CN115772214B

CN115772214B - F8突变体蛋白、f8基因突变体、检测f8基因突变体的引物组合、试剂及应用

Info

Publication number: CN115772214B
Application number: CN202211522734.7A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 伊宁; 罗娇娇; 刘鑫林
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2042-11-30
Also published as: CN115772214A

Abstract

本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及F8突变体蛋白、F8基因突变体、检测F8基因突变体的引物组合、试剂及应用。本发明首次发现导致血友病甲的F8突变体蛋白，所述F8突变体蛋白相比野生型F8蛋白第121位氨基酸为丝氨酸，通过检测是否存在F8突变体蛋白，能够检测血友病甲。本发明提供的F8突变体蛋白可以将血友病甲患者和正常人群区分开，是一种诊断血友病甲的生物标志物，有助于血友病甲基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

Description

F8突变体蛋白、F8基因突变体、检测F8基因突变体的引物组合、试剂及应用

技术领域

本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及F8突变体蛋白、F8基因突变体、检测F8基因突变体的引物组合、试剂及应用。

背景技术

血友病(hemophilia)是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病。可分为血友病甲/A(hemophilia A，HA)(MIM 306700)和血友病乙/B(hemophilia B，HB)(MIM 306900)两种。前者为凝血因子Ⅷ(FⅧ/F8)(MIM 300841)缺乏，后者为凝血因子Ⅸ(FⅨ/F9)(MIM300746)缺乏，均由相应的凝血因子基因突变引起。

血友病的发病率没有种族或地区差异。在男性人群中，血友病甲的发病率约为1/5000，血友病乙的发病率约为1/25000。所有血友病患者中，血友病甲占80％～85％，血友病乙占15％～20％。女性血友病患者极其罕见。HA和HB的临床表现相似。主要表现为关节、肌肉和深部组织出血，也可表现为胃肠道、中枢神经系统等内部脏器出血等。若反复出血，不及时治疗可导致关节畸形和(或)假肿瘤形成，严重者可危及生命。外伤或手术后延迟性出血是本病的特点。

F8基因(MIM 300841)定位于染色体Xq28，基因全长186.9kb，包含26个外显子和25个内含子，编码2351个氨基酸，组成F8蛋白。F8蛋白是内源性凝血途径中一种重要的凝血因子，其作为凝血因子Ⅸa的辅因子，在Ca²⁺和磷脂的存在下，将因子Ⅹ转化为活化形式的Ⅹa参与凝血因子Ⅹ的激活并形成内源性凝血途径。该基因的缺陷(倒置、缺失、无义突变和错义突变等)会导致一种常见的隐性X连锁凝血障碍血友病甲的产生。

基因突变是导致血友病甲发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊血友病甲的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，发现与血友病甲相关的基因突变位点，助力血友病甲基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供F8突变体蛋白、F8基因突变体、检测F8基因突变体的引物组合、试剂及应用，丰富血友病甲的致病突变谱，精准判断血友病甲，用于血友病甲的遗传学诊断以指导治疗，以及胚胎植入前遗传学诊断和优生优育。

本发明提供了一种导致血友病甲的F8突变体蛋白，所述F8突变体蛋白相比野生型F8蛋白第121位氨基酸为丝氨酸。

本发明还提供了编码上述技术方案所述的F8突变体蛋白的F8突变基因，所述F8突变基因相比野生型F8基因第3号外显子的第361位碱基为A。

本发明还提供了一种F8基因突变体，所述F8基因突变体包括c.144-26A>C和/或c.361G>A。

本发明还提供了一种检测上述技术方案所述的F8基因突变体的引物组合，所述引物组合包括扩增引物1和/或扩增引物2；

所述扩增引物1包括上游引物F8-1F和下游引物F8-1R；所述F8-1F包括如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列；所述F8-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述扩增引物2包括上游引物F8-2F和下游引物F8-2R；所述F8-2F包括如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列；所述F8-2R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

优选的，所述引物组合还包括测序引物1和/或测序引物2；

所述测序引物1包括上游引物F8-Seq1F和下游引物F8-Seq1R；所述F8-Seq1F包括如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列；所述F8-Seq1R包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

所述测序引物2包括上游引物F8-Seq2F和下游引物F8-Seq2R；所述F8-Seq2F包括如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；所述F8-Seq2R包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种检测上述技术方案所述的F8基因突变体的试剂，所述试剂包括上述技术方案所述的引物组合。

优选的，所述试剂还包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种。

本发明还提供了上述技术方案所述的F8基因突变体作为检测靶点、所述的引物组合或试剂在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒包括预防血友病甲试剂盒、诊断血友病甲试剂盒、孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒、孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒和辅助治疗血友病甲试剂盒中的一种或多种。

本发明还提供了一种诊断血友病甲的试剂盒，包括上述技术方案所述的试剂。

优选的，所述试剂盒包括如SEQ ID NO.9所示的阳性突变参考品DNA1和如SEQ IDNO.10所示的阳性突变参考品DNA2。

本发明提供的F8突变体蛋白相比野生型F8蛋白第121位氨基酸为丝氨酸，即存在p.G121S的突变，使蛋白功能异常，导致血友病甲。

进一步的，本发明提供的F8基因突变体，包括c.144-26A>C和/或c.361G>A，其中c.144-26A>C表示野生型F8基因的第1号内含子的倒数第26位碱基A突变为C，该突变破坏了剪切信号，可造成剪切异常；c.361G>A表示野生型F8基因的第3号外显子的第361位碱基G突变为A，造成编码的蛋白与正常野生型F8基因编码的蛋白相比第121位氨基酸由甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)，蛋白功能异常。本发明所述的c.144-26A>C和/或c.361G>A的F8基因突变体，可以导致血友病甲。

本发明家系中未患病成员检测该突变蛋白和突变体的结果均为阴性。本发明所述F8突变体蛋白或F8基因突变体丰富了血友病甲的致病突变谱，一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，能够筛查或诊断血友病甲的致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导，另一方面，为血友病甲患者的治疗提供全新的理论依据，可以为治疗血友病甲提供可能的药物靶点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1显示血友病甲1号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者；

图2显示利用Sanger测序检测1号家系F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C位点基因型的结果图；其中，C和D层：1号家系中半合子突变者；B层：1号家系中基因型为杂合突变携带者；A层：1号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图3显示血友病甲2号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者；

图4显示利用Sanger测序检测2号家系F8:NM_000132.4:exon3:c.361G>A:p.G121S位点基因型的结果图，其中，D层：2号家系中半合子突变者；B和C层：2号家系中杂合子突变携带者；A：2号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图5显示血友病甲3号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者；

图6显示利用试剂盒检测3号家系F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C位点基因型的结果图；其中，C层：3号家系中半合子突变者；A层：3号家系中基因型为杂合突变携带者；B层：3号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图7显示血友病甲4号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者；

图8显示利用试剂盒检测4号家系F8:NM_000132.4:exon3:c.361G>A:p.G121S位点基因型的结果图，其中，C层：4号家系中半合子突变者；B层：4号家系中杂合子突变者；A层：4号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图9显示性别检测结果，胎儿SRY基因PCR扩增出现609bp的特异条带，胎儿为男性个体。

具体实施方式

本发明提供了一种导致血友病甲的F8突变体蛋白，所述F8突变体蛋白相比野生型F8蛋白第121位氨基酸为丝氨酸。本发明所述F8突变体蛋白包括如SEQ ID NO.13(HAVSVSY)所示的氨基酸序列。

本发明还提供了编码上述F8突变体蛋白的F8突变基因，相比野生型F8基因第3号外显子的第361位碱基为A。本发明所述F8突变基因包括如SEQ ID NO.12(5'-CTGTTAGTGTA-3')所示的核苷酸序列。本发明所述野生型F8基因的登录号为NM_000132.4。本发明所述F8突变基因导致编码的F8蛋白与野生型F8基因编码的蛋白相比第121位氨基酸由甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)，即形成含有p.G121S的F8突变蛋白，影响正常F8功能，引起血友病甲，具有致病性。

本发明还提供了一种导致血友病甲的F8基因突变体，所述F8基因突变体包括c.144-26A>C和/或c.361G>A。

在本发明中，所述c.144-26A>C表示F8基因的第1号内含子的倒数第26位碱基A突变为C，具体为F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C，产生包括SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列(5'-AAAT GCACGAC-3')；所述C.144-26A>C会破坏剪切信号，可造成剪切异常，引起血友病甲，具有致病性。

在本发明中，所述c.361G>A表示F8基因的第3号外显子的第361位碱基G突变为A，导致编码的F8蛋白与野生型F8基因编码的蛋白相比，第121位氨基酸由甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)，影响正常F8功能，引起血友病甲，具有致病性，具体为F8:NM_000132.4:exon3:c.361G>A:p.G121S。

本发明利用外显子测序筛选与血友病甲高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，通过Sanger测序进行验证，首次发现F8基因存在c.144-26A>C和/或c.361G>A时，与血友病甲相关，因此，通过检测F8基因是否存在c.144-26A>C和/或c.361G>A，能够检测血友病甲。本发明提供的F8基因突变体可以将血友病甲患者和正常人群区分开，是一种诊断血友病甲的生物标志物，有助于血友病甲基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

根据本发明上述F8基因突变体在血友病甲方面的突出作用，以下内容均属于本发明的保护范围：所述F8基因突变体作为检测靶点制备诊断或辅助诊断血友病甲的试剂盒；所述F8基因突变体作为检测靶点制备预防血友病甲的试剂盒；所述F8基因突变体作为检测靶点制备辅助治疗血友病甲的试剂盒；所述F8基因突变体作为检测靶点制备孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒；所述F8基因突变体作为检测靶点制备孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒。

本发明还提供了一种检测上述技术方案所述的F8基因突变体的引物组合，所述引物组合包括扩增引物1和/或扩增引物2；所述扩增引物1包括上游引物F8-1F和下游引物F8-1R；所述F8-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述F8-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

本发明所述SEQ ID NO.1～4的核苷酸序列具体如下：

SEQ ID NO.1：5'-ATTGGGAGTATCTGAGTGG-3'；

SEQ ID NO.2：5'-TGGAGGTAAGCAGTTGG-3'；

SEQ ID NO.3：5'-AGGTTAGGCTGATGTTGGC-3'；

SEQ ID NO.4：5'-AATGGCAGGTTCTGTTTGA-3'。

本发明所述扩增引物1能够特异性扩增野生型F8基因和含有c.144-26A>C突变位点的F8基因；所述扩增引物2能够特异性扩增野生型F8基因和含有c.361G>A突变位点的F8基因。

在本发明中，所述引物组合优选还包括测序引物1和/或测序引物2；

所述测序引物1包括上游引物F8-Seq1F和下游引物F8-Seq1R；所述F8-Seq1F包括如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；所述F8-Seq1R包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

本发明所述SEQ ID NO.5～8的核苷酸序列具体如下：

SEQ ID NO.5：5'-ACAGTGTTTCGGTTTAATGG-3'；

SEQ ID NO.6：5'-GTTTTCATTACCCATCCAG-3'；

SEQ ID NO.7：5'-CCACTGTGACCTTGACTCTAA-3'；

SEQ ID NO.8：5'-CCACTACACCCTCATTCTTG-3'。

本发明所述引物组合能够检测F8基因上是否存在c.144-26A>C和/或c.361G>A的突变位点，区分F8基因突变体和野生型F8基因，具体的，测序引物1能够对上述扩增引物1的扩增产物进行测序，判断F8基因中是否存在c.144-26A>C突变；所述测序引物2能够对上述扩增引物2的扩增产物进行测序，判断F8基因中是否存在c.361G>A突变。采用本发明的引物组合可以将血友病甲患者和正常人群区分开，快速精准诊断血友病甲。

本发明还提供了一种检测上述技术方案所述的F8基因突变体的试剂，所述试剂包括上述技术方案所述的引物组合，优选还包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种；所述PCR缓冲液优选包括KCl 50mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L和MgCl₂1.5mmol/L，所述Tris-HCl的pH值优选为8.3。

本发明还提供了上述技术方案所述的引物组合或试剂在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒优选包括预防血友病甲试剂盒、诊断或辅助诊断血友病甲试剂盒、孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒、孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒和辅助治疗血友病甲试剂盒中的一种或多种。

本发明还提供了一种诊断血友病甲的试剂盒，包括上述技术方案所述的试剂，优选还包括c.144-26A>C位点阳性突变参考品DNA1和/或c.361G>A位点阳性突变参考品DNA2组成的复合参考品；所述DNA1的单链核苷酸序列优选如SEQ ID NO.9所示；所述DNA2的单链核苷酸序列优选如SE Q ID NO.10所示。

本发明所述试剂盒通过男性个体和/或女性个体的检测样品中F8基因突变体的基因型诊断个体是否患有血友病甲；所述检测样品优选包括血液或羊水。所述基因型诊断个体是否患有血友病甲的标准具体为：

当男性个体c.144-26A>C和c.361G>A位点的基因型是“c.144-26A>C半合子突变”或“c.361G>A半合子突变”，则为患者；

当男性个体c.144-26A>C和c.361G>A位点的基因型是“c.144-26A>C半合子突变”和“c.361G>A半合子突变”，则为患者；

当男性个体的基因型是“野生型”，则个体为正常人；

当女性个体c.144-26A>C和c.361G>A位点的基因型是“c.144-26A>C杂合子突变”或“c.361G>A杂合子突变”，则为携带者；

当女性个体c.144-26A>C和c.361G>A位点的基因型是“c.144-26A>C纯合子突变”或“c.361G>A纯合子突变”，则为患者；

当女性个体c.144-26A>C和c.361G>A位点的基因型是“c.144-26A>C杂合子突变”和“c.361G>A杂合子突变”，突变位于不同的X染色体上是，则为患者；

当女性个体c.144-26A>C和c.361G>A位点的基因型是“c.144-26A>C杂合子突变”和“c.361G>A杂合子突变”，突变位于同一条X染色体上是，则为携带者；

当女性个体c.144-26A>C和c.361G>A位点的基因型是“c.144-26A>C纯合子突变”和“c.361G>A纯合子突变”，则为患者；

当女性个体的基因型是“野生型”，则个体为正常人。

本发明优选还提供了一种鉴定上述F8基因突变体的基因型的方法，包括以下步骤：

以待测样品DNA为模板，利用上述扩增引物1或扩增引物2进行PCR扩增，得到扩增产物；

利用上述测序引物1或测序引物2对扩增产物进行测序，确定F8基因突变体的基因型。

在本发明中，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括10×PCR缓冲液2μL、dNTPs 0.4μL、F8-1F或F8-2F 0.5μL、F8-1R或F8-2R 0.5μL、100ng/μL的模板1μL、Taq酶0.2μL和余量的ddH₂O。

在本发明中，当所述PCR扩增的反应体系中的引物对为F8-1F和F8-1R时，所述PCR扩增的反应进程优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃反应7min；当所述PCR扩增的反应体系中的引物对为F8-2F和F8-2R时，所述PCR扩增的反应程序优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃反应7min。

本发明优选根据F8基因c.144-26A>C和c.361G>A位点的基因型确定提供待测样本的个体与血友病甲的相关性，具体为：将测序结果和上述方案中所述的DNA1和DNA2的序列进行比较分析，若测序结果和DNA1的序列碱基相同则表示发生c.144-26A>C突变，若测序结果和DNA2的序列碱基相同则表示发生c.361G>A突变，具体的基因型诊断标准如上，在此不作赘述。

本发明在具体实施过程中，共筛查和检测77个血友病家系中251位个体，其中血友病甲患者153位，血友病乙患者98位，血友病甲患者中6个个体为F8基因c.144-26A>C突变，5个个体为F8基因c.361G>A突变，77个血友病家系中血友病家系中3个家系为F8基因c.144-26A>C突变，4个家系为F8基因c.361G>A突变。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的F8突变体蛋白、F8基因突变体、检测F8基因突变体的引物组合、试剂及应用进行详细地描述，为了说明本发明F8突变体蛋白、F8基因突变体与血友病甲的相关性，随机选择筛查和检测的4个家系进行说明，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.诊断标准：

参照《人类单基因遗传疾病》2010年版和《罕见病诊疗指南》2019年版。

2.检测对象

以2个血友病甲家系(简称1号家系和2号家系)为受试对象，进行检测，该1号家系和2号家系部分成员的临床信息见表1，家系图谱如图1和图3。

表1血友病甲1号家系和2号家系成员的临床信息

注：Ⅰ和Ⅱ依次表示第一代和第二代，1号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2和Ⅱ:1外周血DNA和Ⅱ:2羊水DNA用于测序；2号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1和Ⅱ:2外周血DNA用于测序。

实施例2

外显子测序

1.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备

2.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminator V3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)和EB染液(Amresco)。

3.试剂配方

1)5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	Tris	硼酸	EDTA(pH8.0，0.5mol/L)	ddH₂O
					体积/重量	5.4g	750mg	2mL	补足至100mL

2)0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释表3中5×TBE电泳液贮存液10倍即可。

3)10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

4)1×细胞核裂解液配方按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	2M Tris-HCl，pH8.2	4M NaCl	2mM EDTA
				体积/重量	0.5mL	10mL	0.4mL

4.实验步骤

签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1成员及2号家系中Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1和Ⅱ:2成员的外周血3～5mL和1号家系Ⅱ:2成员羊水DNA为研究样品。

4.1样本DNA提取

1)将外周血3～5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明；如为羊水则直接进行步骤2)。

2)4℃，3000rpm离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000rpm离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积的酚和氯仿混合液(酚和氯仿的体积比为1:1)混匀，室温3000rpm离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

4.2外显子测序

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150～250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3'末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

4.3结果

最终得到具有致病意义的基因突变F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C和exon3:c.361G>A:p.G121S；其中c.144-26A>C的突变为位于F8基因的第1号内含子的倒数第26位碱基A突变为C，该突变破坏了剪切序列信号，可造成剪切异常；c.144-26A>C的突变为F8基因的第3号外显子的第361位碱基G突变为A，可导致错义突变，所编码的蛋白质第121氨基酸由甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)。

在1号家系患者男性个体中F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C位点的基因型是“c.144-26A>C半合子突变”，在1号家系女性携带者个体中F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C位点的基因型是“c.144-26A>C杂合突变”，在正常个体中该位点基因型为“野生型”。

在2号家系患者男性个体中F8:NM_000132.4:exon2:c.361G>A:p.G121S位点的基因型是“c.361G>A半合子突变”，在2号家系女性携带者个体中该位点的基因型是“c.361G>A杂合突变”，在正常个体中该位点基因型为“野生型”。

实施例3

Sanger测序验证

对1号家系和2号家系外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C和exon3:c.361G>A:p.G121S位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系4名人员(先证者、先证者父亲、先证者母亲和胎儿)、2号家系4名人员(先证者、先证者父亲、先证者母亲和先证者姐姐)和100名家系外正常人进行F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C和exon3:c.361G>A:p.G121S位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1.DNA提取

按照实施例2的方法提基因组DNA。

2.候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。

2.2针对突变位点c.144-26A>C和c.361G>A设计21对候选引物(见表6-1和表6-2)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况

表6-1针对c.144-26A>C位点候选引物基本情况和验证实验结果

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表6-2针对c.361G>A位点候选引物基本情况和验证实验结果

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注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类引物。

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

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反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃预变性5min；

第二步：30个循环(95℃变性30sec→Tm退火30sec→72℃延伸60sec)；(根据表6-1和表6-2中各引物Tm值设置PCR扩增参数)。

第三步：72℃延伸7min；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10～15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮目的条带，无其条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表7验证测试后统计的结果，选择表6-1中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为针对F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C位点的扩增引物，选择表6-2中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4作为针对F8:NM_000132.4:exon3:c.361G>A:p.G121S位点的扩增引物。

3、利用步骤2.6筛出的引物对1号和2号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变点PCR反应体系

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

针对F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C位点的PCR扩增程序如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→48℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃直至取样时。

针对F8:NM_000132.4:exon3:c.361G>A:p.G121S位点的PCR扩增程序如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→54℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

试剂	PCR产物纯化后DNA	3.2pmol/μL测序引物	BigDye	5×BigDye测序缓冲液	ddH₂O
						体积	2.0μL	1.0μL	0.5μL	2.0μL	4.5μL

测序PCR循环条件：

第一步：96℃预变性1min；

第二步：33个循环(96℃变性30sec→55℃退火15sec→60℃延伸4min)；

第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15min；

3)3000g，4℃离心30min；马上倒置96孔板，185g离心1min；

4)室温放置5min，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4min，迅速置冰上4min，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，引物序列如下所示。

针对F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C位点的测序引物序列如下：

5’-ACAGTGTTTCGGTTTAATGG-3’(SEQ ID NO.5)

5’-GTTTTCATTACCCATCCAG-3’(SEQ ID NO.6)

针对F8:NM_000132.4:exon3:c.361G>A:p.G121S位点的测序引物序列如下：

5’-CCACTGTGACCTTGACTCTAA-3’(SEQ ID NO.7)

5’-CCACTACACCCTCATTCTTG-3’(SEQ ID NO.8)。

9、结果分析

针对F8:NM_000132.4:exon2:c.144-26A>C位点的测序结果如图2所示。根据图2可以看出1号家系中2名患者c.144-26A>C位点基因型是“c.144-26A>C”半合子突变；1号家系中1名携带者该位点的基因型是“c.144-26A>C”的杂合突变；100个无血缘关系的正常对照的c.144-26A>C位点基因型是“野生型”。

针对F8:NM_000132.4:exon3:c.361G>A:p.G121S位点的测序结果如图4所示。根据图4可以看出显示，2号家系中1名患者c.361G>A位点基因型是“c.361G>A”半合子突变；2号家系中2名携带者该位点的基因型是“c.361G>A”的杂合突变；1名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的c.361G>A:p.G121S位点基因型是“野生型”。

实施例4

胎儿性别鉴定及STR连锁分析

1、家系1胎儿性别鉴定(SRY基因检测)：

(1)抽提1号家系胎儿羊水gDNA，具体步骤同实施例2中的步骤4。

(2)对抽提1号家系胎儿羊水gDNA进行PCR扩增，检测SRY基因，PCR反应体积20μL，含MgCl₂1.5mM、四种dNTP各200μM、单条引物60ng、模板DNA 100ng，Taq酶1U。具体的引物序列和反应条件如表10。

表10SRY基因检测PCR扩增相关参数

(3)参照实施例3步骤2.4，对步骤(2)的扩增产物进行电泳检测。

(4)结果判断：SRY基因PCR扩增如果出现一609bp的特异条带以及内对照条带(选择DMD基因第6外显子，为202bp)则为一男性个体，如果仅出现内对照扩增条带，则为一女性个体。

上述步骤(3)检测结果如图5所示，根据图5可以看出，SRY基因PCR扩增如果出现一609bp的特异条带和内对应条带，提示胎儿为一男性个体，结合上述实施例3的检测结果，确认胎儿为男性血友病甲患者，遗传咨询建议先证者母亲终止妊娠。

实施例5

血友病甲诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

试剂盒：1)扩增引物：如实施例3中SEQ ID NO.1～4；2)PCR缓冲液(10×PCR缓冲液，由500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，15mmol/L MgCl₂和余量的水组成)；3)Taq酶(20U)；4)dNTPs(四种dNTP各4mM)；5)c.144-26A>C阳性参考品DNA1，该参考品为一段双链DNA1，c.144-26A>C突变位点阳性参考品的具体序列如SEQ ID NO.9所示，具体的：

c.361G>A阳性参考品DNA2，该参考品为一段双链DNA2，c.361G>A突变位点阳性参考品的具体序列如SEQ ID NO.10所示，具体的：

单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为点突变位点，方框空白处为缺失突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置；6)测序引物：如SEQID NO.5～8所示。

2、使用方法：

应用于3号和4号家系基因突变检测，临床信息如表11所示，3号家系图谱如图6，4号家系图谱如图8。

表11血友病甲3号与4号家系成员的临床信息

注：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ依次表示第一代、第二代和第三代。

3号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2和Ⅱ:1及4号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2和Ⅱ:1外周血DNA用于该试剂盒检测，步骤如下：

1)基因组DNA提取：按照实施例2步骤提取样本基因组DNA。

2)先采用试剂盒中的PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述试剂盒中的测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

利用试剂盒对3号家系人员检测结果如图7所示，其中箭头所指为突变发生位置。根据图7可以看出，3号家系中先证者c.144-26A>C位点基因型是“c.144-26A>C”半合子突变(C层)；先证者母亲c.144-26A>C位点基因型是“c.144-26A>C”杂合子突变(A层)；检测结果确认先证者为血友病甲患者，先证者母亲为血友病甲致病基因携带者，先证者父亲基因型为野生型(B层)，为正常个体。患者父母以后生男孩有50％的概率为血友病甲患者，建议以后如需生育二胎，至医院行胚胎植入前遗传学诊断或产前诊断。

利用试剂盒对4号家系人员检测结果如图9所示，其中箭头所指为突变发生位置。根据图9可以看出，4号家系中先证者c.361G>A位点基因型是“c.361G>A”半合子突变(C层)；先证者母亲c.361G>A位点基因型是“c.361G>A”杂合突变(B层)，先证者父亲基因型为野生型(A层)，为正常个体。检测结果确认先证者为血友病甲患者，先证者母亲为血友病甲致病基因携带者。遗传咨询意见先证者建议尽早干预治疗，且患者父母以后生男孩有50％的概率为血友病甲患者，建议以后如需生育二胎，至医院行胚胎植入前遗传学诊断或产前诊断。

根据上述实施例可以看出，本发明F8突变蛋白和F8基因突变体可以作为诊断血友病甲的生物标志物，为治疗血友病甲提供可能的药物靶点。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.用于检测F8基因突变体的试剂在制备检测血友病甲的试剂盒中的应用；所述F8基因突变体为c.144-26A>C和/或c.361G>A；

野生型F8基因的登录号为NM_000132.4。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括引物组合；

所述引物组合包括扩增c.144-26A>C的扩增引物1和/或扩增c.361G>A的扩增引物2；

所述扩增引物1包括上游引物F8-1F和下游引物F8-1R；所述F8-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述F8-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述扩增引物2包括上游引物F8-2F和下游引物F8-2R；所述F8-2F包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述F8-2R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物组合还包括c.144-26A>C的测序引物1和/或c.361G>A的测序引物2；

所述测序引物1包括上游引物F8-Seq1F和下游引物F8-Seq1R；所述F8-Seq1F包括如SEQID NO.5所示的核苷酸序列；所述F8-Seq1R包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

所述测序引物2包括上游引物F8-Seq2F和下游引物F8-Seq2R；所述F8-Seq2F包括如SEQID NO.7所示的核苷酸序列；所述F8-Seq2R包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括如SEQ ID NO.9所示的阳性突变参考品标准品DNA1和如SEQ ID NO.10所示的阳性突变参考品DNA2。