎病毒分型阳性对照的加入量均为5μl。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在步骤N中，
如果各基因型反应液的检测结果为无Ct或Ct值≥36，且内标检测为Ct值≤36，则判断为HCV1b、1、2、3、6阴性；
如果HCV1/3型反应液的检测结果FAM Ct值≤36，报告为HCV1型阳性，HEX Ct值≤36，报告为HCV3型阳性；
如果HCV2/6型反应液的检测结果FAM Ct值≤36，报告为HCV2型阳性，HEX Ct值≤36，报告为HCV6型阳性；
如果HCV1b/内标型反应液的检测结果FAM Ct值≤36，报告为HCV1b型阳性，HEX Ct值≤36，报告为内标阳性；
如果各基因型检测为阴性，且内标检测为Ct值＞36，则该样本的检测结果无效，查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提取RNA的操作，其包括，
步骤A，裂解病毒：将RNA提取溶液Ⅰ与相应的丙肝病毒分型内标充分混合后制成提取试剂混合液1离心处理后与待测样品一起在离心管中震荡混合均匀再进行离心处理制成提取样品混合液1；
步骤B，磁珠吸附核酸并去除杂质：向步骤A中制得的含有提取样品混合液1的离心管中加入RNA提取溶液Ⅱ，震荡混合均匀、静置10～30分钟，再将离心管置于磁珠分离器上处理2～5分钟后缓慢将溶液吸出；
步骤C，洗涤：向离心管中加入RNA提取溶液Ⅲ和RNA提取溶液Ⅳ震荡混合均匀、离心处理后置于磁珠分离器上处理2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；
步骤D，洗脱：向离心管中加入RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于磁珠分离器上处理2～5分钟，然后将洗脱下来的待测样本RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中。
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