CN104630214B - Sry基因引物对与探针的组合和sry多位点检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于对人类进行性别鉴定的探针与引物对组合和包含该组合的试剂盒。一种SRY基因引物对和探针的组合，包括一个探针，一对SRY基因引物，所述探针为TaqMan探针，所述一对SRY基因引物为一对基因序列反向的引物；一种实时荧光SRY多位点基因检测试剂盒：包括4组如权利要求1或2所述的SRY基因引物对和探针的组合，其中所述第一引物对中的正向引物的序列为：5'CGAACTCTGGCACCTTTCAATT3'第一引物对中的反向引物的序列为：3'CGCTTAACATAGCAGAAGCATATGA5'第一探针的序列为：FAM‑TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACAATGC‑TAMRASRY基因引物对和探针组合能够检测人类性别，而实时荧光SRY多位点基因检测盒：涵盖了Y染色体SRY基因中的4个靶基因，灵敏度高,特异强，推荐方法中结果符合率100％。

Description

SRY基因引物对与探针的组合和SRY多位点检测试剂盒

【技术领域】

本发明涉及一种基因引物与探针的组合以及包含该组合的试剂盒。更确切的说，是一种SRY基因引物与探针的组合和实时荧光SRY多位点基因检测试剂盒。

【背景技术】

目前检测SRY基因一般采用PCR技术,其观察结果主要为凝胶电泳成像法，耗时，耗力且易污染,由于其检测的高灵敏度极易产生假阳性。然而针对极少数情况会采用多重PCR技术,但DNA浓度低时同管多条引物对相互抑制，易造成灵敏度下降，有时会产生假阴性。以上两者，均会使测试结果造成错误，正确率难以保证。目前常规采用的方法：例如绒毛样本检测及羊膜腔穿刺取羊水细胞等，都属于创伤性的,对母亲及胎儿均有一定的风险。

【发明内容】

目的在于现代遗传咨询中要求做产前性别判断的越来越多，故在不刺激孕妇子宫的情况下，就可以做染色体分析的无创伤性性别检测，还可以通过检测男性个体不同时期SRY基因表达的量来监测个体盛衰的变化,日益引起广大医学家的关注。

发明具体内容如下：

一种SRY基因引物对和探针的组合，包括一个探针，一对SRY基因引物，其特征在于：所述探针为TaqMan探针，所述一对SRY基因引物为一对基因序列反向的引物；

其中所述的一种关于SRY基因引物对和探针的组合，其特征在于：所述SRY基因序列号位于YP11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1KB编码一个204氨基酸的蛋白质；

一种实时荧光SRY多位点基因检测试剂盒：包括4组如权利要求1或2所述的SRY基因引物对和探针的组合，其特征在于：

所述第一引物对中的正向引物的序列为：

5'CGAACTCTGGCACCTTTCAATT 3'

第一引物对中的反向引物的序列为：

3'CGCTTAACATAGCAGAAGCATATGA5'

第一探针的序列为：

FAM-TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACAATGC-TAMRA

所述第二引物对中的正向引物的序列为：

5'TCTTCCAGGAGGCACAGAAATT 3'

第二引物对中的反向引物的核苷酸序列为：3'TTCCGACGAGGTCGATACTTATAAT5'

第二探针的序列为：

FAM-CAGGCCATGCACAGAGAGAAATACCCG-TAMRA

所述第三引物对中的正向引物的序列为：

5'GCCGAAGAATTGCAGTTTGC3'

第三引物对中的反向引物的序列为：

3'AGTTGCACTTCGCTGCAGAGT5'

第三探针的序列为：

FAM-CCCGCAGATCCCGCTTCGG-TAMRA

所述第四引物对中的正向引物的序列为：

5'ACGAAAGCCACACACTCAAGAA3'

第四引物对中的反向引物的序列为：

3'GTGAGCTGGCTGCGTTGAT5'

第四探针的序列为：

FAM-AGCACCAGCTAGGCCACTTACCGCC-TAMRA

【附图说明】

图1为第一引物对和探针PCR荧光扩增原理图

图2为第二引物对和探针PCR荧光扩增原理图

图3为第三引物对和探针PCR荧光扩增原理图

图4为第四引物对和探针PCR荧光扩增原理图

图5为核酸扩增荧光检测结果分析阴性图

图6为核酸扩增荧光检测结果分析阳性图

【具体实施例】

以下为本发明的实施例：

一种SRY基因引物对和探针的组合，包括一个探针，一对SRY基因引物，其特征在于：所述探针为TaqMan探针，所述一对SRY基因引物为一对基因序列反向的引物；

其中所述的一种关于SRY基因引物对和探针的组合，其特征在于：所述SRY基因序列号位于YP11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1KB编码一个204氨基酸的蛋白质；

一种实时荧光SRY多位点基因检测试剂盒：包括4组如权利要求1或2所述的SRY基因引物对和探针的组合，其特征在于：

所述第一引物对中的正向引物的序列为：

5'CGAACTCTGGCACCTTTCAATT 3'

第一引物对中的反向引物的序列为：

3'CGCTTAACATAGCAGAAGCATATGA5'

第一探针的序列为：

FAM-TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACAATGC-TAMRA

所述第二引物对中的正向引物的序列为：

5'TCTTCCAGGAGGCACAGAAATT 3'

第二引物对中的反向引物的核苷酸序列为：3'TTCCGACGAGGTCGATACTTATAAT5'

第二探针的序列为：

FAM-CAGGCCATGCACAGAGAGAAATACCCG-TAMRA

所述第三引物对中的正向引物的序列为：

5'GCCGAAGAATTGCAGTTTGC3'

第三引物对中的反向引物的序列为：

3'AGTTGCACTTCGCTGCAGAGT5'

第三探针的序列为：

FAM-CCCGCAGATCCCGCTTCGG-TAMRA

所述第四引物对中的正向引物的序列为：

5'ACGAAAGCCACACACTCAAGAA3'

第四引物对中的反向引物的序列为：

3'GTGAGCTGGCTGCGTTGAT5'

第四探针的序列为：

FAM-AGCACCAGCTAGGCCACTTACCGCC-TAMRA

使用该实时荧光SRY多位点基因检测试剂盒，实验证明：从300名男女外周血浆中分离DNA，用实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative polymerase chainreaction，FQ-PCR)的方法检测其中的Y性别决定区(sex-determining region Y，SRY)基因，结果男的98名，98名SRY基因阳性，平均为(1520.00±80.00)拷贝/毫升，女性42名SRY基因阳性(41名为孕早期怀男胎的，其中一位女性未孕但近期有输血史)，其平均浓度为(56.00±40.00)拷贝/毫升，余者均为阴性，结论用实时荧光定量PCR的方法最早在孕42天的孕妇外周血浆中就可以检测到胎儿SRY基因，随孕周的增加，母血中胎儿DNA的量也在逐渐增加，但有输血史或器官移植的女性不适宜检测SRY基因。

样本数据显示如下：

发明的检测原理在于，从孕妇外周血浆中分离出胎儿DNA，若能扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性。该法可对一滴血、一根毛发、多年的尸块、胎儿、有争议的性别进行性别鉴定。广泛应用于法医鉴定、无创孕期胎儿性别鉴定，及对有性别争议的运动员体检等。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

以下为检测原理：

Ct值的定义：

在荧光定量PCR技术中，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数

荧光域值(threshold)的设定

PCR反应的前10个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-10个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold＝10′SDcycle 6-10

Ct值与起始模板的关系

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系即起始拷贝数越多，Ct值越小。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量PCR所使用的荧光化学现将其原理简述如下：

TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

在检测过程当中所需要的具体步骤以及器材如下：

DNA的提取，可以采取下列器材和步骤

提取液Ⅰ由中山大学达安基因股份公司提供的核酸提取试剂盒(磁珠法)(粤穗食药监械(准)字2012第1400100号)，本试剂盒中的提取过程，具体操作频骤请按照试剂盒说明书指引进行。

提取液Ⅱ由上海莱枫生物科技有限公司提供，提取液Ⅱ组成成分:Buffer CF1、Proteinase K、Buffer CF2、Buffer CF3、Buffer GB、Buffer WAS、Buffer WB2、DNA吸附柱-CS、收集管、TE、3ml吸管、1.5ml离心管(用于洗脱)。

普遍认为血液在凝固过程中发生凋亡释放DNA到血清中，因此从血浆中提取cfDNA更能反映生物状态。

推荐使用EDTA-K2作为抗凝剂分离血浆。

推荐2次离心的方法分离血浆[3]：4℃,1,600g离心10min分离血浆勿触动白膜层；4℃,16,000g离心10min仔细吸取上清。

采用核酸富集试剂沉淀浓缩DNA，蛋白酶K裂解沉淀物释放DNA，Buffer GB调整DNA结合条件后，释放的DNA被选择性吸附到硅胶膜上，能有效回收≥50bp的DNA片段，包括cfDNA和病毒DNA，能去除残留的相对完整的细胞核染色体DNA，提取过程无需添加CarrierRNA/DNA，避免了细胞核染色体DNA、Carrier RNA/DNA残留而干扰核酸浓度的测定，使用DNA吸附柱-CS回收DNA，最小洗脱体积10μl，将DNA模板加入0.2ml薄壁PCR反应管中600g离心10秒后上机扩增。

检验原理

本试剂盒利用荧光PCR技术，以SRY基因组中相对保守区为靶区域，设计引物及荧光探针，在样本核酸纯化之后，通过PCR对SRY DNA进行快速定性检测。

使用本试剂盒提供的核酸提取试剂对临床样本进行处理和核酸提取，以试剂盒中提供的PCR检测试剂配制成PCR反应管，将提取的核酸加入PCR反应管，使用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT值)实现对未知样本的定性检测。

主要组成成份

注：不同批号试剂盒的以上成分不可以互换使用。

储存条件及有效期

经包装后的试剂盒(包含核酸提取试剂、制控品及阳性定量参考品组分、PCR检测试剂组分)保存于—20±5℃环境下，有效期9个月。

避免反复冻融。冻融次数不超过4次。试剂开瓶后，在室温条件下放置时间不应超过8小时。运输采用干冰(或者冰袋)保持低温，运输时间不应超过4天。

适用仪器ABI Prism 7300ABI Prism 7500,LightCycler480,DA7600

样本要求

适用标本类型：血清、血浆、体液或组织。

1 标本采集：

1.1 血清一用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22～25℃)放置30～60min,血标本可自发安完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5分钟：吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。

1.2 血浆—用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA-2K(乙二胺四乙酸二钾)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒下班管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5～10min后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管。

2 标本保存和运送：所采集的标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃，可存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。

检验方法

提取方法1：按以下步骤使用DNA提取液I进行核酸提取。

提取方法2：使用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取试剂盒(磁珠法)，本试剂盒中的提取过程，具体操作频骤请按照试剂盒说明书指引进行。

1 DNA提取(样本制备区)

将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、SRY强阳性临界阳性质控品进行同步处理。

1.1 2次离心的方法分离血浆[3]：4℃,1,600g离心10min分离血浆勿触动白膜层；4℃,16,000g离心10min仔细吸取上清200μ1样品，加入450μ1DNA提取液I，用振荡器剧烈振荡混匀10秒，瞬时离心数秒。100℃恒温处理10±1分钟；

1.2 12，000g离心5分钟，备用。

2 PCR试剂准备(试剂准备区)

直接使用SRY反应混合液管分装至PCR反应管48ul/管。

3 加样(样本制备区)

往上述SRY反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、SRY阴性质控品、SRY强阳性质控品、SRY临界阳性质控品和阳性定量参考品的上清各2μl。盖紧管盖，8，000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。

4 PCR扩增(扩增和产物分析区)

4.1 ABI Prism 7500仪器设置(7300参照此操作)

4.1.1 打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控(NTC)、阳性质控以及未知样本(Unknow)、阳性定量参考品(Standard)，并在“Sample Name”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：Reporter Dyel：FAM，Quencher Dyel：none；Reporter Dye2：VIC，Quencher Dye2：none；Passive Reference：Rox。

4.1.2 打开instrument窗口，设置循环条件如下：

94℃ 2分钟，

93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环，

93℃ 40秒→55℃ 55秒→30个循环

保存文件，运行。

4.2 LightCycler480仪器设置

4.2.1 打开软件后，选择“New Experiment”，设置检测模式为“Multi ColorHydrolysis Probe”，检测通首为FAM，VIC。

4.2.2 设置循环条件：

4.2.3 选择“Sample Editor”，设定样品的名称、类型，在“StandardConcentration”框中输入阳性定量参考品浓度，设置完成后，保存文件，运行程序。

4.3 DA7600仪器设置

4.3.1 打开软件后，在设置程序参数界面中，设置扩增程序和温度设置，条件如下：

4.3.2 点击样本参数界面，按样本对应顺序设置阴性质控(NTC)、阳性质控以及未知样本(UNK)，并在“样本名称”一栏中设置样本名称：阳性定量参考品在“样品类型”中选择“标准”，“标准浓度”中输入浓度。探针染料类型选择：FAM和HEX。

4.3.3 设置完成后，保存文件，运行程序。

5 结果分析

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，使基线位于扩增曲线指数期，设整阴笥质控品的扩增曲线平直或低于阈值钱)，点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果，记录未知样本数值(C)。

其中：阴性图5所示，阳性如图6所示。

6 质量控制

阴性质控品：FAM检测通路扩增曲无对数增长期或Ct值等于30，VIC检测通路扩增曲线为明显对数增长期；

SRY阳性质控品：FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期且Ct值小于30，SRY强阳性质控品定值范围在2.0×10⁵～8.0×10⁶拷贝/毫升；SRY临界阳性质控品定品定值范围在3.0×1.0²～10⁴拷贝/毫升；SRY阳性定量参考品：FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型曲线，CT值＜29，且R≥0.98；

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

7 结果判断

7.1 如果在FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期或Ct值等于30，在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期，则判样品的SRY DNA浓度小于检测灵敏度。

7.2 如果在FAM检测通道扩增曲线有对数增长期且Ct值小于30，则按以下方法判断：

若样品的C＜100，则该样品的SRY DNA浓度＜100拷贝/毫升；

若样品的100≤C≤5.00E+008，则该样品的SRY DNA浓度＝C拷贝/毫升；

若样品的C＞5.00E+008，则该样品的SRY DNA浓度＞5×10⁸拷贝/毫升。如果需要精确定量结果，可将样品阴性质控品稀释到线性范围后再检测。则该样品的SRY DNA浓度＝(C×稀释倍数)拷贝/毫升。

检验结果的解释

1每次实验均需检测阴性质控品，SRY强阳性质控品，SRY临界阳性质控品，质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判定。

2阳性结果判定标准：在FAM检测通道扩增曲线有对数增长期且Ct值小于30。

3阴性结果判定标准：在FAM检测通首扩增曲线无明显对数增长期或Ct值等于30，在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期。

检验方法的局限性

1本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

2样本检测结果和样本收集、处理、运送及保存质量有关，其中任务失误都将会导致假阴性结果。如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。

3临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员，应严格按照说明书要求进行操作。

4本试剂盒检测仅限于规定的样本类型及适用机型。

产品性能指标

1 国家参考品检测的符合情况：检测中国药品生物制品检定所的SRY核酸定量标准品，阴性参考品检出均为阴性，阳性参考品检出均为阳性，线性及灵敏度参考品L0-L6全部检测为阳性，定量范围符合质量标准。

2 最低检出限及定量限：本试剂盒的最低检出限浓度为30拷贝/毫升，最低定量浓度为100拷贝/毫升。最低定量浓度为试剂盒的线性范围下限；最低检出限的确定：梯度稀释SRY样本，各浓度重复检测30次，以检出率为100％的浓度作为最低检出限，验证所采用的SRY基因包括国内常见的血型人群。

3 精密度：检测高浓度(5×10⁶拷贝/毫升)、中浓度(5×10⁴拷贝/毫升)、低浓度(1000拷贝/毫升)样本，批内及批间的检测浓度对数值的变异系数(CV％)均小于5％。

4 线性范围：本试剂盒的线性范围为100拷贝/毫升～5.0×10⁸拷贝/毫升。以高浓度的SRY定值样本，梯度稀释9个浓度为待检样本，分析理论值呈现良好的线性相关，相关系数大于0.99。

5 对不同基因型的覆盖：本试剂盒对常见的人类SRY样本，均可在最低检出限浓度检出为阳性。

6 6分析特异性：

1)临床特异性：对8份临床SRY DNA阴性样本进行检测，结果均为阴性。

2)交叉反应：经验证与下列病原体无交叉反应：

甲型肝炎病毒(HAV)	戊型肝炎病毒(HEV)	甲型流感病毒(IAV)
			丙型肝炎病毒(HCV)	EB病毒(EBV)	人乳头瘤病毒(HPV)
乙型肝炎病毒(HBV)	梅毒螺旋体(TP)	单纯疱疹病毒1型(HSV1)
			丁型肝炎病毒(HDV)	人类免疫缺陷病毒(HIV)	单纯疱疹病毒2型(HSV2)

3)干扰物质：胆红素浓度不大于30mg/dL、甘油三脂浓度不大于3200mg/dL、血红蛋白浓度不大于28g/dL、白蛋白浓度不大于6g/dL、总IgG浓度不大于16g/L对检测结果不影响。

4)药物影响：临床常用药物a-干扰素、拉米夫定(Lamivudine)、阿得福韦(Adefovir)、恩替卡韦(Entecavir)药峰浓度下不影响试剂盒的检测结果。

7 对比试验研究：临床试验结果显示，本试剂盒与对照试剂的总符合率为100％；对血清和血浆两种类型样本检测结果无差异。

本试剂盒包括：4对SRY基因引物和4条TaqMan探针，其主要保护的是(SRY基因引物对、TaqMan探针的基因序列，以及按照SRY基因引物对和TaqMan探针的组合方式)利用荧光PCR技术，以基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，提取过的血浆DNA通过PCR定量检测，在检测时利用多个靶基因联合检测等可进一步提高检测的灵敏度和特异度，实时荧光定量PCR技术在进行无创伤性产前性别检测及成人性别鉴定中有重要的价值。细致地说，进行检测时，包括：样品处理液、PCR反应液1、PCR反应液2、PCR反应液3和PCR反应液4。

每一个反应液中，其区别特征在于正向引物、反向引物、以及探针的核苷酸序列，可以采取相同部分的是：Hotstart Fluo-PCR mix、cDNA、无菌去离子水

实时荧光SRY多位点基因检测盒

全面：涵盖了Y染色体SRY基因中的4个靶基因。

准确：灵敏度高,特异强推荐方法结果符合率100％。

简便：操作简单，PCR结束后无须后续样本操作。

快速：从DNA提取至结果输出不超过2小时。

可靠：单管检测SRY DNA,灵敏度更高，重复性更好。

无污染：闭管检测，无需电泳等PCR产物后处理，有效避免了PCR产物引起的污染。

以上内容仅为优选下的实施例方案，不因此而限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 胡松

<120> SRY基因引物对与探针的组合和SRY多位点检测试剂盒

<130> 2015

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaactctgg cacctttcaa tt 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcttaacat agcagaagca tatga 25

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtcgcactc tccttgtttt tgacaatgc 29

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcttccagga ggcacagaaa tt 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttccgacgag gtcgatactt ataat 25

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caggccatgc acagagagaa atacccg 27

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gccgaagaat tgcagtttgc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agttgcactt cgctgcagag t 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccgcagatc ccgcttcgg 19

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgaaagcca cacactcaag aa 22

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtgagctggc tgcgttgat 19

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agcaccagct aggccactta ccgcc 25

Claims (1)

1.一种实时荧光SRY多位点基因检测试剂盒：包括4组SRY基因引物对和探针的组合，每组组合包含一个探针，一对SRY基因引物；所述探针为TaqMan探针，所述一对SRY基因引物为一对基因序列反向的引物；所述SRY基因序列号位于YP11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1KB编码一个204氨基酸的蛋白质，其特征在于：

所述第一引物对中的正向引物的序列为：

5'CGAACTCTGGCACCTTTCAATT 3'

第一引物对中的反向引物的序列为：

3'CGCTTAACATAGCAGAAGCATATGA5'

第一探针的序列为：

FAM-TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACAATGC-TAMRA

所述第二引物对中的正向引物的序列为：

5'TCTTCCAGGAGGCACAGAAATT 3'

第二引物对中的反向引物的序列为：

3'TTCCGACGAGGTCGATACTTATAAT5'

第二探针的序列为：

FAM-CAGGCCATGCACAGAGAGAAATACCCG-TAMRA

所述第三引物对中的正向引物的序列为：

5'GCCGAAGAATTGCAGTTTGC3'

第三引物对中的反向引物的序列为：

3'AGTTGCACTTCGCTGCAGAGT5'

第三探针的序列为：

FAM-CCCGCAGATCCCGCTTCGG-TAMRA

所述第四引物对中的正向引物的序列为：

5'ACGAAAGCCACACACTCAAGAA3'

第四引物对中的反向引物的序列为：

3'GTGAGCTGGCTGCGTTGAT5'

第四探针的序列为：

FAM-AGCACCAGCTAGGCCACTTACCGCC-TAMRA。