CN115851918B

CN115851918B - 一种导致视网膜营养不良的致病基因cfap410突变位点的应用及检测试剂

Info

Publication number: CN115851918B
Application number: CN202211630043.9A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 聂欢; 伊宁; 李婵艺; 熊亚
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-12-19
Filing date: 2022-12-19
Publication date: 2024-04-23
Anticipated expiration: 2042-12-19
Also published as: CN115851918A

Abstract

本发明提供了一种导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点c.144‑1G>A的应用及诊断试剂，属于基因诊断技术领域。本发明通过外显子组测序技术首次发现了CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144‑1G>A位点突变导致视网膜营养不良(MIM 617547)。本发明中检测CFAP410基因突变c.144‑1G>A的试剂用于筛查或诊断视网膜营养不良致病，以指导患者治疗和帮助优生优育，为视网膜营养不良的发病机制研究提供了新的基础和途径，为视网膜营养不良治疗提供新的理论依据，可以为治疗视网膜营养不良提供可能的药物靶点。

Description

一种导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点的应用及检测试剂

技术领域

本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点的应用及检测试剂。

背景技术

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一组以进行性视网膜光感受器细胞凋亡和色素上皮变性为主要特征的遗传性视网膜变性疾病，具有显著临床及遗传异质性。

大多RP患者青少年时期起病，首先是视杆细胞逐渐丧失，随后出现视锥细胞受累，视网膜色素上皮细胞死亡。因此通常以夜盲为首发症状(但城市化后部分患者常以视力下降为首发症状)，而且夜盲出现得越早，患者的病情往往越严重。虽然周边视野缺损也发生较早，但患者通常意识不到，很少以此作为疾病早期的主诉。病情逐渐发展为中心视力下降，视野进一步缩窄，多数在40岁之前就成为法定盲人。患者的视功能损伤程度可与遗传方式相关，通常认为常染色体显性遗传的RP患者视力预后较好，大部分患者在30岁之前视力优于0.6；X连锁遗传的男性RP患者视力预后最差，几乎所有的患者在50岁以后视力均低于0.1；常染色体隐性遗传的RP患者和散发的RP患者严重程度介于两者之间。患者的眼底表现与疾病所处的阶段相关：疾病早期患者眼底在常规检查下可表现正常或接近正常，但部分患者在中周部眼底照相下可以观察到早期毯层样视网膜变性(这类细微改变在目前的扫描激光眼底照相或广域眼底照相下很难识别)。随着病情的进展，部分人会出现典型的眼底改变，表现为视网膜骨细胞样色素沉积合并中周部视网膜萎缩，视盘蜡黄，视网膜血管变细等；部分病人会出现毯层样视网膜变性或脱色素改变，见于中周部视网膜或广泛变性。其他常见的并发症还包括黄斑囊样变性、后囊下白内障、玻璃体尘样颗粒、视盘玻璃膜疣等并发症；少见的并发症有Coat’s样视网膜病变。

RP是最常见的遗传性致盲眼病，世界范围内患病率为1/7000～1/3000，在我国约为1/3784。RP可分成两大类：非综合征性RP和综合征性RP占20％～30％。前者仅局限于眼部异常，后者与其他遗传综合征相关。与RP有关的综合征包括30余种疾病，如Usher综合征、Bardet-Biedl综合征、综合征、Refsum综合征、Cockayne综合征、Hunter综合征等。

RP的遗传方式多种多样，主要包括常染色体显性遗传ADRP(15％～25％)、常染色体隐性遗传ARRP(5％～20％)及X染色体连锁遗传XLRP(10％～15％)，此外还有40％～50％为散发。双基因遗传RP及线粒体遗传RP十分罕见。目前已经确定81个与RP相关的基因位点，其中ADRP相关26个，ARRP相关52个，XLRP相关3个，这些基因在许多截然不同的生物学通路中起作用。相关致病基因在许多截然不同的生物学通路中起作用，包括光信号转导、视黄醇(维生素A)循环、基因转录、RNA剪切、胞内物质运输、CO₂和碳酸氢盐的平衡，光感受器结构、吞噬和细胞间互相作用等。

其中CFAP410基因(MIM 603191)基因突变会导致常染色体隐性遗传疾病视网膜营养不良伴黄斑葡萄肿(Retinal dystrophy with macular staphyloma)(MIM 617547)，该病为ADRP中的一种，主要表现为：夜盲症、视力下降、视网膜营养不良、中心暗点、畏光、核性白内障。

CFAP410基因(MIM 603191)定位于染色体21q22.3，包括7个外显子和6个内含子，基因长10.4kb，开放读码框771bp，编码256个氨基酸序列的蛋白CFAP410。CFAP410蛋白在几乎所有基因组测序的脊椎动物中都具有同源性。CFAP410蛋白有两个高度保守的区域：一个位于N端(1-142aa，由外显子1-5编码)，另一个位于C端(214-256aa，由第7外显子编码)；CFAP410的中间部分(143-213aa，由外显子5-6编码)在物种之间差异很大。在N端保守区，有一个线粒体定位信号肽、两个串联的富含亮氨酸重复序列4(LRR_4)域和一个富含亮氨酸的重复序列帽(LRRcap)域通过其特征基序识别。CFAP410在视网膜中表达，视网膜色素上皮(RPE)中的表达最强。在光感受器中，CFAP410蛋白定位于连接纤毛。其中，睫状体结构连接光感受器细胞的内外段，大多数综合征性视网膜营养不良与病变的睫状体相关。

因此，基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊视网膜营养不良的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。现有技术中对基因突变位点的基因型进行检测，可以采用其他方法限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等等，但这些检测方法均不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的目的，所以需要针对特异突变位点的特异性扩增引物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点的应用，不仅能丰富基因诊断视网膜营养不良的突变位点，还能作为靶点为药物筛选、药效评价及靶向治疗提供基础。

本发明的目的还在于提供一种检测导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点的试剂，助力视网膜营养不良基因突变的筛查和诊断。

本发明提供了一种基因CFAP410突变位点在制备防治视网膜营养不良诊断试剂或制备防治视网膜营养不良的药物中的应用，所述基因CFAP410突变位点为CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A。

本发明提供了一种用于检测导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点的试剂，包括检测致病基因CFAP410突变位点c.144-1G>A的引物；

所述检测致病基因CFAP410突变位点c.144-1G>A的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的CFAP410-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CFAP410-R。

优选的，所述试剂还包括测序引物；

所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CFAP410-SeqF和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CFAP410-SeqR。

本发明提供了一种视网膜营养不良诊断试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。

优选的，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Taq DNA聚合酶；

所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH 8.3的100mmol/LTris-HCl和15mmol/LMgCl₂。

本发明提供了所述试剂在制备检测导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点的试剂盒中的应用。

本发明提供了一种检测基因CFAP410突变位点的引物在制备视网膜营养不良辅助诊断试剂盒中的应用，所述基因CFAP410突变位点为CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A。

优选的，所述引物为所述试剂。

优选的，利用所述试剂盒辅助诊断视网膜营养不良的方法，包括以下步骤：

用所述试剂盒检测样本中CFAP410基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有视网膜营养不良：

若检测基因型是“c.144-1G>A纯合突变”，则诊断受试个体为视网膜营养不良；

若检测基因型存在单个杂合突变“c.144-1G>A杂合突变”，则个体为携带者；

若检测基因型是“野生型”，则诊断受试个体为正常人。

优选的，所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。

本发明提供了一种基因CFAP410突变位点在制备防治视网膜营养不良诊断试剂或制备防治视网膜营养不良的药物中的应用，所述基因CFAP410突变位点为CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A。本发明通过外显子组测序技术首次发现了CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点突变导致视网膜营养不良发病。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断视网膜营养不良致病基因突变患者，以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面，本发明为视网膜营养不良的发病机制研究奠定了重要基础，为视网膜营养不良患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗视网膜营养不良提供可能的药物靶点。

本发明所提供的诊断试剂盒，通过优化检测致病基因CFAP410突变位点的引物和反应体系，大大提高检测结果的准确性和可靠性，可用于快速、有效地预测或诊断视网膜营养不良。

附图说明

图1为视网膜营养不良1号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，□表示正常男性个体，■表示男性患者，↗表示先证者。

图2为利用Sanger测序检测CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点基因型的结果图，其中1号家系先证者为“c.144-1G>A”纯合突变，先证者父亲、先证者母亲为“c.144-1G>A”杂合突变携带者；先证者弟弟为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

图3为视网膜营养不良2号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者。

图4为利用试剂盒检测2号家系CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点基因型的结果图，其中2号家系先证者为“c.144-1G>A”纯合突变，先证者父亲、母亲为“c.144-1G>A”杂合突变(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

具体实施方式

本发明首先利用外显子测序筛选与视网膜营养不良高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，之后通过Sanger测序进行验证，最终获得视网膜营养不良的致病基因突变，CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A。本发明筛选的致病基因突变中可以将视网膜营养不良患者和正常人群区分开，因此，本发明的致病基因突变可以作为诊断视网膜营养不良的生物标志物。本发明所述CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A突变位点指两个等位CFAP410基因的第3号内含子紧邻第4号外显子的第一个碱基(第144-1位碱基)G突变为A，形成CFAP410基因突变体，所述CFAP410基因突变体的核苷酸序列优选如SEQID NO：5(CGTGCAATGTCAA)所示。

本发明提供了一种用于检测导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点的试剂，包括检测致病基因CFAP410突变位点c.144-1G>A的引物；所述检测致病基因CFAP410突变位点c.144-1G>A的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(CCAGTCCGCCTTTGAGTTC)所示的CFAP410-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2(CCCGCCAGACCAGGTATTT)所示的CFAP410-R。

在本发明中，所述试剂优选还包括测序引物。所述测序引物包括核苷酸序列如SEQID NO:3(GTGACTTGTGACATCCGATTTAGG)所示的CFAP410-SeqF和核苷酸序列如SEQ ID NO:4(GCCACCTACCCTGGTTGTCC)所示的CFAP410-SeqR。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法即可。

在本发明中，所述检测导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点的方法，优选包括以下步骤：

提取待测样本的基因组DNA；

以所述基因组DNA为模板，用所述试剂扩增CFAP410基因序列；

对扩增的CFAP410基因序列进行DNA测序；

将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，结果完全一致时说明待检样本中CFAP410基因未发生突变为野生型；若比对结果出现CFAP410基因(NM_015338.6)的第4号外显子中144-1位碱基G突变为A，则判断该基因型为“c.144-1G>A纯合突变”。

在本发明中，扩增CFAP410基因序列的反应体系优选为10×PCR缓冲液2.0μL、10mmol/L dNTPs 0.4μL、100ng/μL CFAP410-F 0.5μL、100ng/μL CFAP410-R0.5μL、100ng/μL抽提DNA 1.0μL、5U/μL Taq酶0.2μL,ddH₂O 15.4μL。所述扩增CFAP410基因序列的反应程序优选为第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→59℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃保温。

在本发明中，所述PCR扩增试剂优选包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Taq DNA聚合酶。所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/LKCl、pH 8.3的100mmol/LTris-HCl和15mmol/LMgCl₂。

在本发明中，基于所述基因CFAP410突变位点上下游序列设计特异性引物，采用所述引物扩增含所述突变位点的DNA片段，通过DNA片段的基因型判断是否有患视网膜营养不良的风险。在本发明实施例中，所述引物优选为所述试剂。

在本发明中，利用所述试剂盒辅助诊断视网膜营养不良的方法，优选包括以下步骤：

若检测基因型是“野生型”，则诊断受试个体为正常人。

在本发明中，所述样本优选为血液、羊水和活检组织中的至少一种。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。

文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，指基因序列或DNA序列中一个或数个(例如几个)碱基的添加、缺失和/或置换，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。术语“突变”当用于描述基因所编码的产物或者蛋白质时，“突变”指的是所述蛋白质或编码产物中一个或数个(例如几个)氨基酸残基的添加、缺失和/或置换。

在本发明中，术语“纯合突变”/“杂合突变”是指是等位基因中只有其中一个基因出现突变。

文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。

在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，

术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增CFAP410基因是指，在PCR反应中引物只扩增CFAP410基因，而不扩增其他基因。

下面结合实施例对本发明提供的一种导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点的应用及检测试剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

样本获取

发明人发现了1个视网膜营养不良家系(简称1号家系)，该家系部分成员的临床信息见表1。图1家系图谱，其中，表示男性携带者，表示女性携带者，□表示正常男性个体，■表示男性患者，↗表示先证者。

1.诊断标准：

可参照《人类单基因遗传疾病》2010版和《罕见病诊疗指南》2019版：

诊断标准：有典型眼底改变者即可直接诊断；对于眼底改变不典型者，需要ERG检查确诊。参考诊断指标如下：1)患者在出现视力下降之前首先表现夜间或暗处视力差；2)视野：周边视野缺损；3)ERG：国际标准ERG5项为暗视反应显著降低，较明视反应严重。晚期患者波形记录不到；4)眼底：视网膜中周部变性为主：①骨细胞样色素或椒盐样色素或灰白色素或不规则色素团块；②毯层样视网膜变性。

表1视网膜营养不良1号家系成员的临床信息

如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

1号家系人员Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ1(先证者)和Ⅱ2(先证者弟弟)外周血DNA用于测序分析。

实施例2

外显子测序

1.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备一览表

2.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDye Ter分钟ator V3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。

3.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	Tris	硼酸	EDTA(pH8.0,0.5mol/L)	ddH₂O
					体积/重量	5.4g	750mg	2mL	90mL

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。

0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

试剂	NH₄Cl	KHCO₃	EDTA	加ddH₂O
					体积/重量	82.9g	10g	0.37g	至1000mL

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	2MTris-HCl，pH8.2	4MNaCl	2mMEDTA
				体积/重量	0.5mL	10mL	0.4mL

4.实验步骤

签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ1(先证者)和Ⅱ2(先证者弟弟)等成员的外周血3～5mL。

4.1样本DNA提取

1)将样本3～5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。

2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

4.2外显子测序

参考人类全外显子测序试剂盒(Agilent)说明书和分子克隆实验室手册(第三版；Molecular CloningALABORATORYMANUAL 1SECOND EDITION；New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress，2014)操作指南。

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150～250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

4.3结果

最终得到1个具有致病意义的基因纯合突变CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A；c.144-1G>A突变为第3号内含子紧邻第4号外显子的碱基(第144-1位)由G突变为A，造成了剪切突变。在1号家系患者(先证者)CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点的基因型是“c.144-1G>A”纯合突变；在1号家系携带者该位点的基因型为“c.144-1G>A”杂合突变。

实施例3

Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点进行验证。分别对实施例1中的1号系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ1(先证者)、Ⅱ2(先证者弟弟)等4名人员和100名家系外正常人进行CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1的方法提基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.ed u)。

2.2针对c.144-1G>A位点分别设计17对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况

表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：

①引物长度为15～30nt，常用为20nt左右；

②G+C含量以40％～60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；

③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；

④引物内部不应出现互补序列；

⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；

⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

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反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5分钟；

第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。

第三步：72℃，7分钟；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10-15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中位点1号对候选引物)作为突变家系检测用引物：

针对CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点的PCR扩增引物序列如下：5’-CCAGTCCGCCTTTGAGTTC-3’(SEQ ID NO：1)；5’-CCCGCCAGACCAGGTATTT-3’(SEQ ID NO：2)。

其他候选引物因为存在引发发夹结构、或引物二聚体、或非特异性结合扩增，导致PCR效果较差，故舍弃。

3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变位点PCR反应体系

试剂	体积
		10×PCR缓冲液	2.0μL
10mmol/LdNTPs	0.4μL
		100ng/μLCFAP410-1F	0.5μL
100ng/μLCFAP410-1R	0.5μL
		100ng/μL抽提DNA	1.0μL
5U/μLTaq酶	0.2μL
		ddH₂O	15.4μL

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

针对CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点的PCR扩增程序如下：

第一步：95℃，5分钟；

第二步：30个循环(95℃，30秒→59℃，30秒→72℃，60秒)；

第三步：72℃，7分钟；

第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

试剂	用量
		PCR产物纯化后DNA	2.0μL
3.2pmol/μL测序引物	1.0μL
		BigDye	0.5μL
5×BigDye测序缓冲液	2.0μL
		ddH₂O	4.5μL

测序PCR循环条件：

第一步：96℃，1分钟；

第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；

第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；

3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；

4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序。

测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物：

针对CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点的测序引物序列如下：

5’-GTGACTTGTGACATCCGATTTAGG-3’(SEQ ID NO：3)；

5’-GCCACCTACCCTGGTTGTCC-3’(SEQ ID NO：4)。

9、结果分析

图2的Sanger测序结果显示，1号家系1名人员CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点基因型是“c.144-1G>A”纯合突变。图2测序图中箭头所指位置显示A层CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点基因型是“c.144-1G>A”纯合突变；图2测序图中箭头所指位置显示C和D层CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点基因型是“c.144-1G>A”杂合突变；图2测序图中箭头所指位置显示B层个体基因型为野生型。

实施例4

视网膜营养不良诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

1)扩增引物(每条引物1.2μg)：如实施例3所示；

2)缓冲液(500μL的10×PCR缓冲液：500mmol/LKCl，100mmol/LTris-HCl(pH8.3)，15mmol/LMgCl₂)；

3)Taq酶(20U)；

4)dNTPs(四种dNTP各4mM)；

5)CFAP410:c.144-1G>A阳性突变参考品DNA，阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示：

其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为点突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。

6)测序引物：如实施例3所示。

2、使用方法：

共筛查和检测19个眼部疾患家系中67位个体，并再次发现如下家系，并将本试剂盒应用于2号家系患者检测

表10视网膜营养不良2号家系成员的临床信息

如图3所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

2号家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)和Ⅱ1(先证者)外周血DNA用于试剂盒检测。

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应，如实施例3；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

图4的试剂盒检测结果显示，2号家系先证者CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点基因型是“c.144-1G>A”纯合突变。图4测序图中箭头所指位置显示A层CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A位点基因型是“c.144-1G>A”纯合突变；图4测序图中箭头所指位置显示B和C层个体基因型为“c.144-1G>A”杂合突变。检测结果确认先证者为视网膜营养不良患者，其母亲和父亲为突变基因携带者；遗传咨询意见为该夫妻再生育视网膜营养不良患者的几率是1/4，生育携带者后代的几率是1/2，生育完成正常个体的几率是1/4，建议夫妻计划再生育时行胚胎植入前遗传学诊断以及妊娠后来医院行产前诊断；先证者本人以后结婚，建议生育前其配偶行该基因突变检测。

由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的CFAP410基因突变体，且确认了新突变体与视网膜营养不良的发病密切相关，所述致病突变体可用于视网膜营养不良的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种包含基因CFAP410突变位点的阳性突变参考品DNA在制备防治视网膜营养不良诊断试剂中的应用，所述基因CFAP410突变位点为CFAP410:NM_004928 .3:exon4:c.144-1G>A；所述包含基因CFAP410突变位点的阳性突变参考品DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。

2.一种用于检测导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点的试剂，其特征在于，包括检测致病基因CFAP410突变位点c.144-1G>A的引物；所述检测致病基因CFAP410突变位点c.144-1G>A的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CFAP410-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CFAP410-R。

3.根据权利要求2所述试剂，其特征在于，所述试剂还包括测序引物；所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CFAP410-SeqF和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CFAP410-SeqR。

4.一种视网膜营养不良诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述试剂和PCR扩增试剂。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Taq DNA聚合酶；所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH8 .3的100mmol/L Tris-HCl和15mmol/L MgCl₂。

6.权利要求2或3所述试剂在制备检测导致视网膜营养不良的致病基因CFAP410突变位点的试剂盒中的应用，所述致病基因CFAP410突变位点为CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A。

7.一种检测基因CFAP410突变位点的引物在制备视网膜营养不良辅助诊断试剂盒中的应用，所述基因CFAP410突变位点为CFAP410:NM_004928.3:exon4:c.144-1G>A。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，利用所述试剂盒辅助诊断视网膜营养不良的方法，包括以下步骤：用所述试剂盒检测样本中CFAP410基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有视网膜营养不良：若检测基因型是“c.144-1G>A纯合突变”，则诊断受试个体为视网膜营养不良；若检测基因型存在单个杂合突变“c.144-1G>A杂合突变”，则个体为携带者；若检测基因型是“野生型”，则诊断受试个体为正常人。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。