CN103667457A - 检测白血病BCR/ABL b3a2，b2a2融合基因相对表达量的引物和方法 - Google Patents

检测白血病BCR/ABL b3a2，b2a2融合基因相对表达量的引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测白血病BCR/ABL融合基因相对表达量的引物，包括（1）检测目的基因用上下游引物b3a2-F，b2a2-F，b3a2/b2a2-R，探针b3a2/b2a2-Probe，和（2）检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针abl-Probe。本发明还公开了检测白血病BCR/ABL融合基因相对表达量的方法，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。

Description

检测白血病BCR/ABL b3a2,b2a2融合基因相对表达量的引物和方法
本申请是申请号为201210126663.9、申请日2012年4月25日的中国专利申请的分案申请。 
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类慢性粒细胞白血病（CML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）以及少数的急性粒细胞白血病（AML）患者体内BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。 
背景技术
白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病病情进展迅速，自然病程仅有数周至数月。一般可根据白血病细胞系列归属分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。而慢性白血病的发生是由于有功能的已分化成熟细胞过度增生，因此慢性白血病是一种由于信号传导不良或细胞增殖失控所至的疾患，而非成熟障碍所至。慢性白血病常见有慢性粒细胞性白血病（CML）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）。由于白血病类型不同，治疗方案及预后亦不尽相同，因此诊断成立后，应进一步分型。关于人类白血病的病因与发病机理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、电离辐射、化学物质，遗传因素及免疫功能异常等。目前认为白血病病因是以上各种因素相互作用的结果。 
人类abl基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和2～11共12个外显子。转录始自1b或1a，形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb，合成的两种蛋白质分子量均约为145，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。bcr基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。蛋白产物分子量均为160。bcr蛋白第1～63个氨基酸是二聚体化结构，参与bcr蛋白多聚体的形成。bcr蛋白参与细胞周期调节，但详细过程还不十分明确。bcr基因断裂点集中在三个区域：主要(major bcr，M-bcr)、次要(minor bcr，m-bcr)和μ(μ-bcr)区域。abl基因断裂位于 第1或第2内含子。因断裂点不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。慢性粒细胞白血病的bcr基因断裂点常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。 
在实际应用中，用于检测BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因表达水平的方法主要为荧光原位杂交，尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，结果判读存在较大的主观性，因而一定程度上限制了该法的应用。 
实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR进行实时检测，可准确反映患者体内BCR/ABL(b3a2，b2a2)的表达情况，节约了大量的检测时间，还避免了残留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于BCR/ABL(b3a2，b2a2)的基因检测。 
发明内容
鉴于现有技术中检测BCR/ABL(b3a2，b2a2)的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测白血病BCR/ABL融合基因相对表达量的试剂盒。 
用于检测白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT Kit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于： 
检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物b3a2-F，b2a2-F，b3a2/b2a2-R，探针b3a2/b2a2-Probe，检测内参基因Abl用引物abl-F，abl-R，探针abl-Probe；其中， 
b3a2-F:GATTTAAGCAGAGTTCA 
b2a2-F:TGTGTGAAACTCCAGACTGT 
b3a2/b2a2-R:TCCTTGGAGTTCCAACGA 
b3a2/b2a2-Probe:FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRA 
abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG 
abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC 
abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。 
所述阳性对照品分别为含有b3a2、b2a2基因的溶液；所述阴性对照品为无b3a2和b2a2基因的溶液。 
其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit为TOYOBO公司生产的qPCR用cDNA试剂盒产品。 
THUNDERBIRD qPCR MIX为TOYOBO公司生产的定量PCR试剂，产品规格为QPS-101。 
使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，可以对BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因的表达水平进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。采用双标准曲线法，通过构建BCR/ABL(b3a2，b2a2)和内参基因abl的标准定量曲线，精确定量样本的内参基因拷贝数和BCR/ABL(b3a2，b2a2)拷贝数，相比于以往的免疫组化方法和现今的△CT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。可用于辅助临床上慢性粒细胞白血病（CML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）以及少数的急性粒细胞白血病（AML）的早期诊断、早期预防及高危人群的筛选。 
附图说明
图1：b2a2阳性结果示意图。 
图2：b2a2阴性结果示意图。 
图3：b3a2阳性结果示意图。 
图4：b3a2阴性结果示意图。 
具体实施方式
实施例1 
本发明的用于检测白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相对表达量的试剂盒，包括： 
红细胞裂解液； 
TRIzol； 
氯仿； 
无水乙醇； 
ReverTra Ace qPCR RT Kit（TOYOBO公司）； 
检测体系PCR反应液：THUNDERBIRD Probe qPCR Mix（2×）、b3a2/b2a2上、下游引物各0.8uM、b3a2/b2a2-probe（探针）0.4uM；abl上、下游引物各0.8uM、abl-probe（探针）0.4uM；其中： 
b3a2-F:GATTTAAGCAGAGTTCA； 
b2a2-F:TGTGTGAAACTCCAGACTGT； 
b3a2/b2a2-R:TCCTTGGAGTTCCAACGA； 
b3a2/b2a2-Probe:FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRA； 
abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG； 
abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC； 
abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA 
阳性对照品：分别含BCR/ABL(b3a2，b2a2)基因组溶液； 
阴性对照品：不含BCR/ABL(b3a2，b2a2)基因组溶液。 
实施例2 
本发明试剂盒的使用方法： 
（1）抽提血液中的组织RNA:在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm4℃离心10min，弃上清，加入75%乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20ulRNase-free水溶解沉淀。 
（2）参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。 
（3）试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装： 
X=23ul反应液×（8份内参（标准曲线）+8份目的基因（标准曲线）+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）； 
（4）加样：加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。 
（5）检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500（美国Applied Biosystems公司）等。反应条件：95℃预变性1min；95℃ 15s，58℃ 35sec 40个循环，荧光信号于58℃ 35sec时采集。 
（6）结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。 
1）内参阳性时，检测结果才认为有效； 
2）阳性判断标准：，Ct<36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。 
实施例3 
采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本 
取送检的慢性粒细胞白血病（CML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）以及少数的急性粒细胞白血病（AML）患者抗凝血标本20例，按实施例2所述方法提取基因组RNA、配制试剂并检测。 
每份标本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测38份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。 
实验结果与特检实验室的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。部分阳性结果如下表： 
Figure BDA0000418403910000051
表1为本次实验结果和PCR实验室结果的对比。从上表可以看出，46例样本中有45例与PCR的检测结果相符，符合率达到97.8%。说明本发明检测试剂盒与特检利用常规荧光定量方法相比，不但检测结果准确性高，而且缩短了检测时间，提高了检测效率。 
实施例4 临床样品检测 
取待检的临床样品4份，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。 
每份样品加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。 
样品1的检测结果图如图1所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品1的b2a2 CT值<36之前有扩增信号，所以样品1为b2a2阳性。 
样品2的检测结果图如图2所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品2的b2a2 CT值>38之后无扩增信号，所以样品2为b2a2阴性。 
样品3的检测结果图如图3所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品3的b3a2 CT值<36之前有扩增信号，所以样品3为b3a2阳性。 
样品4的检测结果图如图4所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品4的b3a2 CT值>38之后无扩增信号，所以样品4为b3a2阴性。 
  SEQUENCE LISTING
 
<110>  武汉艾迪康医学检验所有限公司
 
<120> 检测白血病BCR/ABL b3a2，b2a2 融合基因相对表达量的引物和方法
 
<130> 
 
<160>  7    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gatttaagca gagttca                                                    17
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
tgtgtgaaac tccagactgt                                                 20
 
 
<210>  3
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
tccttggagt tccaacga                                                   18
 
 
<210>  4
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
agcccttcag cggccagtag catct                                           25
 
 
<210>  5
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
gccgtgaaga ccttgaagga g                                               21
 
 
<210>  6
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
atgatataga acgggggctc                                                 20
 
 
<210>  7
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
acctggtgca gctccttggg                                                 20
 
 

Claims (2)

1.检测白血病BCR/ABL b3a2，b2a2 融合基因相对表达量的引物，其特征在于：所述引物包括：（1）检测目的基因用上下游引物b3a2-F，b2a2-F，b3a2/ b2a2-R，探针b3a2/b2a2-Probe，和（2）检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针abl-Probe；其中，
b3a2-F: GATTTAAGCAGAGTTCA
b2a2-F: TGTGTGAAACTCCAGACTGT
b3a2/b2a2-R: TCCTTGGAGTTCCAACGA
b3a2/b2a2-Probe: FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.检测白血病BCR/ABL b3a2，b2a2 融合基因相对表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）抽提血液中的组织RNA；
（2）将RNA反转为cDNA；
（3）试剂配置：检测体系PCR反应液： THUNDERBIRD Probe qPCR Mix（2×）、b3a2/b2a2上、下游引物各0.8uM、b3a2/b2a2-probe（探针）0.4 uM；abl上、下游引物各0.8uM、abl-probe（探针）0.4uM；其中：
b3a2-F: GATTTAAGCAGAGTTCA；
b2a2-F: TGTGTGAAACTCCAGACTGT；
b3a2/b2a2-R: TCCTTGGAGTTCCAACGA；
b3a2/b2a2-Probe: FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRA；
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG；
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC；
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA
阳性对照品：分别含BCR/ABL(b3a2，b2a2)基因组溶液；
阴性对照品：不含BCR/ABL(b3a2，b2a2)基因组溶液；
（4）加样：加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质；
（5）检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，反应条件：95℃预变性1min；95℃ 15s，58℃ 35sec 40个循环，荧光信号于58℃ 35 sec时采集；
（6）结果判断。
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