CN103789415A

CN103789415A - 检测cftr基因δf508位点突变的方法和寡核苷酸

Info

Publication number: CN103789415A
Application number: CN201410005009.1A
Authority: CN
Inventors: 徐建成; 孙翠莲
Original assignee: GUANGZHOU ADICON MEDICAL EXAMINATION INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU ADICON MEDICAL EXAMINATION INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2014-01-04
Filing date: 2014-01-04
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2034-01-04
Also published as: CN103789415B

Abstract

本发明公开了一种高灵敏地检测CFTR基因ΔF508位点突变的寡核苷酸和方法，它们均涉及一对特异性扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，以及一对特异性检测探针SEQ NO 3和SEQ NO 4。本发明具有检测周期短，特异性高，准确度高，灵敏度高，条件依赖少，污染风险低等优点，能够准确、快速地对囊性纤维化和男性不育进行辅助诊断。

Description

检测CFTR基因ΔF508位点突变的方法和寡核苷酸

技术领域

本发明属于基因突变检测领域，具体涉及一种高灵敏地检测CFTR基因ΔF508位点突变的寡核苷酸和方法。

背景技术

囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)是白种人中最常见的致死性常染色体隐性遗传病，其发病率在西欧、北欧及北美人群中较高，约占活产婴儿的1／2500，在亚洲人的发病率较低，约为1／10万。CF的典型临床表现之一就是男性患者伴有先天性双侧或单侧输精管缺如而导致不育。先天性输精管缺如(congenital absence of the vas deferens，CAVD)是睾丸后因素无精子症及男性不育的一个重要原因，其发病与CF基因突变和中肾管发育缺陷有关。

1989年，Rommens等定位克隆并鉴定出导致CF的基因：它位于第7号染色体长臂3区1，2带（7q31-7q32），全长250kb，共有27个外显子和26个内含子，而它的cDNA长6129bp，编码一条1480个氨基酸的肽链，后者被命名为囊性纤维化跨膜转运调节物(cystic fibrosistrans-membrane conductance regulator,CFTR)。CFTR的蛋白结构中含有两个重复的氨基酸基序(motif)，各由6个镶嵌在细胞膜内的疏水环组成的跨膜区和一个亲水的ATP结合点折叠区(nucleotide ATP-binding folds,NBFs),在两个基序之间有一调节CFTR生理功能的R区。

蛋白CFTR是一种氯离子通道蛋白，其跨膜区构成通道蛋白的一部分，而它的R区和NBFs则具有调节通道蛋白氯离子跨上皮细胞膜转运功能的作用，基因突变可使其功能失活，导致具有外分泌功能的上皮组织出现结构缺陷或功能障碍。

近年来许多学者对无其他CF典型症状的先天性双侧输精管缺如(CBAVD)患者CFTR基因外显子和外显子与内含子剪切位点进行了广泛的突变筛查，结果发现其突变频率及热点随种族和地理位置的不同而有差异。其中报道CFTR基因突变以ΔF508(第10外显子第1653—1655位3个碱基TTT缺失，导致肽链第508位苯丙氨酸缺失)最为常见，约占CFTR基因突变的70％。因此检测该位点突变对于男性不育的辅助诊断具有重要意义，同时在人工辅助生殖的植入前诊断也有很重要的价值。

目前，临床对于检测CFTR基因ΔF508位点突变的方法主要有聚合酶链式反应-单链构象多态(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturation gradient gel electrophoresis,PCR-DDGE)、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳-瞬时温度梯度电泳(polymerase chainreaction-temporal temperature gradient gel electrophoresis,PCR-TTGE)、DNA测序以及实时荧光定量PCR等。PCR-SSCP、PCR-DDGE和PCR-TTGE的方法操作较为复杂，而且变性凝胶制备及使用对环境有一定的影响，同时电泳检测的重复性和稳定性也欠佳，检测过程手工操作及主观判断依赖性较高，并不完全适合临床样品的检测。DNA测序法是突变检测的金标准，但该法检测周期较长，操作复杂，PCR产物进一步操作的过程中容易污染，而且测序设备昂贵，一般实验室难以配置。

实时荧光定量PCR具有较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR进行实时在线检测，反映目的基因CFTR在样品中的初始含量，不仅能够节约了大量的检测时间，还避免了遗留污染的发生。常见的实时荧光定量PCR方法有SYBR Green I染料法、双杂交探针法、Taqman探针法、MGB探针法以及分子信标法等。其中SYBR Green I由于是非饱和染料，特异性不如双杂交探针法以及Taqman探针法，而且必须通过观察溶解曲线来判断其特异性，此外不能识别特定的双链DNA序列，只要是双链DNA序列就会结合发光，因此通常本底较高，在临床上使用时可能会有假阳性产生。双杂交探针法涉及两条和模版互补、且相邻的特异性探针(距离1-5bp)，上游探针的的3'端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5'端标记Red640受体荧光基团，成本较为昂贵。分子信标法涉及一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，该探针两端的核酸序列互补配对，标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近，该方法的最大缺点在于杂交时探针不能完全地与模板结合，因此稳定性较差，此外探针合成时标记过程比较复杂。Taqman探针法涉及一条和模版互补的基因特异性探针(通常长20-30bp)，探针的5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，但是该方法中的探针序列较长使得位于探针两端的报告荧光基团和淬灭荧光基团距离较远，从而导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生不同波长的荧光，这都会使得本底偏高。

发明内容

为了克服DNA测序方法、PCR-SSCP、PCR-DDGE和PCR-TTGE以及SYBR Green I染料法、双杂交探针法、Taqman探针法和分子信标法的不足，本发明采用MGB探针法进行CFTR基因ΔF508位点突变检测，从而准确、快速地对囊性纤维化及男性不育进行辅助诊断。

本发明提供用于检测样品中CFTR基因ΔF508位点突变的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括：

(1)一对特异性的扩增产物SEQ NO1和SEQ NO2，其碱基序列为：

SEQ NO1：TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA

SEQ NO2：TGGGTAGTGTGAAGGGTTCAT

(2)一对特异性的检测探针SEQ NO3和SEQ NO4，其碱基序列为：

SEQ NO3：FAM-AGAAAATATCATCTTTGGTGTT-MGB

SEQ NO4：HEX-AGAAAATATCATCGGTGTTTCCT-MGB。

进一步地，所述扩增引物的使用浓度比为：SEQ NO1:SEQ NO2=1:1。

进一步地，所述检测探针的使用浓度比为：SEQ NO3:SEQ NO4=1:1。

进一步地，所述扩增引物和所述检测探针的使用浓度比为：

SEQ NO1:SEQ NO2:SEQ NO3:SEQ NO4=2:2:1:1。

进一步地，所述扩增引物和所述检测探针的PCR反应条件为：95℃5min预变性；95℃15sec，62℃30sec，40个循环。

进一步地，利用所述扩增引物和所述检测探针可确定样品中CFTR基因ΔF508位点突变类型：不存在缺失突变，为野生型；杂合缺失突变型；纯合缺失突变型。

本发明还提供一种检测样品中CFTR基因ΔF508位点突变类型的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品中的DNA；

(2)利用一对扩增引物SEQ NO1和SEQ NO2以及一对检测探针SEQ NO3和SEQ NO4对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增曲线；

(3)确定CFTR基因ΔF508位点突变类型：若获得两条扩增曲线，则为杂合缺失突变型；若获得一条扩增曲线，根据相对应的检测探针判断其突变类型：当对应的检测探针为SEQ NO3时，则不存在CFTR基因ΔF508位点缺失突变，为野生型，当对应的检测探针为SEQ NO 4时，则为纯合缺失突变型；若没有扩增曲线产生，则需重新检测，其中，

SEQ NO1：TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA

SEQ NO2：TGGGTAGTGTGAAGGGTTCAT

SEQ NO3：FAM-AGAAAATATCATCTTTGGTGTT-MGB

SEQ NO4：HEX-AGAAAATATCATCGGTGTTTCCT-MGB。

进一步地，步骤(2)的扩增反应条件为：95℃5min预变性；95℃15sec，62℃30sec，40个循环。

本发明还提供一种检测样品中CFTR基因ΔF508位点突变的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、红细胞裂解液、无水乙醇、qPCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述qPCR扩增反应液包括一对扩增引物SEQ NO1和SEQ NO2和一对检测探针SEQ NO3和SEQ NO4，其中，

SEQ NO1：TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA

SEQ NO2：TGGGTAGTGTGAAGGGTTCAT

SEQ NO3：FAM-AGAAAATATCATCTTTGGTGTT-MGB

SEQ NO4：HEX-AGAAAATATCATCGGTGTTTCCT-MGB。

进一步地，所述红细胞裂解液包括NH₄Cl、NaHCO₃、EDTA-Na₂和ddH₂O。

有益效果：本发明通过一对特异性扩增引物及MGB探针对目的基因进行扩增，条件依赖少，一般的PCR实验室设备即可满足，对结果的分析非常直观，不用比对复杂的测序图谱，直接根据扩增曲线即可做出分析该位点基因型。本发明所采用的荧光定量PCR法(MGB探针)检测周期短，在三个小时内即可得出结果，而且相对于DNA测序法来说检测灵敏度大大提高，使用MGB探针还能极大地降低本底信号的干扰，还可以大大稳定探针与模板的杂交,升高探针Tm值,使较短的探针同样能达到较高的Tm值，允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本，与此同时MGB探针对于等位基因的区分比较理想，可以检测单碱基突变，并且具有非常好的准确性和特异性。

此外，传统的DNA测序法如Sanger测序和焦磷酸测序，要么不能准确地区分基因型，要么虽然能够区分基因型，但是比较费时费力，检测周期长。更重要的是，传统的DNA测序法不能准确地确定样品不同基因型的初始拷贝数。而本发明不仅可以很快地鉴定CFTR基因ΔF508位点突变类型的存在与否，并快速地判定样品为纯合缺失突变型，杂合缺失突变型，还是野生型，而且还可确定不同基因型在样品中的初始拷贝数。这些检测信息将有助于临床医生更快地对囊性纤维化做出诊断和鉴别诊断，对男性不育的辅助诊断及人工生殖相关植入前诊断均有极大的帮助。

与此同时，鉴于本发明利用两条特异性的检测探针，两者含有不同的荧光基团，因此，可以进行单管检测，不用进行两管检测，这样就可节省样品DNA和检测试剂用量，从而降低检测成本，同时也降低检测过程中可能遭受的污染，提高检测准确性。

附图说明

图1是CFTR基因第10外显子标准序列。

图2是样品A的实时荧光PCR检测结果。

图3是样品B的实时荧光PCR检测结果。

图4是样品C的实时荧光PCR检测结果。

图5是样品A的Sanger测序图。

图6是样品B的Sanger测序图。

图7是样品C的Sanger测序图。

图8是1-5号样品的PCR-SSCP电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

用于检测样品中CFTR基因ΔF508位点突变的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括：

(1)一对特异性的扩增产物SEQ NO1和SEQ NO2，其碱基序列为：

SEQ NO1：TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA

SEQ NO2：TGGGTAGTGTGAAGGGTTCAT

(2)一对特异性的检测探针SEQ NO3和SEQ NO4，其碱基序列为：

SEQ NO3：FAM-AGAAAATATCATCTTTGGTGTT-MGB

SEQ NO4：HEX-AGAAAATATCATCGGTGTTTCCT-MGB

其中在SEQ NO3和SEQ NO4的3’端标记了MGB，用于增强检测特异性。

一种检测样品中CFTR基因ΔF508位点突变的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、红细胞裂解液、无水乙醇、qPCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，具体如下所示：

10×红细胞裂解液配方为：NH₄Cl82g，NaHCO₃8.4g，EDTA-Na₂3.72g，加ddH₂O定容至1000ml。

qPCR扩增反应液：THUNDERBIRD qPCR Mix12.5ul，一对扩增引物SEQ NO1和SEQNO2各0.8ul，一对检测探针SEQ NO3和SEQ NO4各0.4ul，ddH₂O8.1ul，其中，

SEQ NO1：GGGTTTTCTCATCACTCTGCG

SEQ NO2：AGTGTGTATGCAGGCATCCT

SEQ NO3：FAM-AAGAAGCCCACCCCGTAGCT-MGB

SEQ NO4：HEX-AAGAAGCCCACCCTGTAGCT-MGB。

阳性对照品：含有CFTR基因ΔF508位点突变序列的溶液。

阴性对照品：不含有CFTR基因的溶液。

空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。

实施例2：检测流程

(1)血液DNA提取：取500ul全血，放入到1.5ml的离心管中，加入1ml红细胞裂解液。上下翻转，使完全混匀，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，离心速率为5000rpm，10min。倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。加入500ul红细胞裂解液，重复此裂解步骤一次。离心5000rpm，5min，最后用移液管吸净所有上层液弃去,以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液，在沉淀里加入60ul核酸提取液（取之前反复吹打），用枪头混匀，金属浴100℃10分钟，12000rpm，5min，取上清，获取样品DNA溶液。当不立即使用时，样品DNA溶液在-20℃下保存待用。

(2)实时荧光PCR扩增：

样品DNA的qPCR扩增反应液为25ul：THUNDERBIRD qPCR Mix12.5ul，一对扩增引物SEQ NO1和SEQ NO2各0.8ul，一对检测探针SEQ NO3和SEQ NO4各0.4ul，ddH₂O8.1ul。具体配置如下表所示。

实时荧光PCR扩增反应条件：95℃5min预变性；95℃15sec，62℃30sec，40个循环，反应结束后，获取扩增曲线。

根据所获得的扩增曲线确定CFTR基因ΔF508位点突变类型：若获得两条扩增曲线，则为杂合缺失突变型，即ΔF508/F508型；若获得一条扩增曲线，根据相对应的检测探针判断其突变类型：当对应的检测探针为SEQ NO3时，则不存在CFTR基因ΔF508位点缺失突变，为野生型，即F508/F508型；当对应的检测探针为SEQ NO4时，则为纯合缺失突变型，即ΔF508/ΔF508型；若没有扩增曲线产生，则需重新检测。

实施例3：样品检测验证

选取临床样品5例，编号1-5，其中1号样品为男性不育患者，疑似有CFTR基因ΔF508突变，2-5号样品为体检样品，非不育患者。实施步骤如下：

(1)1-5号样品为外周血，按照实施例2中所述血液DNA提取方法，提取DNA。

(2)按照实施例2中所述实时荧光PCR扩增方法，对1-5号样品DNA进行实时荧光PCR(qPCR)检测，同时对这5例样品CFTR基因第10外显子进行Sanger测序分析和PCR-SSCP电泳分析，其中PCR-SSCP电泳图如图8所示。三种方法的结果如下表所示：

由表中结果可见，本发明检测结果与Sanger测序结果和PCR-SSCP法完全一致，和临床诊断结果也相符，这就证实本发明具有较高的准确性和特异性。

实施例4：样品检测验证

取临床血液样品3例，即样品A、B和C，按照实施例2中的方法提取DNA和进行实时荧光PCR检测。

CFTR基因第10外显子标准序列如图1所示，其中用方框标示的三个碱基为TTT，当这三个碱基缺失时，该基因所编码的蛋白发生ΔF508突变，即蛋白第508位的氨基酸残基苯丙氨酸(F)缺失。

对样品A而言，其实时荧光PCR检测结果如图2所示，由于只产生一条扩增曲线，且对应检测探针为SEQ NO3，因此样品A为野生型，即F508/F508型。同时样品A的Sanger测序结果如图5所示。

对样品B而言，其实时荧光PCR检测结果如图3所示，由于只产生一条扩增曲线，且对应检测探针为SEQ NO4，因此B样品为纯合缺失突变型，即ΔF508/ΔF508型。同时样品B的Sanger测序结果如图6所示。

对样品C而言，其实时荧光PCR检测结果如图4所示，由于产生两条扩增曲线，因此C样品为杂合缺失突变型，即ΔF508/F508型。同时样品C的Sanger测序结果如图7所示。将图1中的标准序列与图5、图6和图7中的序列进行比对，可知本发明采用的实时荧光PCR检测结果与Sanger测序分析结果一致。这再次验证了本发明检测结果的准确性和特异性。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州艾迪康医学检验所有限公司

<120> 检测CFTR基因ΔF508位点突变的方法和寡核苷酸

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggagccttc agagggtaaa 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgggtagtgt gaagggttca t 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agaaaatatc atctttggtg tt 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agaaaatatc atcggtgttt cct 23

Claims

1.用于检测样品中CFTR基因ΔF508位点突变的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括：

(1)一对特异性的扩增产物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其碱基序列为：

SEQ NO 1：TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA

SEQ NO 2：TGGGTAGTGTGAAGGGTTCAT

(2)一对特异性的检测探针SEQ NO 3和SEQ NO 4，其碱基序列为：

SEQ NO 3：FAM-AGAAAATATCATCTTTGGTGTT-MGB

SEQ NO 4：HEX-AGAAAATATCATCGGTGTTTCCT-MGB。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述扩增引物的使用浓度比为：

SEQ NO 1: SEQ NO 2=1:1。

3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述检测探针的使用浓度比为：

SEQ NO 1: SEQ NO 2=1:1。

4.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述扩增引物和所述检测探针的使用浓度比为：

SEQ NO 1: SEQ NO 2: SEQ NO 3 : SEQ NO 4=2:2:1:1。

5.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述扩增引物和所述检测探针的PCR反应条件为：95℃ 5min预变性；95℃ 15sec，62℃ 30sec，40个循环。

6.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，利用所述扩增引物和所述检测探针可确定样品中CFTR基因ΔF508位点突变类型：不存在缺失突变，为野生型；杂合缺失突变型；纯合缺失突变型。

7.一种检测样品中CFTR基因ΔF508位点突变类型的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品中的DNA；

(2)利用一对扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2以及一对检测探针SEQ NO 3和SEQ NO 4对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增曲线；

(3)确定CFTR基因ΔF508位点突变类型：若获得两条扩增曲线，则为杂合缺失突变型；若获得一条扩增曲线，根据相对应的检测探针判断其突变类型：当对应的检测探针为SEQ NO 3时，则不存在CFTR基因ΔF508位点缺失突变，为野生型，当对应的检测探针为SEQ NO 4时，则为纯合缺失突变型；若没有扩增曲线产生，则需重新检测，其特征在于，

SEQ NO 1：TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA

SEQ NO 2：TGGGTAGTGTGAAGGGTTCAT

SEQ NO 3：FAM-AGAAAATATCATCTTTGGTGTT-MGB

SEQ NO 4：HEX-AGAAAATATCATCGGTGTTTCCT-MGB。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)的扩增反应条件为：95℃ 5min预变性；95℃ 15sec，62℃ 30sec，40个循环。