CN115992212A - 一种ube3a突变体蛋白、ube3a基因突变体、扩增引物、检测试剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及一种UBE3A突变体蛋白、UBE3A基因突变体、扩增引物、检测试剂及应用。本发明所述UBE3A突变体蛋白包括p.N82Tfs*5的突变。本发明所述UBE3A突变体蛋白与野生型UBE3A基因编码的蛋白相比，第82位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为苏氨酸(T)，并造成移码突变，在此后5位氨基酸后终止，即含有p.N82Tfs*5的突变。本发明首次发现了UBE3A突变体蛋白可以导致天使综合征发病，通过检测受试者是否携带有上述突变体蛋白，能够用于天使综合征的遗传学诊断，以及产前诊断和优生优育，为天使综合征患者的治疗提供全新的理论依据。

Description

一种UBE3A突变体蛋白、UBE3A基因突变体、扩增引物、检测试剂及应用

技术领域

本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及一种UBE3A突变体蛋白、UBE3A基因突变体、扩增引物、检测试剂及应用。

背景技术

天使综合征(angelmansyndrome，AS)(MIM 105830)又称快乐木偶综合征，是一种遗传异常所致的神经发育障碍性疾病，属于非进展性脑病。特征性表现为智力低下、快乐行为、严重语言障碍、共济失调、睡眠障碍及癫痫发作等，发病率约为1/20000-1/12000。

天使综合征主要由基因缺陷引起，遗传学发病机制类型有：

Ⅰ型(缺失型)：母源15号染色体q11.2-13区域约5-7Mb缺失，约占68％。

Ⅱ型(UPD型)：q11.2-13区域父源单亲二倍体(uniparental disomy，UPD)所致，即患者的两条15号染色体或15号染色体q11.2-13片段均来自父亲，约占7％。

Ⅲ型(ID型)：印迹缺陷(imprintingdefects)所致，患者虽然从双亲各遗传了1条15号染色体，但母源15号染色体q11.2-13区域内的印迹中心(imprintingcenter)呈现DNA甲基化异常或基因表达缺失，通常为6-200kb微缺失，约占3％。

Ⅳ型(UBE3A突变型)：UBE3A基因突变所致，基因内大片段缺失/重复或整个基因缺失/重复突变罕见，通常表现为UBE3A基因点突变或小的插入缺失，约占11％。

另有10％的患者遗传机制不明确。

基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断和发现基因突变是确诊天使综合征的重要标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。因此，寻求诊断天使综合征的突变基因、及早明确患者诊断以及靶向干预，在目前天使综合征检测领域尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于诊断天使综合征的突变基因、扩增引物、检测试剂及应用，丰富天使综合征的致病突变谱，精准判断天使综合征，用于天使综合征的遗传学诊断以指导治疗，以及产前遗传学诊断和优生优育。

本发明提供了一种UBE3A突变体蛋白，所述UBE3A突变体蛋白包括p.N82Tfs*5的突变。

本发明还提供了编码上述技术方案所述的UBE3A突变体蛋白的UBE3A基因突变体，所述UBE3A基因突变体包括c.245delA。

本发明还提供了上述技术方案所述UBE3A突变体蛋白或UBE3A基因突变体作为检测靶点在制备a1)～a5)中任意一种或多种试剂盒中的应用：

a1)预防天使综合征试剂盒；

a2)诊断天使综合征试剂盒；

a3)孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒；

a4)孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒；

a5)辅助治疗天使综合征试剂盒。

本发明还提供了一种用于扩增上述技术方案所述UBE3A基因突变体的引物，包括上游引物UBE3A-F和下游引物UBE3A-R；

所述上游引物UBE3A-F包括如b1)～b4)中的任意一种：

b1)序列表中SEQ ID NO.1所述的单链DNA；

b2)在b1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b3)在b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述下游引物UBE3A-R包括如c1)～c4)中的任意一种：

c1)序列表中SEQ ID NO.2所述的单链DNA；

c2)在c1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c3)在c1)或c2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。

本发明还提供了上述技术方案所述引物在制备诊断天使综合征的试剂中的应用。

本发明还提供了一种诊断天使综合征的试剂，所述试剂包括上述技术方案所述的引物。

优选的，所述试剂还包括和测序引物；

所述测序引物包括上游引物UBE3A-SeqF和下游引物UBE3A-SeqR；

所述上游引物UBE3A-SeqF包括如d1)～d4)中的任意一种：

d1)序列表中SEQ ID NO.3所述的单链DNA；

d2)在d1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

d3)在d1)或d2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述下游引物UBE3A-SeqR包括如e1)～e4)中的任意一种：

e1)序列表中SEQ ID NO.4所述的单链DNA；

e2)在e1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

e3)在e1)或e2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。

优选的，所述试剂还包括dNTPs，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种。

本发明还提供了上述技术方案所述的引物或试剂在制备下述f1)～f5)中任意一种或多种试剂盒中的应用：

f1)预防天使综合征试剂盒；

f2)诊断天使综合征试剂盒；

f3)孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒；

f4)孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒；

f5)辅助治疗天使综合征试剂盒。

本发明还提供了一种诊断天使综合征的试剂盒，包括上述技术方案所述的试剂。

本发明提供了一种UBE3A突变体蛋白，包括p.N82Tfs*5的突变。本发明所述UBE3A突变体蛋白与野生型UBE3A基因编码的蛋白相比，第82位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为苏氨酸(T)，并造成移码突变，在此后5位氨基酸后终止，即含有p.N82Tfs*5的突变。本发明首次发现了UBE3A突变体蛋白可以导致天使综合征发病，家系中未患病成员检测该突变结果为阴性。本发明所述UBE3A突变体蛋白丰富了天使综合征的致病突变谱，一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，能够筛查或诊断天使综合征的致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导，为天使综合征患者的治疗提供全新的理论依据，可以为治疗天使综合征提供可能的药物靶点。

本发明通过外显子组测序技术发现了一种编码所述UBE3A突变体蛋白的UBE3A基因突变体，由UBE3A基因第245个碱基A缺失，通过检测编码所述UBE3A突变体蛋白的UBE3A基因突变体，可快速、有效地预测或诊断天使综合征。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为1号天使综合征家系遗传图谱，其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者个体，↗表示先证者；

图2为1号天使综合征家系利用Sanger测序检测UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点基因型的结果图，其中，C为家系中天使综合征患者；A和B为家系中正常个体(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图3为2号天使综合征家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者个体，◇表示正常胎儿，↗表示先证者；

图4为2号天使综合征家系利用试剂盒检测UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点基因型的结果图，其中，A、B和C为家系中正常个体。

具体实施方式

本发明提供了一种UBE3A突变体蛋白，包括p.N82Tfs*5的突变。

本发明所述p.N82Tfs*5的突变优选如SEQ ID NO.7所示，具体为：TTPALR。所述UBE3A突变体蛋白与野生型UBE3A基因编码的蛋白相比，第82位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为苏氨酸(T)，并造成移码突变，在此后5位氨基酸后终止，即含有p.N82Tfs*5的突变。本发明提供的UBE3A突变体蛋白可以将天使综合征患者和正常人群区分开，是一种诊断天使综合征的生物标志物，有助于天使综合征基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

本发明还提供了编码所述的UBE3A突变体蛋白的UBE3A基因突变体，包括c.245delA。本发明利用外显子测序筛选与天使综合征高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，通过Sanger测序进行验证，最终获得用于诊断天使综合征的突变基因。本发明所述突变基因位于UBE3A基因上，具体表现为c.245delA突变，即第245个碱基A缺失，使其含有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，具体为5’-CCCCCACAAC-3’。本发明UBE3A基因突变体导致UBE3A基因(登录号为NM_130838.4)的3号外显子第82位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为苏氨酸(T)，并造成移码突变，在此后5位氨基酸后终止，具体为UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5，本发明所述UBE3A基因突变体会导致UBE3A基因编码蛋白发生移码突变引起天使综合征，具有致病性。本发明提供的UBE3A基因突变体可以将天使综合征患者和正常人群区分开，是一种诊断天使综合征的生物标志物，有助于天使综合征基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

根据本发明上述UBE3A突变体蛋白和UBE3A基因突变体在天使综合征方面的突出作用，以下内容均属于本发明的保护范围：所述UBE3A突变体蛋白和UBE3A基因突变体作为检测靶点制备诊断天使综合征的试剂盒；所述UBE3A突变体蛋白和UBE3A基因突变体作为检测靶点制备预防天使综合征的试剂盒；所述UBE3A突变体蛋白和UBE3A基因突变体作为检测靶点制备辅助治疗天使综合征的试剂盒；所述UBE3A突变体蛋白和UBE3A基因突变体作为检测靶点制备孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒；所述UBE3A突变体蛋白和UBE3A基因突变体作为检测靶点制备孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒。

本发明还提供了用于扩增上述技术方案所述UBE3A基因突变体的引物，包括上游引物UBE3A-F和下游引物UBE3A-R。

本发明所述上游引物UBE3A-F优选包括如b1)～b4)中的任意一种：b1)序列表中SEQ ID NO.1所述的单链DNA；b2)在b1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；b3)在b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。

本发明所述下游引物UBE3A-R优选包括如c1)～c4)中的任意一种：c1)序列表中SEQ ID NO.2所述的单链DNA；c2)在c1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；c3)在c1)或c2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。

本发明所述SEQ ID NO.1～2的核苷酸序列具体如下：SEQ ID NO.1：5’-ACTGTGCTTATTGTTTGA-3’；SEQ ID NO.2：5’-CACTGTTTCCTCTTTCTG-3’。

本发明还提供了上述技术方案所述引物在制备预防和/或诊断天使综合征的试剂盒中的应用；在制备辅助治疗天使综合征的试剂盒中的应用；在制备孕前和/或产前遗传病筛查和/或诊断试剂盒中的应用。本发明所述引物能够特异性扩增UBE3A基因突变体，快速精准诊断天使综合征。

本发明还提供了一种诊断天使综合征的试剂，包括上述技术方案所述的引物；优选还包括测序引物。

在本发明中，所述测序引物优选包括上游引物UBE3A-SeqF和下游引物UBE3A-SeqR。

本发明所述上游引物UBE3A-SeqF优选包括如d1)～d4)中的任意一种：d1)序列表中SEQ ID NO.3所述的单链DNA；d2)在d1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；d3)在d1)或d2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。

本发明所述下游引物UBE3A-SeqR包括如e1)～e4)中的任意一种：e1)序列表中SEQID NO.4所述的单链DNA；e2)在e1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；e3)在e1)或e2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。

本发明所述SEQ ID NO.3～4的核苷酸序列具体如下：

SEQ ID NO.3：5’-TAACTGAGGGCTGTGGAA-3’；

SEQ ID NO.4：5’-TAACTTAAATAGATGTTGTGGC-3’。

在本发明中，所述试剂优选还包括PCR扩增反应中的其他试剂，进一步优选包括dNTPs，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种。本发明在具体实施过程中，可根据实际需要，常规选择其他试剂。

本发明还提供了上述技术方案所述试剂在制备预防和/或诊断天使综合征的试剂盒中的应用；在制备辅助治疗天使综合征的试剂盒中的应用；在制备孕前和/或产前遗传病筛查和/或诊断试剂盒中的应用。本发明所述试剂中的测序引物能够对扩增所述UBE3A基因突变体的引物组的扩增产物进行测序，从而判断UBE3A基因上是否存在c.245delA突变位点，快速精准诊断天使综合征。

本发明还提供了一种诊断天使综合征的试剂盒，包括上述技术方案所述的试剂。本发明所述试剂盒通过检测样品中所述突变位点的基因型诊断个体是否患有天使综合征，具体的，当检测样品的UB E3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5基因型是“c.245delA杂合子”，且突变点位于母源染色体上，则个体为患者；当检测样品的UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5基因型是“c.245delA杂合子”，且突变点位于父源染色体上，则个体为携带者；当检测样品无突变，则判断UBE3A基因为野生型，个体是正常人。本发明所述检测样品优选包括血液或羊水。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种UBE3A突变体蛋白、UBE3A基因突变体、扩增引物、检测试剂及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.诊断标准：

可参照《罕见病诊疗指南》2019年版：

符合天使综合征(AS)临床诊断标准共识和(或)分子遗传学检测结果表明母源UBE3A等位基因存在表达或功能缺陷时，即可给予诊断。

AS临床诊断共识标准包括均出现表现(几乎全部患者均出现的表现)、经常性表现(超过80％患者出现的表现)以及相关性表现(少于80％患者出现的表现)。均出现的表现包括发育迟滞、语言障碍、运动或平衡障碍，通常是步态障碍和(或)肢体颤动、行为独特包括频繁大笑/微笑；明显的快乐举止、易兴奋性，往往伴有手颤和运动过度行为等。经常性表现包括头围发育延迟、癫痫发作以及特征性异常脑电图(高波幅棘-慢波等)。相关性表现包括平枕/枕骨凹陷、下颌突出、宽嘴、齿缝稀疏、频繁流口水、过多的嘴部动作、肤色及发色浅淡、运动时屈曲手臂、睡眠障碍等。

2.检测对象

以一个天使综合征家系(简称1号家系)为受试对象，进行检测，该1号家系部分成员的临床信息见表1，家系图谱如图1。

表1天使综合征1号家系成员的临床信息

注：Ⅰ和Ⅱ依次表示第一代和第二代，1号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅱ1外周血DNA用于测序。

实施例2

外显子测序

1.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备

2.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)和EB染液(Amresco)。

3.试剂配方

1)5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表35×TBE电泳液配方

试剂	Tris	硼酸	EDTA(pH8.0，0.5mol/L)	<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>
					体积/重量	5.4g	750mg	2mL	补足至100mL

2)0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释表3中5×TBE电泳液贮存液10倍即可。

3)10×红细胞裂解液按照表4配制。

表410×红细胞裂解液配方

4)1×细胞核裂解液配方按照表5配制。

表51×细胞核裂解液配方

试剂	2MTris-HCl，pH8.2	4MNaCl	2mMEDTA
				体积/重量	0.5mL	10mL	0.4mL

4.实验步骤

签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1成员的外周血3～5mL作为研究样品。

4.1样本DNA提取

1)如为肝素抗凝外周血样本，则将外周血3～5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明；如为羊水则直接进行步骤2)。

2)4℃，3000rpm离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000rpm离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积的酚和氯仿混合液(酚和氯仿的体积比为1:1)，室温3000rpm离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

4.2外显子测序

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150～250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

4.3结果

最终在1个家系中得到1个具有致病意义的基因突变UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5；c.245delA突变导致所编码的UBE3A蛋白质第82位氨基酸残基由天冬酰胺变为苏氨酸，并造成后续移码突变，在后面5位氨基酸残基后终止。

在家系1患者个体中UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点的基因型是“c.245de lA杂合子”突变，根据家系人员全外显子测序数据对比分析发现突变位点位于母源染色体；在家系1正常个体中基因型是野生型。

实施例3

Sanger测序验证

对1号家系外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点进行验证。分别对实施例1中的3名1号家系人员和100名家系外正常人进行UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点基因检测。

具体方法步骤如下：

1.DNA提取

按照实施例2的方法提基因组DNA。

2.候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genom e，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。

2.2针对c.245delA位点分别设计15对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况

表6针对c.245delA位点候选引物基本情况和验证实验结果

注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果。

2.3候选引物PCR验证反应

利用表5～6的候选引物，按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃预变性5min；

第二步：30个循环(95℃变性30sec→Tm退火30sec→72℃延伸60sec)；(根据表9中各引物Tm值设置PCR扩增参数)。

第三步：72℃延伸7min；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10～15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮目的条带，无其条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择表6中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为针对UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点的扩增引物。

3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变点PCR反应体系

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃预变性5min；

第二步：30个循环(95℃变性30sec→40℃退火30sec→72℃延伸60sec)；

第三步：72℃延伸7min；第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

试剂	PCR产物纯化后DNA	3.2pmol/μL测序引物	BigDye	5×BigDye测序缓冲液	<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>
						体积	2.0μL	1.0μL	0.5μL	2.0μL	4.5μL

测序PCR循环条件：

第一步：96℃预变性1min；

第二步：33个循环(96℃变性30sec→55℃退火15sec→60℃延伸4min)；

第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15min；

3)3000g，4℃离心30min；马上倒置96孔板，185g离心1min；

4)室温放置5min，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4min，迅速置冰上4min，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，引物序列如下所示：

5’-TAACTGAGGGCTGTGGAA-3’(SEQ ID NO.3)

5’-TAACTTAAATAGATGTTGTGGC-3’(SEQ ID NO.4)。

9、结果分析

测序结果图2，根据图2可以看出，家系1中1名患者UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点基因型是“c.245delA杂合子”；家系1名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点基因型是野生型。图2中A和B层显示家系中正常个体UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点基因型是野生型，图2中C层显示天使综合征患者UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点基因型是“c.245delA杂合子”突变，结合根据实施例2的数据，该突变位于母源染色体上。

实施例4

天使综合征诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

1)扩增引物：如实施例3中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；2)缓冲液(500μL的10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，15mmol/L MgCl₂)；3)Taq酶(20U)；4)dNTPs(四种dNTP各4mM)；5)c.245delA阳性突变参考品DNA，该参考品为一段双链DNA，c.245delA阳性突变参考品具体序列如SEQ ID NO.5所示，具体的：5’-ACTGTGCTTATTGTTTGAATGTTTGGTACAGGAAGCGAGCAGCTGCAAAGCATCTAATAGAACGCTACTACCACCAGTTAACTGAGGGCTGTGGAAATGAAGCCTGCACGAATGAGTTTTGTGCTTCCTGTCCAACTTTTCTTCGTATGGATAATAATGCAGCAGCTATTAAAGCCCTCGAGCTTTATAAGATTAATGCAAAACTCTGTGATCCTCATCCCTCCAAGAAAGGAGCAAGCTCAGCTTACCTTGAGAACTCGAAAGGTGCCCCCACAACTCCTGCTCTGAGATAAAAATGAACAAGAAAGGCGCTAGAATTGATTTTAAAGGTAAGATGTTTTATTTTCAATTGAGAATTGTTGCCTGAAAACCATGTGGGAGATTTAAATGTATTAGTTTTTATTTGTTTTTTCTTCTGTGACATAAAGACATTTTGATATCGTAGAACCAATTTTTTATTGTGGTAACGGACAGGAATAATAACTACATTTTACAGGTCTAATCATTGCTAATTAGAAGCAGATCATATGCCAAAAGTTCATTTGTTAATAGATTGATTTGAACTTTTTAAAATTCTTAGGAAAAATGTATTAAGTGGTAGTGAATCTCCAAAACTAGGCCACAACATCTATTTAAGTTATAGAATAACTGGACTAAGTATCTGGCATGAGTTCTGGAACCTCAGGATGATGTGATGAAAGAAGCAGAAAGAGGAAACAGTG-3’，其中AC之间缺失碱基A；6)测序引物：如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2、使用方法：

使用于2号家系，临床信息如表10所示，家系图谱如图3。

表10 2号天使综合征家系成员的临床信息

注：Ⅰ和Ⅱ依次表示第一代和第二代。

2号家系人员Ⅰ:1(先证者父亲)和Ⅰ:2(先证者母亲)外周血DNA用于测序，Ⅱ2羊水DNA用于试剂盒检测，步骤如下：

1)基因组DNA提取：按照实施例2步骤提取样本基因组DNA。

2)先采用实施例4试剂盒中的PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述试剂盒中的测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

结果如图4所示。根据图4可以看出，家系2中胎儿UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点基因型是“野生型”；胎儿父母的UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点检测结果同此前，为野生型。图4中A、B和C层显示家系中正常个体UBE3A:NM_130838.4:exon3:c.245delA:p.N82Tfs*5位点基因型是野生型。结合病史和家系图，检测结果确认胎儿羊水DNA该位点基因型为野生型，遗传咨询建议继续妊娠并做好产检监测工作。胎儿出生后，随访结果表明新生儿没有天使综合征相关表型。

根据上述实施例可以看出，本发明UBE3A突变体蛋白或UBE3A基因突变体可以作为诊断天使综合征的靶点，为治疗天使综合征提供可能的药物靶点。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种UBE3A突变体蛋白，其特征在于，所述UBE3A突变体蛋白包括p.N82Tfs*5的突变。

2.编码权利要求1所述的UBE3A突变体蛋白的UBE3A基因突变体，其特征在于，所述UBE3A基因突变体包括c.245delA。

3.权利要求1所述UBE3A突变体蛋白或权利要求2所述的UBE3A基因突变体作为检测靶点在制备a1)～a5)中任意一种或多种试剂盒中的应用：

a1)预防天使综合征试剂盒；

a2)诊断天使综合征试剂盒；

a3)孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒；

a4)孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒；

a5)辅助治疗天使综合征试剂盒。

4.一种用于扩增权利要求2所述UBE3A基因突变体的引物，其特征在于，包括上游引物UBE3A-F和下游引物UBE3A-R；

所述上游引物UBE3A-F包括如b1)～b4)中的任意一种：

b1)序列表中SEQ ID NO.1所述的单链DNA；

b2)在b1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b3)在b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述下游引物UBE3A-R包括如c1)～c4)中的任意一种：

c1)序列表中SEQ ID NO.2所述的单链DNA；

c2)在c1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c3)在c1)或c2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。

5.权利要求4所述引物在制备诊断天使综合征的试剂中的应用。

6.一种诊断天使综合征的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求4所述的引物。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括测序引物；

所述测序引物包括上游引物UBE3A-SeqF和下游引物UBE3A-SeqR；

所述上游引物UBE3A-SeqF包括如d1)～d4)中的任意一种：

d1)序列表中SEQ ID NO.3所述的单链DNA；

d2)在d1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

d3)在d1)或d2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述下游引物UBE3A-SeqR包括如e1)～e4)中的任意一种：

e1)序列表中SEQ ID NO.4所述的单链DNA；

e2)在e1)的5’端和/或3’端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

e3)在e1)或e2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。

8.根据权利要求6或7所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括dNTPs，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种。

9.权利要求4所述的引物或权利要求6～8任一项所述的试剂在制备下述f1)～f5)中任意一种或多种试剂盒中的应用：

f1)预防天使综合征试剂盒；

f2)诊断天使综合征试剂盒；

f3)孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒；

f4)孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒；

f5)辅助治疗天使综合征试剂盒。

10.一种诊断天使综合征的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6～8任一项所述的试剂。

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