CN117535402A - Frmpd4基因突变体作为检测靶点的应用、具有其的检测试剂及检测试剂盒 - Google Patents

Frmpd4基因突变体作为检测靶点的应用、具有其的检测试剂及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种FRMPD4基因突变体作为检测靶点的应用、具有其的检测试剂及检测试剂盒；致病基因相比于野生型FRMPD4基因，在所述野生型FRMPD4基因的第16号外显子的第3397位碱基由碱基G突变为碱基T。本发明的致病基因突变可以作为诊断智力发育障碍104型的生物标志物。本发明可通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断智力发育障碍104型的遗传学诊断，以指导治疗。本发明所提供的检测试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断智力发育障碍104型。

Description

FRMPD4基因突变体作为检测靶点的应用、具有其的检测试剂 及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及检测试剂领域，尤其涉及一种FRMPD4基因突变体作为检测靶点的应用、具有其的检测试剂及检测试剂盒。
背景技术
智力残疾（ID）影响1-3%的人群，是由X染色体基因突变引起的遗传异质性X连锁ID（XLID）疾病，约每1000名男性中就有1.7人受到影响。到目前为止，已经发现和描述了120多种。了解ID的遗传原因可为人类的认知发展和功能提供有价值的见解，并为合理开发有效疗法提供药物靶点。新ID基因的鉴定由于极端的临床和遗传异质性而变得重要。
智力发育障碍104型（MIM 300983）是XLID中的一种，表现为X染色体隐性遗传，主要临床表现为智力障碍、语言发育迟缓、癫痫发作、学步晚、全面发育迟缓、粗大运动发育迟缓、孤独症行为、三角头畸形、斜视、中枢神经系统的髓鞘化延迟等。
FRMPD4基因（MIM 300838）是智力发育障碍104型的致病基因，该基因定位于染色体Xp22.2，基因全长586.1kb，包含17个外显子和16个内含子，编码1322个氨基酸FRMPD4。FRMPD4是一种神经支架蛋白，在大脑皮层和海马体中有丰富的表达。FRMPD4由N末端WW、PDZ和FERM结构域以及与肌动蛋白丝、β-PIX和PSD-95相互作用的C末端PDZ结合结构域组成。研究表明，C端PDZ结构域与PSD-95的相互作用对兴奋性突触和树突棘的形成至关重要。海马神经元中FRMPD4的过度表达可增加树突棘密度，而使用基因敲低方法降低表达可降低兴奋性神经元的棘密度。FRMPD4产生了一个微结构域，在兴奋性突触的突触后密度组装mGluR1/5、Homer1和脯氨酸定向激酶（PDK），FRMPD4与Homer的直接结合对于形成FRMPD4-Homer1-PDKs-mGluR1/5复合物是必要的，PDK介导的mGluR1/5的位点特异性磷酸化增强了Homer1与mGlu1/5的相互作用，并下调mGluR5信号传导。FRMPD4基因多种类型突变，包括错义突变、无义突变、缺失突变、剪切突变等可导致蛋白功能异常，从而导致智力发育障碍和智力低下。
基因突变是导致智力发育障碍104型发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊智力发育障碍104型的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，发现与智力发育障碍104型相关的基因突变位点，助力智力发育障碍104型基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗，具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种FRMPD4基因突变体作为检测靶点的应用、具有其的检测试剂及检测试剂盒，以解决智力发育障碍104型的筛查和诊断的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种FRMPD4基因突变体作为检测靶点在制备智力发育障碍104型检测试剂和/或制备智力发育障碍104型检测试剂盒中的应用，所述FRMPD4基因突变体相较于野生型FRMPD4基因，在所述野生型FRMPD4基因的第16号外显子的第3397位碱基由碱基G突变为碱基T。
进一步的，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括扩增引物，所述扩增引物包括上游引物FRMPD4-1F和下游引物FRMPD4-1R；所述上游引物FRMPD4-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物FRMPD4-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
进一步的，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括测序引物，所述测序引物包括上游引物FRMPD4-Seq1F和下游引物FRMPD4-Seq1R；所述上游引物FRMPD4-Seq1F包括如SEQID NO.3所示的核苷酸序列；所述下游引物FRMPD4-Seq1R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种智力发育障碍104型的检测试剂和/或检测试剂盒，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括如上所述的FRMPD4基因突变体。
本次申请提出导致智力发育障碍104型的致病基因，可以有效将智力发育障碍104型患者和正常人群区分开，因此，本发明的致病基因突变可以作为诊断智力发育障碍104型的生物标志物。本发明可通过检测受试者是否携带有上述突变，用于智力发育障碍104型的遗传学诊断、筛查和优生优育指导。本发明所提供的检测试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断智力发育障碍104型。本发明为智力发育障碍104型的发病机制研究奠定了新的基础和途径，为智力发育障碍104型患者的治疗提供全新的理论依据，并为治疗智力发育障碍104型提供可能的药物靶点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1显示智力发育障碍104型1号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者；
图2显示利用Sanger测序检测1号家系FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S位点基因型的结果图；其中，B层：1号家系中半合子突变者；C层：1号家系中基因型为杂合突变者；A和D层：1号家系中基因型为野生型（测序图中箭头所指为突变发生位置）；
图3显示智力发育障碍104型2号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者；
图4显示利用试剂盒检测2号家系FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S位点基因型的结果图；其中，A和B：2号家系中基因型为半合子突变患者；C层：2号家系中基因型为杂合突变患者；D层：2号家系中基因型为野生型（测序图中箭头所指为突变发生位置）。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
在本发明中，术语“X连锁隐性遗传”是指致病隐性突变基因在X染色体上，杂合子女性不得病，为携带者，只有当女性为纯合子时才得病，而半合子男性即可得病。即：以隐性方式遗传时，由于女性有两条X染色体，当隐性致病基因在杂合状态（XAXa）时，隐性基因控制的性状或遗传病不显示出来，这样的女性表型正常的致病基因携带者；当两条X染色体上等位基因都是隐性致病基因纯合子（XaXa）时才表现出来。在男性细胞中，只有一条X染色体，Y染色体上缺少同源节段，所以只要X染色体上有一个隐性致病基因（XaY）就发病。这样，男性的细胞中只有成对的等位基因中的一个基因，故称为半合子。
在本发明中，术语“错义突变”是指是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后，变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。
在本发明中，术语“杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。
在本发明中，术语“纯合突变”是指等位基因均出现均发生同样突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。
在本发明中，术语“半合子突变”是指基因是单价的，只在一条染色体上存在，没有相应的等位基因，这样的合子叫半合子，这个基因发生了突变，即为半合子突变。
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。
为了丰富智力发育障碍104型的致病突变谱，精准判断智力发育障碍104型，用于智力发育障碍104型的遗传学诊断以指导治疗，以及胚胎植入前遗传学诊断和优生优育，本发明提供了FRMPD4基因突变体作为检测靶点的应用、具有其的检测试剂及检测试剂盒。
需了解的是，本发明中，野生型FRMPD4基因的Genbank登录号为NM_014728.3，具体序列如SEQ ID NO.46所示。野生型FRMPD4基因编码的蛋白，其ID号为NP_055543.2，具体序列如SEQ ID NO.47所示。
本发明提供了一种FRMPD4突变体蛋白，相比野生型FRMPD4蛋白，所述FRMPD4突变体蛋白第1133位氨基酸由丙氨酸突变为丝氨酸，具体序列如SEQ ID NO.48所示。
本发明提供了一种FRMPD4基因突变体，所述FRMPD4基因突变体相较于野生型FRMPD4基因，在所述野生型FRMPD4基因的第16号外显子的第3397位碱基由碱基G突变为碱基T，具体序列如SEQ ID NO.49所示。
本发明所述FRMPD4突变基因包括如SEQ ID NO.5（5'-GAAGGACTCCTG-3'）所示的核苷酸序列(方框内字母为突变后的碱基)。本发明所述野生型FRMPD4基因的登录号为NM_014728.3。本发明所述FRMPD4突变基因导致错义突变，导致编码的蛋白与野生型FRMPD4基因编码的蛋白相比，第1133位氨基酸由丙氨酸（A）突变为丝氨酸（S），其中突变产生的核心氨基酸的序列如SEQ ID NO.6所示（KEEG/>PDGE）（方框内字母为突变后的氨基酸），影响正常FRMPD4功能，引起智力发育障碍104型，具有致病性，具体为FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S。
本发明利用外显子测序筛选与智力发育障碍104型高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，通过Sanger测序进行验证，首次发现FRMPD4基因存在c.3397G>T时，与智力发育障碍104型相关，因此，通过检测FRMPD4基因是否存在c.3397G>T，能够检测智力发育障碍104型。本发明提供的FRMPD4基因突变体可以将智力发育障碍104型患者和正常人群区分开，是一种诊断智力发育障碍104型的生物标志物，有助于智力发育障碍104型基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
本发明提供了一种如上所述的FRMPD4基因突变体作为检测靶点在制备试剂或制备试剂盒中的应用，所述试剂包括检测智力发育障碍104型的试剂；
所述试剂盒包括预防智力发育障碍104型试剂盒、诊断智力发育障碍104型试剂盒、孕前遗传病筛查试剂盒、产前遗传病筛查试剂盒、孕前遗传病诊断试剂盒、产前遗传病诊断试剂盒、辅助治疗智力发育障碍104型试剂盒中的一种或多种。
本发明提供了一种检测智力发育障碍104型的扩增引物，所述扩增引物包括上游引物FRMPD4-1F和下游引物FRMPD4-1R；所述上游引物FRMPD4-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物FRMPD4-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明所述SEQ ID NO.1~2的核苷酸序列具体如下：
SEQ ID NO.1：5'-TGGGGTCGGTGGCATACT-3'；
SEQ ID NO.2：5'- AAAGGTGGCTCCGTGGTT-3'；
本发明提供了一种检测智力发育障碍104型的测序引物，所述测序引物包括上游引物FRMPD4-Seq1F和下游引物FRMPD4-Seq1R；所述上游引物FRMPD4-Seq1F包括如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列；所述下游引物FRMPD4-Seq1R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.3：5'-AGCAAAAGGAAAAGCAAG-3'；
SEQ ID NO.4：5'-CTGAAGAGCCTTGGGAGC-3'；
本发明提供了一种检测智力发育障碍104型的引物组合，包括如上所述的扩增引物和/或如上所述的测序引物。
本发明提供了一种如上所述的引物组合在制备检测智力发育障碍104型的试剂中的应用。
本发明所述引物组合能够检测FRMPD4基因上是否存在c.3397G>T的突变位点，区分FRMPD4基因突变体和野生型FRMPD4基因，具体的，测序引物1能够对上述扩增引物1的扩增产物进行测序，判断FRMPD4基因中是否存在c.3397G>T突变。采用本发明的引物组合可以将智力发育障碍104型患者和正常人群区分开，快速精准诊断智力发育障碍104型。
进一步的，所述智力发育障碍104型的检测靶点包括FRMPD4基因突变体，所述FRMPD4基因突变体相较于野生型FRMPD4基因，在所述野生型FRMPD4基因的第16号外显子的第3397位碱基由碱基G突变为碱基T。
本发明提供了一种检测智力发育障碍104型的试剂，所述试剂包括如上所述的引物组合。
试剂还可以包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种；所述PCR缓冲液优选包括KCl 50mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L和MgCl21.5mmol/L，所述Tris-HCl的pH值优选为8.3。
本发明提供了一种如上所述的试剂在试剂盒及其制备中的应用，所述试剂盒包括预防智力发育障碍104型试剂盒、诊断智力发育障碍104型试剂盒、孕前遗传病筛查试剂盒、产前遗传病筛查试剂盒、孕前遗传病诊断试剂盒、产前遗传病诊断试剂盒、辅助治疗智力发育障碍104型试剂盒中的一种或多种。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的FRMPD4突变体蛋白、FRMPD4基因突变体、检测FRMPD4基因突变体的引物组合、试剂及应用进行详细地描述，为了说明本发明FRMPD4突变体蛋白、FRMPD4基因突变体与智力发育障碍104型的相关性，随机选择筛查和检测的2个家系进行说明，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明还提供了一种诊断智力发育障碍104型的试剂盒，包括上述技术方案所述的试剂，优选还包括c.3397G>T位点阳性突变参考品DNA；所述DNA1的单链核苷酸序列优选如SEQ ID NO.7所示。
本发明所述试剂盒通过男性个体和/或女性个体的检测样品中FRMPD4基因突变体的基因型诊断个体是否患有智力发育障碍104型；所述检测样品优选包括血液或羊水。所述基因型诊断个体是否患有智力发育障碍104型的标准具体为：
当男性个体c.3397G>T的基因型是“c.3397G>T半合子突变”，则为患者；
当女性个体c.3397G>T的基因型是“c.3397G>T杂合子突变”，则为携带者；
当女性个体c.3397G>T的基因型是“c.3397G>T纯合子突变”，则为患者；
当个体的基因型是“野生型”，则个体为正常人。
本发明优选还提供了一种鉴定上述FRMPD4基因突变体的基因型的方法，包括以下步骤：
以待测样品DNA为模板，利用上述扩增引物1进行PCR扩增，得到扩增产物；
利用上述测序引物1对扩增产物进行测序，确定FRMPD4基因突变体的基因型。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括10×PCR缓冲液2μL、dNTPs 0.4μL、FRMPD4-1F或FRMPD4-2F 0.5μL、FRMPD4-1R或FRMPD4-2R 0.5μL、100ng/μL的模板1μL、Taq酶0.2μL和余量的ddH2O。
在本发明中，当所述PCR扩增的反应体系中的引物对为FRMPD4-1F和FRMPD4-1R时，所述PCR扩增的反应进程优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃反应7min。
本发明优选可以根据FRMPD4基因c.3397G>T的基因型确定提供待测样本的个体与智力发育障碍104型的相关性，具体为：将测序结果和上述方案中所述的阳性参考品DNA，若和阳性参考品DNA的序列碱基相同则表示发生c.3397G>T突变，具体的基因型诊断标准如上，在此不作赘述。
本发明在具体实施过程中，共筛查和检测56个智力障碍家系中257位个体，其中智力发育障碍104型患者19位，携带者22位，发现18个智力发育障碍104型家系中个体为FRMPD4基因c.3397G>T突变。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的FRMPD4突变体蛋白、FRMPD4基因突变体、检测FRMPD4基因突变体的引物组合、试剂及应用进行详细地描述，为了说明本发明FRMPD4突变体蛋白、FRMPD4基因突变体与智力发育障碍104型的相关性，随机选择筛查和检测的2个家系进行说明，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.诊断标准：
参照《人类单基因遗传疾病》2010年版和《罕见病诊疗指南》2019年版。
FRMPD4基因突变与智力发育障碍104型相关，该病为X连锁隐性遗传。主要临床表现为智力障碍、语言发育迟缓、癫痫发作、学步晚、全面发育迟缓、粗大运动发育迟缓、孤独症行为、三角头畸形、斜视、中枢神经系统的髓鞘化延迟等。
遗传咨询与产前诊断：作为X染色体连锁的隐性遗传病，通过基因检测确定致病基因，不仅可以判断患者产生抑制物的风险，指导治疗；还可以鉴别患者家系中的携带者，为产前诊断提供依据。女性携带者将致病突变位点传递给其男性后代的概率为50％，不除外发生一些新生突变。当先证者致病突变已知时，可对男性胎儿行产前诊断，可行羊毛膜、羊水细胞DNA测序、脐带血检测等。产前诊断以羊膜穿刺术和绒毛膜取样等技术为主要手段，对羊水、羊水细胞及绒毛膜进行遗传学分析，以判断胎儿的染色体或基因等是否正常。不同怀孕阶段采用不同的取样方法，一般孕早期取绒毛（孕7～9周），孕中期经羊膜腔穿刺取羊水（孕16～20周）、经胎儿镜取胎儿标本（孕18～20周）、直接经腹壁取脐静脉血（孕18周）等。
2.检测对象
以1个智力发育障碍104型家系（简称1号家系）为受试对象，进行检测，该1号家系部分成员的临床信息见表1，家系图谱如图1。
表1 智力发育障碍104型1号家系成员的临床信息
注：Ⅰ、Ⅱ依次表示第一代、第二代，1号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1外周血DNA和家系成员Ⅱ:2羊水DNA用于测序。
实施例2
外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2 仪器设备
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒（Agilent）、DNA 1000试剂盒（Agilent）、96孔板（Axygen）、不同型号枪头（Axygen）、200μL离心管（Eppendorf）、1.5mL离心管（Eppendorf）、毛细管电泳缓冲液（Thermo）、测序标准物（Thermo）、无水乙醇 （Thermo）、BigDyeTerminator V3.1（Thermo）、外周血gDNA提取试剂盒（TIANGEN）、琼脂糖（TIANGEN）和EB染液（Amresco）。
3.试剂配方
1）5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
2）0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释表3中5×TBE电泳液贮存液10倍即可。
3）10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
4）1×细胞核裂解液配方按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1成员的外周血3~5mL和Ⅱ:2成员羊水10-20mL为研究样品。
4.1样本DNA提取
1）将样本3~5mL装入15mL离心管中，加2~3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明；如为绒毛组织则直接进行步骤2）。
2）4℃，3000rpm离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20% SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3）加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000rpm离心10分钟。
4）小心移上清至另一离心管，加等体积的酚和氯仿混合液（酚和氯仿的体积比为1:1）混匀，室温3000rpm离心10分钟。
5）小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6）将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7）TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
1）取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150~250bp片段；
2）DNA片段做末端修复和3'末端加A；
3）连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；
4）Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
5）NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到具有致病意义的基因突变FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S；其中c.3397G>T的突变为FRMPD4基因的第16号外显子的第3397位碱基G突变为T，可导致错义突变。
在1号家系患者男性个体中FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S位点的基因型是“c.3397G>T半合子突变”，在1号家系1位女性携带者个体中该位点的基因型是“c.3397G>T杂合突变”，在正常个体中该位点基因型为“野生型”。
实施例3
Sanger测序验证
对1号家系外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系4名人员（先证者、先证者父亲、先证者母亲、胎儿）和100名家系外正常人进行FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1.DNA提取
按照实施例2的方法提基因组DNA。
2.候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redirect=manual&source=genome.ucsc.edu）。
2.2针对突变位点c.3397G>T设计20对候选引物（见表6），并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况
表6 针对c.3397G>T位点候选引物基本情况和验证实验结果
/>
/>
注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类引物。
2.3候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管（表7中序号1至8）。
表7 引物检测PCR反应体系
反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃预变性5min；
第二步：30个循环（95℃变性30sec→Tm退火30sec→72℃延伸60sec）；（根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数）。
第三步：72℃延伸7min；
第四步：4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1）用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2）称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上（加石棉网）加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3）待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4）凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5）加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1~2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6）盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7）切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10~15分钟。
8）将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价：
1）如果7号管仅出现一条明亮目的条带，无其条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；
2）如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3）如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4）如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5）如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表7验证测试后统计的结果，选择表6中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为针对FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S位点的扩增引物。
FRMPD4-1F：5’-TGGGGTCGGTGGCATACT-3’（SEQ ID NO.1）
FRMPD4-1R：5’-AAAGGTGGCTCCGTGGTT-3’（SEQ ID NO.2）
3、利用步骤2.6筛出的引物对1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8 突变点PCR反应体系
反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：
针对FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S位点的PCR扩增程序如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环（95℃，30秒→58℃，30秒→72℃，60秒）；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I（Exo I），1μL碱性磷酸酶（AIP），37℃消化15min，85℃使酶失活15min。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9 BigDye反应体系
测序PCR循环条件：
第一步：96℃预变性1min；
第二步：33个循环（96℃变性30sec→55℃退火15sec→60℃延伸4min）；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1）每管加入1μL 125mM EDTA（pH8.0），加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc（pH5.2）；
2）加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15min；
3）3000g，4℃离心30min；马上倒置96孔板，185g离心1min；
4）室温放置5min，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4min，迅速置冰上4min，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的基础上设计巢式引物（第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的）作为测序引物，引物序列如下所示。
针对FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S位点的测序引物序列如下：
FRMPD4-Seq1F：5’-AGCAAAAGGAAAAGCAAG -3’（SEQ ID NO.3）
FRMPD4-Seq1R：5’-CTGAAGAGCCTTGGGAGC-3’（SEQ ID NO.4）
9、结果分析
针对FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S位点的测序结果如图2所示。根据图2可以看出1号家系中1名男性患者c.3397G>T位点基因型是“c.3397G>T”半合子突变；1号家系中1名女性患者者该位点的基因型是“c.3397G>T”的杂合突变；1号家系中2名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的c.3397G>T位点基因型是“野生型”。
实施例4
智力发育障碍104型诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
试剂盒：1）扩增引物：如实施例3中SEQ ID NO.1~2；2）PCR缓冲液（10×PCR缓冲液，由500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl（pH8.3），15mmol/L MgCl2和余量的水组成）；3）Taq酶（20U）；4）dNTPs（四种dNTP各4mM）；5）c.3397G>T阳性参考品DNA，该参考品为一段双链DNA，c.3397G>T突变位点阳性参考品的具体序列如SEQ ID NO.7所示，具体的：5'-TGGGGTC GGTGGCATACTCCTGCACT AGCAAAAGGAAAAGCAAG CTGGCCGATGGTGAGGGGAAGGCACCCCCTAATGGGAACACAACAGGAAAAAAACAGCAGGGGACCAAAACGGCAGAGATGGAGGAGGAGGCCAGTGGTAAATTTGGTACTGTGTCTTCACGAGACAGTCAACACCTGAGCACTTTTAATCTGGAGAGAACTGCCTTTCGCAAGGACAGTCAAAGATGGTATGTGGCCACTGAAGGTGGGATGGCTGAAAAAAGTGGATTAGAAGCAGCAACAGGGAAAACCTTTCCAAGAGCTTCTGGTCTTGGGGCAAGGGAGGCCGAAGGGAAGGAAGAAGGACTCCTGATGGAGAAACCAGTGATGGCTCAGGACTTGGTCAAGGGGACCGCTTCTTAACTGACGTGACCTGTGCATCTTCAGCCAAAGACTTAGATAACCCAGAGGACGCTGACTCGTCCACCTGCGACCATCCTTCCAAGCTTCCTGAGGCTGATGAGAGTGTGGCCCGCCTTTGTGACTACCACTTGGCCAAGCGGATGTCATCACTGCAAAGCGAGGGCCATTTTTCTCTGCAGA GCTCCCAAGGCTCTTCAG TGGATGCAGGCTGTGGCACAGGCAGCAGTGGCAGTGCCTGTGCCACACCCGTGGAGTCGCCGCTCTGCCCCTCCCTGGGGAAGCACTTGATTCCTGACGCTTCTGGGAAAGGCGTGAATTACATTCCTTCAGAGGAGAGAGCCCCTGGGCTTCCCAACCAC GGAGCCACCTTT-3'；单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为点突变位点，单下划线斜体加粗处碱基为上下游测序引物位置；6）测序引物：如SEQ ID NO.3~4所示。
2、使用方法：
进一步筛查和检测了57个智力障碍/语言发育迟缓/癫痫/孤独症家系中261位个体，其中智力发育障碍104型患者19位，携带者20位，并再次发现如下契合本发明的家系18个，现以2号家系为实施例阐述该基因突变检测试剂盒的应用。2号家系临床信息如表11所示，2号家系图谱如图3。
表10 智力发育障碍104型筛查情况一览表
/>
：经羊水穿刺和产前诊断，第二胎诊断为正常个体；婴儿出生后随访结果同此。
#：19号家系携带者（女方）同16号家系家系携带者（女方）为表姐妹关系。
&：为新发变异，非遗传自其父母。
表11 智力发育障碍104型2号家系成员的临床信息
注：Ⅰ、Ⅱ依次表示第一代、第二代。
2号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1、Ⅱ:2外周血DNA用于该试剂盒检测，步骤如下：
1）基因组DNA提取：按照实施例2步骤提取样本基因组DNA。
2）先采用试剂盒中的PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；
3）对PCR扩增产物进行纯化；
4）采用上述试剂盒中的测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；
5）对BiyDye反应产物纯化；
6）对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
利用试剂盒对2号家系人员检测结果如图4所示，其中箭头所指为突变发生位置。根据图4可以看出，2号家系中先证者及其哥哥c.3397G>T位点基因型是“c.3397G>T”半合子突变（A和B层），先证者母亲为杂合突变（C层）；检测结果确认先证者及其哥哥为智力发育障碍104型患者，先证者母亲基因型为杂合型，为携带者；先证者父亲基因型（D层）为野生型，为正常个体。现先证者父母以后生育男孩为智力发育障碍104型患者的概率为25%，生育女孩为携带者的概率为25%，生育正常个体的概率为50%，建议以后如需继续生育，须至医院行胚胎植入前遗传学诊断或产前诊断。
实施例5
基因突变评级与解读（突变的致病性）
突变解读基于我们目前对智力发育障碍104型与致病基因FRMPD4的了解认识(https://www.omim.org/entry/300983)，以及检测结果对受检者进行临床表型关联。突变遵从突变命名的HGVS指南（http://www.hgvs.org/），并根据 GenBank登记号命名(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。基因变异数据解读规则参考美国医学遗传学和基因组学学院（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相关指南：Richards，S，et al.，Standards and guidelines for the interpretation ofsequence variants:a joint consensus recommendation of the American College ofMedical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology。Genet Med，advance online publication 5 March 2015。doi:10.1038/gim.2015.30；以及中国《遗传变异分类标准与指南》：王秋菊，沈亦平，邬玲仟，等。遗传变异分类标准与指南。中国科学：生命科学，2017，47：668–688。
《遗传变异分类标准与指南》中遗传变异分类是基于典型的数据类型(如人群数据、计算数据、功能数据、共分离数据)对变异进行五级分类，分别为：“致病的（pathogenic，P）”、“可能致病的（likely pathogenic，LP）”、“意义不明确的（variant of uncertainsignificance，VUS）”、“可能良性的（likely benign，LB）”和“良性的（benign，B）”；五级分类的判定是基于对变异的各个侧面/子项目进行解读分析后的综合评分（表12）。
表12 变异致病性判定准则
五级评定之前，需要对突变/变异的各侧面/子项进行分析/解读。其中，致病变异标准可分为：非常强(very strong，PVS1)、强(strong，PS1~4)、中等(moderate，PM1~6)、或辅助证据(supporting，PP1~5；良性变异证据可分为：独立(stand-alone，BA1)、强(strong，BS1~4)、或辅助证据(BP1~6) (见下表13)。对于一个给定的突变/变异，首先需要基于观察到的证据来选择表13中的标准，判断突变/变异各侧面/子项能满足表13中的哪几条，每条分别被评为PVS1/PS1~4/PM1~6/PP1~5/BA1/BS1~4/BP1~6中的哪个，最后再根据表12的评分规则把可满足的各条子项标准组合起来，再根据表12的组合标准从五级系统中选择一个分类；例如，如果该突变的各侧面/子项经分析后具备PVS1、PM1、PM2三条，则该突变综合评级为“致病”[即满足表12中“致病（P）”中 (i)+(b)的准则 ]。
表13 变异判读标准及变异致病性判定准则
/>
突变/变异各侧面/子项的分析/解读需要基于相应的生物信息分析工具（见表15）和众多可用的数据（库）（见表16），包括现有案例获得的数据，以及已有公布的数据，比如公共数据库(如ClinVar或位点特异数据库)和实验室自有数据库获得。采用各种数据（库）对突变/变异进行分析时，采用的程度判断评价标准如表14所示。
表14 程度判断评价标准
/>
表15 生物信息分析工具
/>
表16 人群数据库、疾病特异性数据库和序列数据库
/>
根据上述标准或准则，本发明中FRMPD4基因c.3397G>T突变评定为“致病”，判断标准及具体证据如下表17：
表17 FRMPD4基因c.3397G>T突变致病性解读
XLR：指X染色体隐性遗传。
FRMPD4:NM_014728.3:exon16:c.3397G>T:p.A1133S变异评级证据如下：
1、PS2：经先证者父母等家系人员检测，该变异在2个家系分析验证为新发变异（见表10），即该变异为亲缘关系确认的新发变异；
2、PS4：结合文献和本病例，在多名患者中检测到该变异（见表10）；
3、PM1：该突变位于热点突变区域，位于FRMPD4蛋白的关键功能域（特定的Disordered regions）；
4、PM2：FRMPD4基因c.3397G>T变异在参考人群千人基因组(1000G)、人类外显子数据库（ExAC）和人群基因组突变频率数据库(gnomAD)中没有发现；
5、PP3：多种计算机软件预测该变异会对基因或基因产物造成有害的影响；
因此，该突变/变异的综合性证据（PS2+PS4+PM1+PM2+PP3）符合表12中“致病（P）”评判标准(ii)，在此综合判定FRMPD4基因c.3397G>T变异为“致病”。
实施例6
随访及诊断试剂盒检测性能分析
对所有家系人员进行了随访，并对所有个体的FRMPD4基因靶向捕获芯片法进行重测序分析验证（见表18）。
表18 c.3397G>T位点检测的性能分析结果
注：本表包含家系1的随访数据；患者和携带者中检测到的变异均例为阳性。
根据表1以及表10可以看出，在对19个家系进行检测时发现阳性患者（20例）和携带者（21例）。上述阳性位点检测结果均通过FRMPD4基因靶向捕获芯片法验证。根据随访和验证结果，本次共发现41例真阳性病例、33例真阴性病例、0例假阴性和0例假阳性病例。c.3397G>T变异位点标记物进行检测的灵敏度为100.00%，其95%CI为99.03%~100%，特异度为100%，其95%CI为99.03%~100%。以上结果说明，本试剂盒在临床应用时具有良好的检测性能。
根据上述实施例可以看出，本发明FRMPD4突变蛋白和FRMPD4基因突变体可以作为诊断智力发育障碍104型的生物标志物，为治疗智力发育障碍104型提供可能的药物靶点。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (4)

1.一种FRMPD4基因突变体作为检测靶点在制备智力发育障碍104型检测试剂和/或制备智力发育障碍104型检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述FRMPD4基因突变体相较于野生型FRMPD4基因，在所述野生型FRMPD4基因的第16号外显子的第3397位碱基由碱基G突变为碱基T。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括扩增引物，所述扩增引物包括上游引物FRMPD4-1F和下游引物FRMPD4-1R；所述上游引物FRMPD4-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物FRMPD4-1R包括如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括测序引物，所述测序引物包括上游引物FRMPD4-Seq1F和下游引物FRMPD4-Seq1R；所述上游引物FRMPD4-Seq1F包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述下游引物FRMPD4-Seq1R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
4.一种智力发育障碍104型的检测试剂和/或检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括如权利要求1所述的FRMPD4基因突变体。
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