CN102649977B - 用于检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒 - Google Patents

用于检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于：检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRDqPCRMIX、检测目的基因用上下游引物m-bcr-F，m-bcr-R，探针m-bcr-Probe，检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针abl-Probe；其中，m-bcr-F:GGCGCCTTCCATGGAGAC；m-bcr-R:TCCTTGGAGTTCCAACGA；m-bcr-Probe:TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAA；abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG；abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC；abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。

Description

用于检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)以及少数慢性粒细胞白血病(CML)患者体内BCR/ABL(m-bcr)融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。
背景技术
白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病病情进展迅速，自然病程仅有数周至数月。一般可根据白血病细胞系列归属分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。而慢性白血病的发生是由于有功能的已分化成熟细胞过度增生，因此慢性白血病是一种由于信号传导不良或细胞增殖失控所至的疾患，而非成熟障碍所至。慢性白血病常见有慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。由于白血病类型不同，治疗方案及预后亦不尽相同，因此诊断成立后，应进一步分型。关于人类白血病的病因与发病机理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、电离辐射、化学物质，遗传因素及免疫功能异常等。目前认为白血病病因是以上各种因素相互作用的结果。
近十余年来慢性粒细胞白血病(CML)的分子生物学研究不断有新的进展，其中之一就是陆续报道了二十余例BCR(breakpoint cluster region)基因上的断裂点不在M-bcr(majorbreakpoint duster region)而位于m-ber(minor breakpoint dusterregion)、表达相对分子质量为190000 BCR/ABL融合蛋白的CML(P190 CML)。P190 CML是一个罕见的CML分子亚型。除了20％-50％的Ph+ALL表达与CML一样的P210以外，50％-80％的PML-ALL患者BCR基因中的断裂点不在M-bcr内，而位于其5’端上游至少30 kb处，即长70 kb的第1内含子3’端的一半序列上，这一长35 kb的区域，最初又确定了两个片段：bcr-2和bcr-3，其中bcr-3位于bcr-2的5端上游16kb，现该两个片段已统称为m-bcr或mbcrl，融合方式为ela2连接，转录成7.5 kb或7.0 kb的mRNA，翻译成相对分子质量为190 000或185 000的蛋白产物P190bcr-ab1或P185bcr-ab1。由于早期仅发现ALL和急性髓系白血病(AML)表达P190，因此m-bcr被称为ALL型断裂点(ALL-type breakpoint)，P190被认为是特有的(ALL-specific，称为Ph+bcr-ALL或P190 ALL)或急性白血病相关的(AL-associated)。P190CML发现后不久，即有报道P210 CML患者进入加速期、急变期时也可出现P190，提示P190可能与P210 CML疾病进展有关。后又发现70％以上慢性期P210 CML患者初诊时也可检测到数量不等的P190。因而，导致产生P190的BCR-ABL连接类型并非是Ph+AL特有的。但是P190比P210的致癌能力更高，表达更倾向于导致AL表型是无疑的。因此，从CML中筛选出P190个体对于后期的治疗显得尤为重要。
在实际应用中，用于检测BCR/ABL(m-bcr)融合基因表达水平的方法主要为荧光原位杂交，尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，结果判读存在较大的主观性，因而一定程度上限制了该法的应用。
实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR进行实时检测，可准确反映患者体内BCR/ABL(m-bcr)的表达情况，节约了大量的检测时间，还避免了残留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于BCR/ABL(m-bcr))的基因检测。
发明内容
鉴于现有技术中检测BCR/ABL(m-bcr)的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒。
用于检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT Kit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于：
检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物m-bcr-F，m-bcr-R，探针m-bcr-Probe，检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针abl-Probe；其中，
m-bcr-F：GGCGCCTTCCATGGAGAC
m-bcr-R：TCCTTGGAGTTCCAACGA
m-bcr-Probe：TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAA
abl-F：GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R：ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe：FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
所述阳性对照品分别为含有BCR/ABL(m-bcr)基因的溶液；所述阴性对照品为无BCR/ABL(m-bcr)基因的溶液。
其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit为TOYOBO公司生产的qPCR用cDNA试剂盒产品。
THUNDERBIRD qPCR MIX为TOYOBO公司生产的定量PCR试剂，产品规格为QPS-101。
使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，可以对BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因的表达水平进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。采用双标准曲线法，通过构建BCR/ABL(m-bcr)和内参基因abl的标准定量曲线，精确定量样本的内参基因拷贝数和BCR/ABL(m-bcr)拷贝数，相比于以往的免疫组化方法和现今的ΔCT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)早期预防、早期诊断的辅助性指标；还可对于疑似进入慢性粒细胞白血病(CML)加速期、急变期的高危人群进行较为准确的筛查。
附图说明
图1：阳性结果示意图。
图2：阴性结果示意图。
具体实施方式
实施例1
本发明的用于检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒，包括：
红细胞裂解液；
TRIzol；
氯仿；
无水乙醇；
ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司)；
检测体系PCR反应液：THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)、BCR/ABL(m-bcr)上、下游引物各0.8uM、BCR/ABL(m-bcr)探针0.4uM；abl上、下游引物各0.8uM、abl-probe(探针)0.4uM；其中：
m-bcr-F：GGCGCCTTCCATGGAGAC
m-bcr-R：TCCTTGGAGTTCCAACGA
m-bcr-Probe：TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAA
abl-F：GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R：ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe：FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
阳性对照品：分别含BCR/ABL(m-bcr)基因组溶液；
阴性对照品：不含BCR/ABL(m-bcr)基因组溶液。
实施例2
本发明试剂盒的使用方法：
(1)抽提血液中的组织RNA：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20ulRNase-free水溶解沉淀。
(2)参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。
(3)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装：
X＝23ul反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
(4)加样：加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。
(5)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃ 35sec 40个循环，荧光信号于58℃ 35sec时采集。
(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。
1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准：，Ct＜36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。
实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本
取送检的急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)以及少数慢性粒细胞白血病(CML)患者抗凝血标本共50例，按实施例2所述方法提取基因组RNA、配制试剂并检测。
每份标本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测38份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。
实验结果与特检实验室的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。部分阳性结果如下表：
表1为本次实验结果和PCR实验室结果的对比，从上表可以看出，18例样本全部与特检的检测结果相符，符合率达到100％。说明本发明检测试剂盒与特检利用常规荧光定量方法相比，不但检测结果准确性高，而且缩短了检测时间，提高了检测效率。
实施例4临床样品检测
取待检的临床样品2份，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
每份样品加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。
样品1的检测结果图如图1所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品1的P190CT值＜36之前有扩增信号，所以样品1为P190阳性。
样品2的检测结果图如图2所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品2的P190CT值＞38之后无扩增信号，所以样品2为P190阴性。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  南京艾迪康医学检验所有限公司
 
<120>  用于检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒
 
<130> 
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
ggcgccttcc atggagac                                                   18
 
 
<210>  2
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
tccttggagt tccaacga                                                   18
 
 
<210>  3
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
tttgagcctc agggtctgag tgaa                                            24
 
 
<210>  4
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
gccgtgaaga ccttgaagga g                                               21
 
 
<210>  5
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
atgatataga acgggggctc                                                 20
 
 
<210>  6
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
acctggtgca gctccttggg                                                 20
 
 

Claims (2)

1.用于检测白血病BCR/ABL m-bcr P190融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT Kit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于：
检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物m-bcr-F，m-bcr-R，探针m-bcr-Probe，检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针abl-Probe；其中，
m-bcr-F: GGCGCCTTCCATGGAGAC
m-bcr-R: TCCTTGGAGTTCCAACGA
m-bcr-Probe: TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述阳性对照品为含有BCR/ABL(m-bcr)基因的溶液；所述阴性对照品为无BCR/ABL(m-bcr)基因的溶液。
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