CN103555827B - 检测bcr/abl融合基因abl激酶区耐药突变位点的引物、方法和试剂盒 - Google Patents
检测bcr/abl融合基因abl激酶区耐药突变位点的引物、方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了检测BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区耐药突变位点的引物、方法和试剂盒,包括:(ⅰ)扩增M-bcr剪切型和m-bcr剪切型融合基因ABL激酶区的内、外侧引物;(ⅱ)与所述外侧引物互补的反义引物;(ⅲ)一对覆盖BCR/ABL融合基因ABL激酶区全部突变热点的测序引物。采用单管巢式PCR技术,可用于快速检测慢性粒细胞白血病患者体内BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药位点的突变情况。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域,特别涉及检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的引物、方法和试剂盒,采用单管巢式PCR技术,可用于快速检测慢性粒细胞白血病患者体内BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药位点的突变情况。
背景技术
慢性粒细胞白血病(Chronic Myelognous Leukemia,CML)是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。95%的CML患者的异常白细胞中含有一种被名为“费城(Philadelphia)”的染色体,这是因为22号染色体的一段错位到了9号染色体上,而9号染色体上的一段错位到了22号染色体上,22号染色体变短,而且其上形成了一个致癌性的融合基因BCR/ABL。BCR/ABL融合基因导致白细胞中形成一种异常的酪氨酸激酶BCR/ABL蛋白,这种激酶一直保持生理活性,使调控细胞复制的信号传导途径一直处于活跃状态,从而源源不断地产生更多的异常白细胞,骨髓正常控制的白细胞生成被破坏,最终导致CML形成。
BCR基因断裂点集中在三个区域:主要(major bcr,M-bcr)、次要(minor bcr,m-bcr)和μ(μ-bcr)。ABL基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一,BCR-ABL融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。同时BCR基因断裂点的不同也就意味着存在不同的剪切型,常见的三种剪切型为M-bcr、m-bcr和μ-bcr:(1)M-bcr剪切型,在典型的CML中,大部分融合基因是在主要断裂点簇集区(M-bcr)内断裂融合而成,由此形成的BCR/ABL融合mRNA是由b3a2或b2a2转录而成,其最终产物是胞浆蛋白P210,这种癌蛋白是绝大多数慢性期CML表型异常的根源所在;(2)m-bcr剪切型,当BCR基因断裂点发生在上游的一段长约54.4kb的内含子,也称m-bcr区,产生一个e1a2接头的杂合mRNA,编码P190融合蛋白;(3)m-bcr剪切型,BCR断裂点也可在M-bcr区的下游,即μ-bcr,产生e19a2融合,编码P230融合蛋白。
格列卫(Glivec)是一种新型的治疗CML的小分子化学药物,活性成份为甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate),广泛用于治疗CML急变期、加速期或α-干扰素治疗失败后的慢性期患者。它直接靶向导致CML的异常酪氨酸激酶BCR/ABL,通过抑制这个酶的活性从而抑制更多的癌细胞产生,同时它能诱导已形成的癌细胞凋亡。已有研究发现对处于CML暴发期的病人而言,格列卫刚开始有疗效,但是一段时间之后,CML很可能复发。据估计,大约有5%至10%的处在慢性阶段的CML病人会对格列卫产生耐药性,并且如果在较晚阶段才开始治疗CML,产生耐药性的比例则更高。其原因可能在于BCR/ABL融合基因ABL激酶区序列发生突变,导致BCR/ABL蛋白发生变异,构象发生变化,格列卫不再能够与变异的蛋白结合来抑制其活性。
对CML而言,突变克隆的扩增可能是一个渐进的过程,开始阶段突变克隆比例较低,但一旦出现会很快增高并导致疾病恶化。耐药性的突变往往出现于CML急变期前或伴随急变期出现,因此定期监测突变情况是必要的,可以及早发现突变并相应调整治疗方案。对于某些预后不良的突变来说,在低水平时就较早地检测出来是非常有意义的。常见性BCR/ABL融合基因ABL激酶区突变位点如图1所示。
目前用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区突变的方法主要为传统的两管巢式PCR法,长期以来,巢式PCR由于其能够提高产物的特异性和扩大产率而得到广泛的应用,但两管巢式PCR法易产生气溶胶污染的弊端一直难以克服。因而,限制了该法在临检中心等一些实验密度较高、项目多的实验室中的应用。
发明内容
本发明采用单管巢式PCR技术,可用于快速检测慢性粒细胞白血病(CML)患者体内BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药位点的突变情况。
本发明提供一种检测检测BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区耐药突变位点的引物,包括:
(i)扩增M-bcr剪切型ABL激酶区的M-bcr剪切型外侧引物、M-bcr剪切型内侧引物以及与所述M-bcr剪切型外侧引物互补的M-bcr剪切型反义引物
所述M-bcr剪切型外侧引物的碱基序列为:
M-bcr-Outer-F:GCAACGGCAAGAGTTACACGTTCCTGAT
M-bcr-Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA;
所述M-bcr剪切型内侧引物的碱基序列为:
M-bcr-Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
M-bcr-Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT;
所述M-bcr剪切型反义引物的碱基序列为:
M-bcr-Anti-Sense-F:CTCATCAGGAACGTCAT
M-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG;
(ii)扩增m-bcr剪切型ABL激酶区的m-bcr剪切型外侧引物、m-bcr剪切型内侧引物以及与所述m-bcr剪切型外侧引物互补的m-bcr剪切型反义引物
所述m-bcr剪切型外侧引物的碱基序列为:
m-bcr Outer-F:CTCGCAGAACTCGCAACAGTCCTTCGAC
m-bcr Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA;
所述m-bcr剪切型内侧引物的碱基序列为:
m-bcr Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
m-bcr Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT;
所述m-bcr剪切型反义引物的碱基序列为:
m-bcr-Anti-Sense-F:TTCGTCGAAGGACTAGT
m-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG
进一步地,所述引物还包括一对覆盖BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区全部耐药突变位点的测序引物,所述测序引物的碱基序列为:
Seq-F:TTCTGATGGCAAGCTCTACG
Seq-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT
进一步地,所述M-bcr剪切型外侧引物、所述M-bcr剪切型内侧引物和所述M-bcr剪切型反义引物的摩尔比为M-bcr-Outer-F:M-bcr-Outer-R:M-bcr-Inner-F:M-bcr-Inner-R:M-bcr-Anti-Sense-F:M-bcr-Anti-Sense-R=1:1:2:2:1:1
进一步地,所述m-bcr剪切型外侧引物、所述m-bcr剪切型内侧引物和所述m-bcr剪切型反义引物的摩尔比为m-bcr Outer-F:m-bcr Outer-R:m-bcr Inner-F:m-bcr Inner-R:m-bcr-Anti-Sense-F:m-bcr-Anti-Sense-R=1:1:2:2:1:1
本发明还提供一种扩增BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区的PCR方法,其特征在于:
(1)提取血液中的RNA;
(2)将步骤(1)中提取出的RNA逆转录为cDNA;
(3)在同一管中进行两轮PCR扩增:在第一轮扩增中,加入扩增BCR/ABL融合基因ABL激酶区的外侧引物进行扩增;在第二轮扩增中,加入扩增BCR/ABL融合基因ABL激酶区的内侧引物以及与所述外侧引物互补的反义引物进行扩增,从而获得扩增产物,其中
当扩增M-bcr剪切型ABL激酶区时,所述外侧引物为M-bcr剪切型外侧引物,其碱基序列为:
M-bcr-Outer-F:GCAACGGCAAGAGTTACACGTTCCTGAT
M-bcr-Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA
所述内侧引物为M-bcr剪切型内侧引物,其碱基序列为:
M-bcr-Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
M-bcr-Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT
所述反义引物为与所述M-bcr剪切型外侧引物互补的M-bcr剪切型反义引物,其碱基序列为:
M-bcr-Anti-Sense-F:CTCATCAGGAACGTCAT
M-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG;
当扩增m-bcr剪切型ABL激酶区时,所述外侧引物为M-bcr剪切型外侧引物,其碱基序列为:
m-bcr Outer-F:CTCGCAGAACTCGCAACAGTCCTTCGAC
m-bcr Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA
所述内侧引物为m-bcr剪切型内侧引物,其碱基序列为:
m-bcr Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
m-bcr Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT
所述反义引物为与所述m-bcr剪切型外侧引物互补的m-bcr剪切型反义引物,其碱基序列为:
m-bcr-Anti-Sense-F:TTCGTCGAAGGACTAGT
m-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG。
本发明还提供一种检测BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区耐药突变位点的PCR方法,其特征在于:
(1)提取血液中的RNA;
(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA;
(3)在单管中进行两轮PCR扩增:在第一轮扩增中,加入扩增BCR/ABL融合基因ABL激酶区的外侧引物进行扩增;在第二轮扩增中,加入扩增BCR/ABL融合基因ABL激酶区的内侧引物以及与所述外侧引物互补的反义引物进行扩增,从而获得扩增产物,其中
当扩增BCR/ABL融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区时,所述外侧引物为M-bcr剪切型外侧引物,其碱基序列为:
M-bcr-Outer-F:GCAACGGCAAGAGTTACACGTTCCTGAT
M-bcr-Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA
所述内侧引物为M-bcr剪切型内侧引物,其碱基序列为:
M-bcr-Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
M-bcr-Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT
所述反义引物为与所述M-bcr剪切型外侧引物互补的M-bcr剪切型反义引物,其碱基序列为:
M-bcr-Anti-Sense-F:CTCATCAGGAACGTCAT
M-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG;
当扩增BCR/ABL融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区时,所述外侧引物为m-bcr剪切型外侧引物,其碱基序列为:
m-bcr Outer-F:CTCGCAGAACTCGCAACAGTCCTTCGAC
m-bcr Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA
所述内侧引物为m-bcr剪切型内侧引物,其碱基序列为:
m-bcr Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
m-bcr Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT
所述反义引物为与所述m-bcr剪切型外侧引物互补的m-bcr剪切型反义引物,其碱基序列为:
m-bcr-Anti-Sense-F:TTCGTCGAAGGACTAGT
m-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG
(4)利用一对覆盖BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区全部耐药突变位点的测序引物对(3)中的扩增产物进行测序,其中所述测序引物的碱基序列为:
Seq-F:TTCTGATGGCAAGCTCTACG
Seq-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT
(5)将(4)中的测序结果与BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区野生型参考序列进行比对,判断耐药突变位点是否存在。
本发明提供了一种检测BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区耐药突变位点的试剂盒,所述试剂盒包括RNA提取液;逆转录试剂;检测体系PCR反应液;测序体系反应液;阳性对照品、阴性对照品和空白对照品,其特征在于,所述检测体系PCR反应液;扩增所述融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区的M-bcr剪切型外侧引物、扩增所述融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区的M-bcr剪切型内侧引物以及与所述M-bcr剪切型外侧引物互补的M-bcr剪切型反义引物;扩增所述融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区的m-bcr剪切型外侧引物、扩增所述融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区的m-bcr剪切型内侧引物以及与所述m-bcr剪切型外侧引物互补的m-bcr剪切型反义引物,其中
所述M-bcr剪切型外侧引物的碱基序列为:
M-bcr-Outer-F:GCAACGGCAAGAGTTACACGTTCCTGAT
M-bcr-Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA
所述M-bcr剪切型内侧引物的碱基序列为:
M-bcr-Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
M-bcr-Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT
所述M-bcr剪切型反义引物的碱基序列为:
M-bcr-Anti-Sense-F:CTCATCAGGAACGTCAT
M-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG
所述m-bcr剪切型外侧引物的碱基序列为:
m-bcr Outer-F:CTCGCAGAACTCGCAACAGTCCTTCGAC
m-bcr Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA
所述m-bcr剪切型内侧引物的碱基序列为:
m-bcr Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
m-bcr Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT
所述m-bcr剪切型反义引物的碱基序列为:
m-bcr-Anti-Sense-F:TTCGTCGAAGGACTAGT
m-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG
进一步地,所述测序体系反应液包括:测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI以及一对覆盖BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区全部耐药突变位点的测序引物,其中所述测序引物的碱基序列为:
Seq-F:TTCTGATGGCAAGCTCTACG
Seq-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT
进一步地,所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和外切酶I。
进一步地,当检测M-bcr剪切型ABL激酶区时,所述阳性对照品为含有BCR/ABL融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,所述阴性对照品为无BCR/ABL融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质;当检测m-bcr剪切型ABL激酶区时,所述阳性对照品为含有BCR/ABL融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,所述阴性对照品为无BCR/ABL融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
有益效果:本发明根据BCR基因断裂点的不同,分别针对BCR/ABL融合基因剪切型M-bcr中的ABL激酶区突变热点和针对BCR/ABL融合基因剪切型m-bcr中的ABL激酶区突变热点,设计了PCR扩增引物和测序引物。所述的PCR扩增引物包括外侧引物、内侧引物、与所述外侧引物互补的反义引物(antisense primer)。本发明创新性地引入反义引物,该反义引物与外侧引物序列反向互补。当利用内侧引物进行扩增时,反义引物与外侧引物进行互补性结合,从而进一步抑制外侧引物的扩增,减少其对内侧引物扩增的影响。这不仅可以实现单管巢式PCR,而且使本发明具有特异性好、自动化程度高、污染控制好等优点。此外,本发明还对反应体系所需的内、外侧引物及反义引物的合理配比进行优化,并且让反应条件达到最优化,从而省去了繁琐的条件摸索环节,大大提升了实验效率。本发明所采用的单管巢式PCR技术,还利用内、外侧引物间的Tm的差值来减少传统巢式PCR在两管中分别利用内侧引物扩增和外侧引物进行扩增所带来的易污染等不利影响。因此,利用本发明所述引物的扩增BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区的PCR方法优于现有的PCR方法,可以大大提高BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区的扩增准确性和效率。
利用本发明的BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的引物结合单管巢式PCR技术,人们能够检测患者BCR/ABL融合基因ABL激酶区突变,有助于快速准确地诊断患者ABL激酶区突变状况,对于临床上进入CML加速期、急变期患者的治疗和用药有极大的指导意义。
附图说明
图1是BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区突变位点图。
图2样品1的检测结果图;
图3样品2的检测结果图;
图4样品3的检测结果图;
图5样品4的检测结果图;
图6样品5的检测结果图;
图7样品6的检测结果图;
图8样品7的检测结果图;
图9样品8的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图,进一步阐述本发明。应当注意的是,实施例中未说明的常规条件和方法,通常按照所属领域实验人员常规采用方法:比如,奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版,或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区耐药突变位点的试剂盒,包括:RNA提取液:红细胞裂解液、Trizol、氯仿、无水乙醇;逆转录试剂:ReverTraAce qPCR RT Kit(TOYOBO公司);检测体系PCR反应液;测序体系反应液;阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
检测体系PCR反应液包括:2×PCR Buffer;dNTPs(2mM);KOD FX DNAPolymerase(1U/μl);扩增BCR/ABL融合基因剪切型M-bcr中的ABL激酶区的M-bcr剪切型外侧上下游引物M-bcr-Outer-F(10μM)、M-bcr-Outer-R(10μM);扩增BCR/ABL融合基因剪切型M-bcr中的ABL激酶区的M-bcr剪切型内侧上下游引物M-bcr-Inner-F(20μM)、M-bcr-Inner-R(20μM);与扩增BCR/ABL融合基因剪切型M-bcr中的ABL激酶区的M-bcr剪切型外侧上下游引物互补的M-bcr剪切型反义引物:M-bcr-Anti-Sense-F(10μM)、M-bcr-Anti-Sense-R(10μM);扩增BCR/ABL融合基因剪切型m-bcr中的ABL激酶区的m-bcr剪切型外侧上下游引物m-bcr-Outer-F(10μM)、m-bcr-Outer-R(10μM);扩增BCR/ABL融合基因剪切型m-bcr中的ABL激酶区的m-bcr剪切型内侧上下游引物m-bcr-Inner-F(20μM)、m-bcr-Inner-R(20μM);与扩增BCR/ABL融合基因剪切型m-bcr中的ABL激酶区的m-bcr剪切型外侧上下游引物互补的m-bcr剪切型反义引物:m-bcr-Anti-Sense-F(10μM)、m-bcr-Anti-Sense-R(10μM)。
测序体系反应液包括测序纯化液:虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP):0.6U、外切酶I:1.2U;EDTA(125mmol);无水乙醇;75%乙醇;HIDI(高度去离子甲酰胺);一对覆盖BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区全部耐药突变位点的测序引物:Seq-F、Seq-R;以及Bigdye Terminator V3.1(购买自ABI公司)。
检测体系PCR反应液中相关试剂配置如表1和表2所示。
表1:扩增BCR/ABL融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区的检测体系PCR反应液试剂
其中,cDNA是将血液中的RNA提取出来再经逆转录反应而产生的。
表2:扩增BCR/ABL融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区的检测体系PCR反应液试剂
其中,cDNA是将血液中的RNA提取出来再经逆转录反应而产生的。
扩增BCR/ABL融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区的M-bcr剪切型外侧上游引物M-bcr-Outer-F、M-bcr剪切型外侧下游引物M-bcr-Outer-R;m-bcr剪切型外侧上游引物m-bcr-Outer-F、m-bcr剪切型外侧下游引物m-bcr-Outer-R,M-bcr剪切型内侧上游引物M-bcr-Inner-F、M-bcr剪切型内侧下游引物M-bcr-Inner-R、m-bcr剪切型内侧上游引物m-bcr-Inner-F、m-bcr剪切型内侧下游引物m-bcr-Outer-R,与M-bcr剪切型外侧上下游引物互补的M-bcr剪切型反义引物M-bcr-Anti-Sense-F、M-bcr-Anti-Sense-R,与m-bcr剪切型外侧上下游引物互补的m-bcr剪切型反义引物m-bcr-Anti-Sense-F、m-bcr-Anti-Sense-R,以及一对覆盖BCR/ABL融合基因ABL激酶区全部突变热点的测序引物Seq-F、Seq-R的碱基序列如表3所示:
表3
当检测BCR/ABL融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区时,阳性对照品为含有BCR/ABL融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,阴性对照品为无BCR/ABL融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,空白对照品为生理盐水或不加任何物质;
当检测BCR/ABL融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区时,阳性对照品为含有BCR/ABL融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,阴性对照品为无BCR/ABL融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
实施例2
血液RNA提取、逆转录、扩增和测序等操作流程如下所示:
(1)抽提血液中的RNA:在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液,取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min;5000rpm离心5min,弃上清,收集底部的细胞;再次加入0.5ml红细胞裂解液,5000rpm离心5min,弃上清,收集底部的细胞;向细胞中加入1ml Trizol,反复吹打直至沉淀完全溶解,室温静止5min;加入0.2ml氯仿,震荡均匀;14000rpm4℃离心10min,吸取上清层转移至另一新的离心管中;加入等体积的异丙醇,上下充分混匀,室温静置10min;14000rpm4℃离心10min,弃上清,加入75%乙醇1ml,轻轻上下颠倒洗涤管壁;14000rpm4℃离心5min,弃乙醇;室温干燥10-15min,加入20μl RNase-free水溶解沉淀。
(2)逆转录:参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书,将RNA反转为cDNA。
(3)试剂配置:按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl,每人份18μl分装:
X=18μl反应液×(n份血液样品+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测血液样品数。
(4)加样:将2ul步骤(2)中获得的cDNA加入到检测体系PCR反应液中;对阳性对照而言,直接加2ul阳性对照品;对阴性对照实验而言,直接加2ul阴性对照品;对空白对照实验而言,加2ul生理盐水或不加任何物质。
(5)扩增:检测在常规PCR仪上进行,可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。当扩增BCR/ABL融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区时,所用检测体系PCR反应液试剂如实施例1中的表1所示。当扩增BCR/ABL融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区时,所用检测体系PCR反应液试剂如实施例1中的表2所示。
进行扩增时的反应条件如表4所示。
表4:扩增时的反应条件
(6)Sanger测序:
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照如表5所示的反应阶段和反应条件进行纯化,获得纯化产物。
表5
将1μl所获得的纯化产物分别与Seq-F、Seq-R按照如表6所示的体系进行混合。
表6
测序反应程序和反应条件如表7所示。
表7
沉淀环节:
向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的EDTA,静置5min;加入15ml无水乙醇,漩涡混匀;3700rpm离心30min;倒置离心15sec,加入50ml70%乙醇,漩涡混匀;3700rpm离心15min;倒置离心15sec,置于95℃金属浴上;加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序如表8所示。
表8
变性程序结束后,上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断:将测序结果与BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区野生型参考序列(Genbank accn:NM_005157.4/NM_021574.2)进行比对,从而判定该激酶区是否发生突变,以及在哪些位点发生突变。按照欧洲白血病网站(The EuropeanLeukemiaNet)上推荐的ABL激酶区突变热点进行报告。
实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测临床血液样品。
取送检慢性粒细胞白血病(CML)患者抗凝血样品20例,按实施例2所述方法提取血液RNA、配制试剂并检测。
对每例样品而言,取2μl经逆转录产生的cDNA,加入到检测体系PCR反应液中,同时做阳性、阴性、空白对照实验各一次。一台96孔的普通PCR仪可同时检测46份样品,每份样品2次重复,一份阳性对照,一份阴性对照和一份空白对照。检测时间为160分钟。
每个样品经2次测序后,与BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区野生型参考序列(Genbank accn:NM_005157.4/NM_021574.2)进行比对,对于结果不统一的样品将进行第三次测序。此外,检测结果还与采用传统两管巢式PCR并进行测序的结果进行比较,以便评估新、旧方法的优劣。与突变对应的治疗建议参考文献(Michele Baccarani et al.European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia:2013,Blood,August8,2013,122(6):872-884;Simona Soverini et al.Bcr-Abl kinase domain mutationanalysis in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inihibitors:recommendations from an expert panel on behalf of European LeukemiaNet,Blood,August4,2011,118(5):1208-1215)中的内容。
检测结果如表9所示。
表9
从上表可以看出,20例样品中18例与传统两管巢式PCR检测结果的检测结果相符,符合率达到90%,剩下的2例样品经验证为传统方法漏检。这就说明本发明检测试剂盒与传统两管巢式PCR法相比,引入了反义引物,该反义引物与外侧引物序列反向互补。当利用内侧引物进行扩增时,反义引物与外侧引物进行互补性结合,从而进一步抑制外侧引物的扩增,减少其对内侧引物扩增的影响,实现了单管巢式PCR检测。这不但使检测结果准确性高、污染控制好,而且缩短了检测时间,提高了检测效率。
实施例4
取发生耐药现象的临床CML患者血液样品8份,按实施例2所述方法提取血液RNA、配制试剂并检测。对每份样品而言,取2ul经逆转录产生的cDNA,加入到检测体系PCR反应液中,同时做阳性、阴性、空白对照实验各一次。用普通PCR仪检测,时间为160分钟。每份样品经2次测序后,比对突变的情况,对于结果不统一的样品将进行第三次测序。
样品1的检测结果图如图2所示,为A/T杂合,导致E255V杂合突变,建议选择Dasatinib代替Imatinb进行治疗。
样品2的检测结果图如图3所示,为G颠换为A,导致E459K突变,建议加大Imatinb用药量。
样品3的检测结果图如图4所示,为A/C杂合,导致F317L杂合突变,建议选择Nilotinib代替Imatinb进行治疗。
样品4的检测结果图如图5所示,为A/G杂合,导致G250E杂合突变,建议加大Imatinb用药量。
样品5的检测结果图如图6所示,为A颠换为G,导致M244V突变,建议加大Imatinb用药量。
样品6的检测结果图如图7所示,为C/T杂合,导致T315I杂合突变,建议考虑骨髓移植或参与临床试验。
样品7的检测结果图如图8所示,为A/G杂合,导致V379I杂合突变,建议加大Imatinb用药量。
样品8的检测结果图如图9所示,分别为A/T杂合和A/G杂合,导致Y253F杂合突变和E255K杂合突变,建议选择Dasatinib代替Imatinb进行治疗。
从实施例4所述的检测结果可以得出:本发明所述的引物、检测方法可以检测出BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区的多种耐药突变位点。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的引物、方法和试剂盒
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaacggcaa gagttacacg ttcctgat 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgctcttttc gagggagcaa tggagaca 28
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggctctatg ggtttctg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctggaggtc ctcgtctt 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcatcagga acgtcat 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctccaatgga gacacgg 17
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctcgcagaac tcgcaacagt ccttcgac 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgctcttttc gagggagcaa tggagaca 28
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gggctctatg ggtttctg 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cctggaggtc ctcgtctt 18
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttcgtcgaag gactagt 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctccaatgga gacacgg 17
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttctgatggc aagctctacg 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cctggaggtc ctcgtctt 18
Claims (6)
1.检测BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区耐药突变位点的引物,其特征在于,包括:
(i)扩增M-bcr剪切型ABL激酶区的M-bcr剪切型外侧引物、M-bcr剪切型内侧引物以及与所述M-bcr剪切型外侧引物互补的M-bcr剪切型反义引物
所述M-bcr剪切型外侧引物的碱基序列为:
M-bcr-Outer-F:GCAACGGCAAGAGTTACACGTTCCTGAT
M-bcr-Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA;
所述M-bcr剪切型内侧引物的碱基序列为:
M-bcr-Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
M-bcr-Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT;
所述M-bcr剪切型反义引物的碱基序列为:
M-bcr-Anti-Sense-F:CTCATCAGGAACGTCAT
M-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG;
(ii)扩增m-bcr剪切型ABL激酶区的m-bcr剪切型外侧引物、m-bcr剪切型内侧引物以及与所述m-bcr剪切型外侧引物互补的m-bcr剪切型反义引物
所述m-bcr剪切型外侧引物的碱基序列为:
m-bcr Outer-F:CTCGCAGAACTCGCAACAGTCCTTCGAC
m-bcr Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA;
所述m-bcr剪切型内侧引物的碱基序列为:
m-bcr Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
m-bcr Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT;
所述m-bcr剪切型反义引物的碱基序列为:
m-bcr-Anti-Sense-F:TTCGTCGAAGGACTAGT
m-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG;
(iii)一对覆盖BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区全部耐药突变位点的测序引物,所述测序引物的碱基序列为:
Seq-F:TTCTGATGGCAAGCTCTACG
Seq-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT。
2.如权利要求1所述的引物,其特征在于,所述M-bcr剪切型外侧引物、所述M-bcr剪切型内侧引物和所述M-bcr剪切型反义引物的摩尔比为M-bcr-Outer-F:M-bcr-Outer-R:M-bcr-Inner-F:M-bcr-Inner-R:M-bcr-Anti-Sense-F:M-bcr-Anti-Sense-R=1:1:2:2:1:1。
3.如权利要求1所述的引物,其特征在于,所述m-bcr剪切型外侧引物、所述m-bcr剪切型内侧引物和所述m-bcr剪切型反义引物的摩尔比为m-bcr Outer-F:m-bcr Outer-R:m-bcr Inner-F:m-bcr Inner-R:m-bcr-Anti-Sense-F:m-bcr-Anti-Sense-R=1:1:2:2:1:1。
4.一种检测BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区耐药突变位点的试剂盒,所述试剂盒包括RNA提取液;逆转录试剂;检测体系PCR反应液;测序体系反应液;阳性对照品、阴性对照品和空白对照品,其特征在于,所述检测体系PCR反应液;扩增所述融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区的M-bcr剪切型外侧引物、扩增所述融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区的M-bcr剪切型内侧引物以及与所述M-bcr剪切型外侧引物互补的M-bcr剪切型反义引物;扩增所述融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区的m-bcr剪切型外侧引物、扩增所述融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区的m-bcr剪切型内侧引物以及与所述m-bcr剪切型外侧引物互补的m-bcr剪切型反义引物,其中
所述M-bcr剪切型外侧引物的碱基序列为:
M-bcr-Outer-F:GCAACGGCAAGAGTTACACGTTCCTGAT
M-bcr-Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA
所述M-bcr剪切型内侧引物的碱基序列为:
M-bcr-Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
M-bcr-Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT
所述M-bcr剪切型反义引物的碱基序列为:
M-bcr-Anti-Sense-F:CTCATCAGGAACGTCAT
M-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG
所述m-bcr剪切型外侧引物的碱基序列为:
m-bcr Outer-F:CTCGCAGAACTCGCAACAGTCCTTCGAC
m-bcr Outer-R:CGCTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACA
所述m-bcr剪切型内侧引物的碱基序列为:
m-bcr Inner-F:GGGCTCTATGGGTTTCTG
m-bcr Inner-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT
所述m-bcr剪切型反义引物的碱基序列为:
m-bcr-Anti-Sense-F:TTCGTCGAAGGACTAGT
m-bcr-Anti-Sense-R:CTCCAATGGAGACACGG;
所述测序体系反应液包括:测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI以及一对覆盖BCR/ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区全部耐药突变位点的测序引物,其中所述测序引物的碱基序列为:
Seq-F:TTCTGATGGCAAGCTCTACG
Seq-R:CCTGGAGGTCCTCGTCTT。
5.如权利要求4所述的试剂盒,所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和外切酶I。
6.如权利要求4所述的试剂盒,当检测M-bcr剪切型ABL激酶区时,所述阳性对照品为含有BCR/ABL融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,所述阴性对照品为无BCR/ABL融合基因M-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,所述空白对照品为生理盐水;当检测m-bcr剪切型ABL激酶区时,所述阳性对照品为含有BCR/ABL融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,所述阴性对照品为无BCR/ABL融合基因m-bcr剪切型ABL激酶区序列的溶液,所述空白对照品为生理盐水。
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