CN117805388A - 检测莱顿第五因子缺乏症的引物、基因突变体、突变体蛋白、试剂及应用 - Google Patents

检测莱顿第五因子缺乏症的引物、基因突变体、突变体蛋白、试剂及应用 Download PDF

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CN117805388A CN202311665375.5A CN202311665375A CN117805388A CN 117805388 A CN117805388 A CN 117805388A CN 202311665375 A CN202311665375 A CN 202311665375A CN 117805388 A CN117805388 A CN 117805388A
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范园
何亮波
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Abstract

本发明提供了一种检测莱顿第五因子缺乏症的引物、基因突变体、突变体蛋白、试剂及应用；其中，所述F5基因突变体相较于野生型F5基因，所述野生型F5基因的第13号外显子的第2393位碱基C缺失。本发明提供的基因突变体能够用于筛查或诊断莱顿第五因子缺乏症的致病基因突变携带者或患者，以提供产前诊断、优生优育和治疗干预指导，为莱顿第五因子缺乏症患者的治疗提供全新的理论依据。

Description

检测莱顿第五因子缺乏症的引物、基因突变体、突变体蛋白、 试剂及应用
技术领域
本发明涉及医学诊断技术领域，尤其涉及一种检测莱顿第五因子缺乏症的引物、基因突变体、突变体蛋白、试剂及应用。
背景技术
莱顿第五因子(Factor V Leiden)突变比率很高，因为莱顿第五因子异常，无法阻断凝血功能，使凝血异常而形成栓塞。即莱顿第五因子缺乏症，又称为遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症(Factor V deficiency，MIM 227400)。本病系常染色体隐性遗传，发病率约1/100万。少数患者父母为近亲婚配。部分患者可合并其他先天性异常，如输尿管畸形、动脉导管未闭等。临床上，该缺陷症约25％的患者有出血表现，主要有皮肤瘀斑、鼻出血和月经过多、产后出血等，发生在胃肠道及中枢神经系统可危及生命的出血比较罕见。该缺陷症患者的出血严重性与Ⅴ凝血因子促酶活性水平没有一致性，杂合子型凝血因子Ⅴ缺陷症病例往往无明显的临床出血症状，多数纯合子型病例的临床出血症状较轻；部分患者有静脉血栓形成事件。
其中F5基因(MIM 612309)基因突变会导致常染色体隐性遗传疾病莱顿第五因子缺乏症(MIM 227400)；F5基因定位于染色体1q24.2，包括25个外显子和24个内含子，基因长74.5kb，开放读码框6675bp，编码2225个氨基酸序列的蛋白F5(凝血因子Ⅴ)。
凝血因子Ⅴ由肝脏合成，半衰期为12～36小时。在生理条件下，它具有促凝、抗凝双重作用。在凝血过程中，其活化形式与钙离子、磷脂和凝血酶原复合物是凝血酶原最主要的激活物，是凝血过程中十分重要的辅因子。另外，C反应蛋白(蛋白C)可将凝血因子Ⅴ水解为具有抗凝活性而缺乏促凝活性的分子，后者可作为蛋白C的辅因子，在蛋白S的协同作用下，灭活Ⅷ凝血因子促酶活性等凝血因子，参与抗凝。因此，凝血因子Ⅴ基因缺陷可能导致出血或血栓，形成两种完全相反的表现类型。
因此，基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊莱顿第五因子缺乏症的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。现有技术中对基因突变位点的基因型进行检测，可以采用其他方法限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等等，但这些检测方法均不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的目的，所以需要针对特异突变位点的特异性扩增引物。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种检测莱顿第五因子缺乏症的引物、基因突变体、突变体蛋白、试剂及应用，以解决莱顿第五因子缺乏症的筛查和诊断的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种F5基因突变体，F5基因突变体相较于野生型F5基因，所述野生型F5基因的第13号外显子的第2393位碱基C缺失。
本发明还提供了一种F5突变体蛋白，F5突变体蛋白相较于野生型F5基因编码的蛋白，第798位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。
本发明还提供了一种上述的F5基因突变体或上述的F5突变体蛋白作为检测靶点在制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂和/或制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测莱顿第五因子缺乏症的扩增引物，扩增引物包括上游引物F5-1F和下游引物F5-1R；上游引物F5-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物F5-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种检测莱顿第五因子缺乏症的测序引物，测序引物包括上游引物F5-Seq1F和下游引物F5-Seq1R；上游引物F5-Seq1F包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；下游引物F5-Seq1R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种检测莱顿第五因子缺乏症的引物组合，包括上述的扩增引物和/或上述的测序引物。
本发明还提供了一种如上述的引物组合在制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂中的应用。
根据本申请的实施方式，莱顿第五因子缺乏症的检测靶点包括F5基因突变体；F5基因突变体相较于野生型F5基因，所述野生型F5基因的第13号外显子的第2393位碱基C缺失。
本发明还提供了一种莱顿第五因子缺乏症检测试剂，莱顿第五因子缺乏症检测试剂包括上述的引物组合。
本发明还提供了一种上述的莱顿第五因子缺乏症检测试剂在莱顿第五因子缺乏症检测试剂盒及其制备中的应用。
本发明的有益效果至少包括：
本发明提供了一种F5基因突变体，其相较于野生型F5基因，所述野生型F5基因的第13号外显子的第2393位碱基C缺失。并且，本发明发现该F5基因突变体可以导致莱顿第五因子缺乏症。
本发明提供的F5基因突变体丰富了莱顿第五因子缺乏症的致病突变谱，通过检测受试者是否携带有上述F5基因突变体，能够筛查或诊断莱顿第五因子缺乏症的致病基因突变携带者或患者，用于莱顿第五因子缺乏症的遗传学诊断，以提供产前诊断、优生优育和治疗干预指导，为莱顿第五因子缺乏症患者的治疗提供全新的理论依据，为治疗莱顿第五因子缺乏症提供可能的药物靶点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为莱顿第五因子缺乏症1号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，□表示正常男性个体，■表示男性患者，↗表示先证者。
图2为利用Sanger测序检测F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点基因型的结果图，其中1号家系先证者为“c.2393delC”纯合突变，先证者父亲、先证者母亲为“c.2393delC”杂合突变携带者(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
图3为莱顿第五因子缺乏症2号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者，/>表示死亡女性患者，◇表示胎儿。
图4为利用试剂盒检测2号家系F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点基因型的结果图，其中2号家系先证者为“c.2393delC”纯合突变，先证者父亲、母亲为“c.2393delC”杂合突变，胎儿为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
在本发明中，术语“常染色体隐性遗传”是指父母双方常染色体上都有致病基因时，一个致病基因不会导致疾病，但若父母将致病基因都传给孩子，孩子就可能生病，与性别无关。
文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。
在本发明中，术语“杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。
在本发明中，术语“纯合突变”是指等位基因均出现均发生突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。
在本发明中，术语“缺失突变”是指编码某种氨基酸的密码子经碱基缺失以后，变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。
在本发明中，术语“移码突变”是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。
文中术语“产前诊断”是指在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。
术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增CREBBP基因是指，在PCR反应中引物只扩增CREBBP基因，而不扩增其他基因。
本发明提供了一种F5基因突变体，，F5基因突变体相较于野生型F5基因，所述野生型F5基因的第13号外显子的第2393位碱基C缺失。
本发明首先利用外显子测序筛选与莱顿第五因子缺乏症高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，之后通过Sanger测序进行验证，最终获得莱顿第五因子缺乏症的致病基因突变，F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13。本发明筛选的致病基因突变中可以将莱顿第五因子缺乏症患者和正常人群区分开，因此，本发明的致病基因突变可以作为诊断莱顿第五因子缺乏症的生物标志物。本发明所述F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13突变位点指两个等位F5基因的第13号外显子的第2393位碱基C缺失，形成F5基因突变体，所述F5基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5(aaagccc□tt ctcac，方框处为缺失碱基位置)所示。
本发明提供了一种F5基因突变体，其相较于野生型F5基因，所述野生型F5基因的第13号外显子的第2393位碱基C缺失。并且，本发明发现该F5基因突变体可以导致莱顿第五因子缺乏症。
相应地，本发明还提供了一种F5突变体蛋白，F5突变体蛋白相较于野生型F5基因编码的蛋白，第798位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。
本发明所述F5突变体蛋白与野生型F5基因编码的蛋白相比，第798位氨基酸由脯氨酸(P)突变为亮氨酸(L)，即所述F5突变体蛋白含有p.P798Lfs*13的突变，所述突变是由于c.2393delC的移码突变引起的；所述F5突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6(KALLTNKPPQLVPH*)所示(星号为终止密码子位置)。
本发明还提供了一种上述的F5基因突变体或上述的F5突变体蛋白作为检测靶点在制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂和/或制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂盒中的应用。
如，所述F5基因突变体作为检测靶点制备检测莱顿第五因子缺乏症的试剂；所述F5基因突变体作为检测靶点制备诊断莱顿第五因子缺乏症的试剂盒；所述F5基因突变体作为检测靶点制备预防莱顿第五因子缺乏症的试剂盒；所述F5基因突变体作为检测靶点制备辅助治疗莱顿第五因子缺乏症的试剂盒；所述F5基因突变体作为检测靶点制备孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒；所述F5基因突变体作为检测靶点制备孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒。
本发明还提供了一种检测莱顿第五因子缺乏症的扩增引物，扩增引物包括上游引物F5-1F和下游引物F5-1R；上游引物F5-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物F5-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明所述SEQ ID NO.1～2的核苷酸序列具体如下：
SEQ ID NO.1：5’-CTTATTTGTGGGGATAGAGC-3’。
SEQ ID NO.2：5’-TGTGCTTTGCTGCTTGA-3’。
本发明还提供了一种检测莱顿第五因子缺乏症的测序引物，测序引物包括上游引物F5-Seq1F和下游引物F5-Seq1R；上游引物F5-Seq1F包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；下游引物F5-Seq1R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明所述SEQ ID NO.3～4的核苷酸序列具体如下：
SEQ ID NO.3：5’-TCTAATCTCCACTAAGCAACA-3’。
SEQ ID NO.4：5’-GGCTGGAATGCTCTGCT-3’。
本发明还提供了一种检测莱顿第五因子缺乏症的引物组合，包括上述的扩增引物和/或上述的测序引物。
本发明所述测序引物对上述扩增引物的扩增产物进行测序，区分F5基因突变体和野生型F5基因；本发明利用所述测序引物对所述扩增引物扩增的片段进行测序，能够快速精准诊断莱顿第五因子缺乏症。
本发明还提供了一种如上述的引物组合在制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂中的应用。
本发明提供了一种基因F5突变位点在制备防治莱顿第五因子缺乏症诊断试剂或制备防治莱顿第五因子缺乏症的药物中的应用，所述基因F5突变位点为F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13。本发明通过外显子组测序技术首次发现了F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点突变导致莱顿第五因子缺乏症发病。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断莱顿第五因子缺乏症致病基因突变患者，以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面，本发明为莱顿第五因子缺乏症的发病机制研究奠定了重要基础，为莱顿第五因子缺乏症患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗莱顿第五因子缺乏症提供可能的药物靶点。
根据本申请的实施方式，莱顿第五因子缺乏症的检测靶点包括F5基因突变体；F5基因突变体相较于野生型F5基因，在野生型F5基因的第34号外显子中的第1451位碱基T突变为G。
在本发明中，所述检测导致莱顿第五因子缺乏症的致病基因F5突变位点的方法，优选包括以下步骤：
提取待测样本的基因组DNA。
以所述基因组DNA为模板，用所述试剂扩增F5基因序列。
对扩增的F5基因序列进行DNA测序。
将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，结果完全一致时说明待检样本中F5基因未发生突变为野生型；若比对结果出现两个等位F5基因(NM_000130.5)的第13号外显子中2393位碱基C缺失，则判断该基因型为“c.2393delC纯合突变”。
在本发明中，扩增F5基因序列的反应体系优选为10×PCR缓冲液2.0μL、10mmol/LdNTPs 0.4μL、100ng/μL F5-1F 0.5μL、100ng/μL F5-1R 0.5μL、100ng/μL抽提DNA 1.0μL、5U/μL Taq酶0.2μL，ddH2O 15.4μL。所述扩增F5基因序列的反应程序优选为第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→51℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃保温。
本发明提供了一种莱顿第五因子缺乏症诊断试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。
在本发明中，所述PCR扩增试剂优选包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Taq聚合酶。所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH8.3的100mmol/L Tris-Cl和15mmol/L MgCl2。
在本发明中，利用所述试剂盒辅助诊断莱顿第五因子缺乏症的方法，优选包括以下步骤：
用所述试剂盒检测样本中F5基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有莱顿第五因子缺乏症：
若检测基因型是“c.2393delC纯合突变”，则诊断受试个体为莱顿第五因子缺乏症；
若检测基因型存在单个杂合突变“c.2393delC杂合突变”，则个体为携带者；
若检测基因型是“野生型”，则诊断受试个体为正常人。
在本发明中，所述样本优选为血液、羊水中的至少一种。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的检测莱顿第五因子缺乏症的引物、基因突变体、突变体蛋白、试剂及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
样本获取
发明人发现了1个莱顿第五因子缺乏症家系(简称1号家系)，该家系部分成员的临床信息见表1。图1家系图谱，其中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者。
1.诊断标准：
可参照《人类单基因遗传疾病》2010版：
F5因子变异伴随增高3-6倍原发和复发静脉血栓的危险性，尤其在没有短暂的危险因子如手术、损伤存在的病人。纯合子变异的病人静脉血栓的危险性搞80倍，在由获得性或遗传性高半胱氨酸血症患者和口服避孕药的妇女中血栓形成的危险性增加。而且，F5变异的妇女妊娠期间的血栓形成的几率更大。
表1莱顿第五因子缺乏症1号家系成员的临床信息
如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
1号家系人员Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ1(先证者)外周血DNA用于测序分析。
实施例2
外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2仪器设备一览表
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDye Ter分钟ator V3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。
3.试剂配方
5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
试剂 Tris 硼酸 EDTA(pH 8.0，0.5mol/L) ddH2O
体积/重量 5.4g 750mg 2mL 90mL
用ddH2O将最终体积调整为100mL。
0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释10倍即可。
10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
试剂 NH4Cl KHCO3 EDTA 加ddH2O
体积/重量 82.9g 10g 0.37g 至1000mL
高压灭菌，4℃保存。
1×细胞核裂解液按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
试剂 2M Tris-HCl，pH8.2 4M NaCl 2mM EDTA
体积/重量 0.5mL 10mL 0.4mL
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)和Ⅱ1(先证者)等成员的外周血3～5mL。
4.1样本DNA提取
1)将样本3～5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。
2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置于-70℃保存。
4.2外显子测序
参考人类全外显子测序试剂盒(Agilent)说明书和分子克隆实验室手册(第三版；Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 1SECOND EDITION；New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress，2014)操作指南。
1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150～250bp片段。
2)DNA片段做末端修复和3’末端加A。
3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化。
4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析。
5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到1个具有致病意义的基因纯合突变F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13；c.2393delC突变为第13外显子的第2393碱基C缺失，造成了移码突变。在1号家系患者(先证者)F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点的基因型是“c.2393delC”纯合突变；在1号家系携带者该位点的基因型为“c.2393delC”杂合突变。
实施例3
Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点进行验证。分别对实施例1中的1号系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ1(先证者)等3名人员和100名家系外正常人进行F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1、DNA提取
按照实施例1的方法提基因组DNA。
2、候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manu al&source＝genome.ucsc.edu)。
2.2针对c.2393delC位点分别设计18对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。
表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
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/>
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注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：
①引物长度为15～30nt，常用为20nt左右。
②G+C含量以40％～60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布。
③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
④引物内部不应出现互补序列。
⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠。
⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
2.3候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。
表7引物检测PCR反应体系
/>
/>
反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10-15分钟。
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价：
1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和反应体系有效性好和特异性强；
2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中位点1号对候选引物)作为突变家系检测用引物：
针对F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点的PCR扩增引物序列如下：5’-CTTATTTGTGGGGATAGAGC-3’(SEQ ID NO.1)；5’-TGTGCTTTGCTGCTTGA-3’(SEQ IDNO.2)。
其他候选引物因为存在引发发夹结构、或引物二聚体、或非特异性结合扩增，导致PCR效果较差，故舍弃。
3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8突变位点PCR反应体系
试剂 体积
10×PCR缓冲液 2.0μL
10mmol/L dNTPs 0.4μL
100ng/μL F5-1F 0.5μL
100ng/μL F5-1R 0.5μL
100ng/μL抽提DNA 1.0μL
5U/μL Taq酶 0.2μL
ddH2O 15.4μL
反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：
针对F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点的PCR扩增程序如下：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→51℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9 BigDye反应体系
试剂 用量
PCR产物纯化后DNA 2.0μL
3.2pmol/μL测序引物 1.0μL
BigDye 0.5μL
5×BigDye测序缓冲液 2.0μL
ddH2O 4.5μL
测序PCR循环条件：
第一步：96℃，1分钟；
第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；
2)加入70μL 70％酒精，振荡混匀4次，室温放置15分钟；
3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；
4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序。
测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物：
针对F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点的测序引物序列如下：
5’-TCTAATCTCCACTAAGCAACA-3’(SEQ ID NO.3)；
5’-GGCTGGAATGCTCTGCT-3’(SEQ ID NO.4)。
9、结果分析
图2的Sanger测序结果显示，1号家系1名人员F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点基因型是“c.2393delC”纯合突变。图2测序图中箭头所指位置显示A层F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点基因型是“c.2393delC”纯合突变；图2测序图中箭头所指位置显示B和C层F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点基因型是“c.2393delC”杂合突变。
实施例4
莱顿第五因子缺乏症诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
1)扩增引物(每条引物1.2μg)：如实施例3所示；
2)缓冲液(500μL的10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl(pH8.3)，15mmol/L MgCl2)；
3)Taq酶(20U)；
4)dNTPs(四种dNTP各4mM)；
5)F5：c.2393delC阳性突变参考品DNA，阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示：
其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为点突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。
6)测序引物：如实施例3所示。
2、使用方法：
共筛查和检测196个出血性疾病(凝血功能异常)家系中598位个体，并再次发现如下家系13个，其中患者14人，携带者31人(见表10)，现将本试剂盒应用于2号家系患者检测，2号家系情况见表11。
表10莱顿第五因子缺乏症筛查情况一览表
/>
*：1次妊娠中期流产，未检测，病因不明；
+1：为领养人员，不计入家系人数。
表11莱顿第五因子缺乏症2号家系成员的临床信息
如图3所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
2号家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)、Ⅱ1(先证者)外周血DNA和Ⅱ2(胎儿)羊水DNA用于试剂盒检测。
1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。
2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应，如实施例3。
3)对PCR扩增产物进行纯化。
4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应。
5)对BigDye反应产物纯化。
6)对BigDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
图4的试剂盒检测结果显示，2号家系先证者F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点基因型是“c.2393delC”纯合突变。图4测序图中箭头所指位置显示C层F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13位点基因型是“c.2393delC”纯合突变；图4测序图中箭头所指位置显示A和B层个体基因型为“c.2393delC”杂合突变，D层个体基因型为“野生型”。检测结果确认先证者为莱顿第五因子缺乏症患者，其母亲和父亲为突变基因携带者，胎儿为正常个体；遗传咨询意见为建议继续妊娠，并做好孕期监测；该夫妻再生育莱顿第五因子缺乏症患者的几率是1/4，生育携带者后代的几率是1/2，生育完成正常个体的几率是1/4，建议夫妻计划再生育时行胚胎植入前遗传学诊断以及妊娠后来医院行产前诊断；胎儿出生后随访，未见莱顿第五因子缺乏症相关表型。
实施例5
基因突变评级与解读(突变的致病性)
突变解读基于我们目前对莱顿第五因子缺乏症与致病基因F5的了解认识(https://omim.org/entry/227400)，以及检测结果对受检者进行临床表型关联。突变遵从突变命名的HGVS指南(http://www.hgvs.org/)，并根据GenBank登记号命名(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。基因变异数据解读规则参考美国医学遗传学和基因组学学院(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)相关指南：Richards,S,et al.,Standards and guidelines for the interpretation of sequencevariants:a joint consensus recommendation of the American College of MedicalGenetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology.Genet Med，advance online publication 5March 2015.doi:10.1038/gim.2015.30；以及中国《遗传变异分类标准与指南》：王秋菊，沈亦平，邬玲仟，等.遗传变异分类标准与指南.中国科学：生命科学，2017，47：668–688。
《遗传变异分类标准与指南》中遗传变异分类是基于典型的数据类型(如人群数据、计算数据、功能数据、共分离数据)对变异进行五级分类，分别为：“致病的(pathogenic，P)”、“可能致病的(likely pathogenic，LP)”、“意义不明确的(variant of uncertainsignificance，VUS)”、“可能良性的(likely benign，LB)”和“良性的(benign，B)”；五级分类的判定是基于对变异的各个侧面/子项目进行解读分析后的综合评分(表12)。
表12变异致病性判定准则
/>
五级评定之前，需要对突变/变异的各侧面/子项进行分析/解读。其中，致病变异标准可分为：非常强(very strong，PVS1)、强(strong，PS1～4)、中等(moderate，PM1～6)、或辅助证据(supporting，PP1～5；良性变异证据可分为：独立(stand-alone，BA1)、强(strong，BS1～4)、或辅助证据(BP1～6)(见下表13)。对于一个给定的突变/变异，首先需要基于观察到的证据来选择表13中的标准，判断突变/变异各侧面/子项能满足表13中的哪几条，每条分别被评为PVS1/PS1～4/PM1～6/PP1～5/BA1/BS1～4/BP1～6中的哪个，最后再根据表12的评分规则把可满足的各条子项标准组合起来，再根据表12的组合标准从五级系统中选择一个分类；例如，如果该突变的各侧面/子项经分析后具备PVS1、PM1、PM2三条，则该突变综合评级为“致病”[即满足表12中“致病(P)”中(i)+(b)的准则]。
表13变异判读标准及变异致病性判定准则
/>
/>
突变/变异各侧面/子项的分析/解读需要基于相应的生物信息分析工具(见表15)和众多可用的数据(库)(见表16)，包括现有案例获得的数据，以及已有公布的数据，比如公共数据库(如ClinVar或位点特异数据库)和实验室自有数据库获得。采用各种数据(库)对突变/变异进行分析时，采用的程度判断评价标准如表14所示。
表14程度判断评价标准
/>
表15生物信息分析工具
/>
表16人群数据库、疾病特异性数据库和序列数据库
/>
根据上述标准或准则，本发明中F5基因c.2393delC突变评定为“致病”，判断标准及具体证据如下表17：
表17F5基因c.2393delC突变致病性解读
AR：指常染色体隐性遗传。
F5:NM_000130.5:exon13:c.2393delC:p.P798Lfs*13变异评级证据描述如下：
1、PVS1：F5基因c.2393delC变异可导致移码突变，超过10％的蛋白区域受影响；
2、PS4：结合文献和本病例，共在16名患者中检测到该变异；
3、PM2：F5基因c.2393delC变异在参考人群千人基因组(1000G)、人类外显子数据库(ExAC)和人群基因组突变频率数据库(gnomAD)中没有发现；
4、PM3：对于隐性遗传病，该突变已在15例患者该变异的反式位置(另一条同源染色体上)检测到致病变异(即纯合突变-两条染色体上均检测到该变异)；
5、PP3：多种计算机软件预测该变异会对基因或基因产物造成有害的影响；
6、PP4：本发明中，多个病例中的先证者出血症状非常典型，患者表型及家族史具有高度基因特异性。
因此，该突变/变异的综合性证据(PVS1+PS4+PM2+PM3+PP3+PP4)符合表12中“致病(P)”评判标准(i)中任意条(a)(b)(c)(d)，在此综合判定F5基因c.2393delC变异为“致病”。
实施例6
随访及诊断试剂盒检测性能分析
对于经过产前诊断的胎儿，对其出生后情况进行了随访。并对所有个体的F5基因靶向捕获芯片法进行重测序分析验证(见表18)。
表18 c.2393delC位点检测的性能分析结果
指标 公式 结果
真阳性变异位点(TP) / 48
真阴性变异位点(TN) / 18
假阳性变异位点(FP) / 0
假阴性变异位点(FN) / 0
灵敏度(N＝48) TP/(TP+FN) 100％(95％CI:99.03％～100％)
特异度(N＝18) TN/(TN+FP) 100％(95％CI:99.03％～100％)
阳性预测值 TP/(TP+FP) 100％(95％CI:99.03％～100％)
阴性预测值 TN/(TN+FN) 100％(95％CI:99.03％～100％)
注：本表包含家系1的随访数据；其中纯合突变和杂合突变均作为阳性结果进行分析。
根据表1和表10可以看出，在对14个家系进行检测时发现阳性患者(15例)和携带者(32例)。上述阳性位点检测结果均通过F5基因靶向捕获芯片法验证。根据随访和验证结果，本次共发现47例真阳性病例(纯合突变和杂合突变为阳性)、18例真阴性病例、0例假阴性和0例假阳性病例。c.2393delC变异位点标记物进行检测的灵敏度为100.00％，其95％CI为99.03％～100％，特异度为100％，其95％CI为99.03％～100％。以上结果说明，本试剂盒在临床应用时具有良好的检测性能。
由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的F5基因突变体，且确认了新突变体与莱顿第五因子缺乏症的发病密切相关，所述致病突变体可用于莱顿第五因子缺乏症的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。
本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。

Claims (10)

1.一种F5基因突变体，其特征在于，所述F5基因突变体相较于野生型F5基因，所述野生型F5基因的第13号外显子的第2393位碱基C缺失。
2.一种F5突变体蛋白，其特征在于，所述F5突变体蛋白相较于野生型F5基因编码的蛋白，第798位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。
3.一种如权利要求1所述的F5基因突变体或如权利要求2所述的F5突变体蛋白作为检测靶点在制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂和/或制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂盒中的应用。
4.一种检测莱顿第五因子缺乏症的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括上游引物F5-1F和下游引物F5-1R；所述上游引物F5-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物F5-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
5.一种检测莱顿第五因子缺乏症的测序引物，其特征在于，所述测序引物包括上游引物F5-Seq1F和下游引物F5-Seq1R；所述上游引物F5-Seq1F包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述下游引物F5-Seq1R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
6.一种检测莱顿第五因子缺乏症的引物组合，其特征在于，包括如权利要求4所述的扩增引物和/或如权利要求5所述的测序引物。
7.一种如权利要求6所述的引物组合在制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述莱顿第五因子缺乏症的检测靶点包括F5基因突变体；所述F5基因突变体相较于野生型F5基因，所述野生型F5基因的第13号外显子的第2393位碱基C缺失。
9.一种莱顿第五因子缺乏症检测试剂，其特征在于，所述莱顿第五因子缺乏症检测试剂包括如权利要求6所述的引物组合。
10.一种如权利要求9所述的莱顿第五因子缺乏症检测试剂在莱顿第五因子缺乏症检测试剂盒及其制备中的应用。
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