CN115927577A - 一种srtd 6型致病基因nek1复合杂合突变位点的应用及其诊断试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种SRTD6型致病基因NEK1复合杂合突变位点的应用及其诊断试剂，属于基因诊断技术领域。本发明首次确认NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*位点复合杂合突变可以导致短肋胸廓发育不良综合征6型(MIM263520)。因此，本发明提供了一种SRTD6型致病基因NEK1复合杂合突变位点在制备SRTD6型诊断试剂或制备预防和/或治疗SRTD6型药物中的应用。本发明提供的诊断试剂可以用于短肋胸廓发育不良综合征6型的遗传学诊断，为产前诊断和优生优育提供指导。
Description
技术领域
本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种SRTD 6型致病基因NEK1复合杂合突变位点的应用及其诊断试剂。
背景技术
短肋胸廓发育不良(short-rib thoracic dysplasia，SRTD)是一类因为纤毛结构或功能异常而引起的以肋骨短小，伴四肢长骨短小，伴或不伴有多指(趾)畸形，可能合并多脏器损害的为特征的常染色体隐性遗传疾病，属于骨骼纤毛类疾病的一种。临床上根据临床表型和放射学表现、致病基因可分为4种：短肋-多指综合征(SRPS)、窒息性胸廓发育不良(ATD)和软骨外胚层发育不全综合征(EV)、Mainzer-Saldino综合征。
SRTD又分为多种亚类，如胸廓发育不良综合征1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21型。短肋胸廓发育不良综合征6型(OMIM 263520)是其中一种亚型，主要临床表现为侏儒症，胸廓狭窄，肋骨短，管状骨短，髋臼顶的“三叉戟”外观，软骨发育不良，多指畸形，视网膜营养不良，远视，唇腭裂，肺发育不良，多囊肾，生殖器官发育异常。
SRTD致病基因有20种，主要包括：NEK1、DYNC2H1、DYNC2LI1、WDR34、WDR60、TCTEX1D2、IFT43、WDR19、IFT122、TTC21B、WDR35、IFT140、IFT80、IFT172、IFT52、IFT81、EVC、EVC2、KIAA0586等。SRTD属于骨骼纤毛疾病，是一类由于纤毛结构或功能异常而致病的先天发育异常的疾病。纤毛是一种突出于细胞膜表面的细胞器，纤毛介导多个重要的细胞信号通路，如果上述基因突变可导致纤毛结构或功能异常，从而引起相应的细胞信号通路异常，进而引起机体致病状态，导致骨骼发育异常。NEK1(MIM604588)是短肋胸廓发育不良综合征6型的致病基因。NEK1基因是定位于染色体4q33，基因长219.8kb，包含34个外显子和33个内含子，编码1258个氨基酸组成的蛋白并定位于纤毛基体。NEK1参与DNA双链的修复、神经元的发育和体外细胞周期相关纤毛形成的协调。NEK1与中心体相关，在细胞有丝分裂过程中从核转运到基体，从而进行纤毛的形成。在细胞核中，NEK1可能还影响核基因的表达。NEK1激酶活性的大小在人体细胞中影响有丝分裂和纤毛蛋白的表达、纤毛蛋白复合物在中心体的组装和停靠以及转运体的分解以影响纤毛的生成，同时也可能参与直接调节细胞鞭毛内运输机制。NEK1缺陷时导致SRTD 6型的发生。
基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊短肋胸廓发育不良综合征6型的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种SRTD 6型致病基因NEK1复合杂合突变位点的应用及其诊断试剂，可以将SRTD 6型患者、携带者和正常人群区分。
本发明提供了一种SRTD 6型致病基因NEK1复合杂合突变位点NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*在制备SRTD 6型诊断试剂或制备预防和/或治疗SRTD 6型药物中的应用。
本发明提供了一种SRTD 6型基因诊断试剂，所述试剂是扩增基因NEK1复合杂合突变位点NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的NEK1-1F、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的NEK1-1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的NEK1-2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的NEK1-2R。
优选的，所述试剂包括测序引物；所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的NEK1-Seq1F、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的NEK1-Seq1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的NEK1-Seq2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的NEK1-Seq2R。
优选的，所述试剂还包括PCR扩增试剂。
本发明提供了所述诊断试剂在制备SRTD 6型基因诊断试剂盒中的应用。
优选的，所述诊断的方法为利用试剂盒检测样本基因NEK1复合杂合突变位点判断是否患SRTD 6型疾病，所述基因NEK1复合杂合突变位点为NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*的基因型，检测结果为“c.242A>T和c.1318C>T”双杂合突变，则判断NEK1基因存在复合杂合突变，样本为患者；若位点存在“c.242A>T”或“c.1318C>T”单个杂合突变，则判断NEK1基因为单杂合突变，样本为携带者；若位点没有突变，则判断NEK1基因为野生型，样本是正常人。
优选的，所述样本为血液和/或羊水。
本发明提供了一种用于SRTD 6型基因诊断试剂盒，包括所述诊断试剂。
本发明提供了一种SRTD 6型致病基因NEK1复合杂合突变位点NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*在制备SRTD 6型诊断试剂或制备预防和/或治疗SRTD 6型药物中的应用。本发明通过外显子组测序技术首次确认NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*位点突变可以导致SRTD 6型发病。以所述突变位点为分子标志物，诊断SRTD 6型发病情况。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，用于SRTD 6型遗传学上的筛查或诊断，为产前诊断和优生优育提供指导。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断SRTD6型。另一方面，本发明为短肋胸廓发育不良综合征6型的发病机制研究奠定了重要基础，为SRTD 6型患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗SRTD 6型提供可能的药物靶点。
附图说明
图1为短肋胸廓发育不良综合征6型1号家系遗传图谱；其中，
表示男性携带者，
表示女性携带者，■表示男性患者，◆表示患病胎儿，↗表示先证者。
图2为用Sanger测序检测1号家系NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V位点基因型的结果图，1号家系中先证者、先证者母亲、胎儿为c.242A>T杂合突变(测序图中箭头所指为突变发生位置)；
图3为利用Sanger测序检测1号家系NEK1:NM_001199397:exon17:c.1318C>T:p.R440*位点基因型的结果图，1号家系中先证者、先证者父亲、胎儿为c.1318C>T杂合突变(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
图4为短肋胸廓发育不良综合征6型2号家系遗传图谱。其中，
表示男性携带者，
表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者；
图5为利用试剂盒检测2号家系NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V位点基因型的结果图，2号家系中先证者、先证者父亲为c.242A>T杂合突变(测序图中箭头所指为突变发生位置)；
图6为利用试剂盒检测2号家系NEK1:NM_001199397:exon17:c.1318C>T:p.R440*位点基因型的结果图，2号家系中先证者、先证者母亲为c.1318C>T杂合突变(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
具体实施方式
本发明提供了一种SRTD 6型致病基因NEK1复合杂合突变位点NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*在制备SRTD 6型诊断试剂或制备预防和/或治疗SRTD 6型药物中的应用。
在本发明中，所述致病基因NEK1的突变体核苷酸序列如SEQ ID NO:11(ATAGTAATGGTTTACTGTGAG)和SEQ ID NO:12(TCATCTTTTTCTTCTTGA)所示，基因全长可参考NM_001199397。所述致病基因NEK1复合杂合突变位点NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*表示核苷酸序列中第242位碱基由A突变T后造成编码的蛋白第81位氨基酸由天冬氨酸突变为缬氨酸，同时核苷酸序列中第1318位碱基C突变为T，为无义突变，造成编码的蛋白第440位氨基酸由精氨酸变为终止密码子，造成截短蛋白少了819个氨基酸残基。所述致病蛋白NEK1的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO:13(IVMVYCE)和SEQ ID NO:14(SSFSS*)所示。
本发明提供了一种SRTD 6型基因诊断试剂，所述试剂是扩增基因NEK1复合杂合突变位点NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(GAAAACTAAGATAACCCAT)所示的NEK1-1F、核苷酸序列如SEQ ID NO:2(GTAAGCCAGATTGACAGA)所示的NEK1-1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:3(CATAAACAACGGAACAGA)所示的NEK1-2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:4(ATGCTTTCAGAGTAATCAA)所示的NEK1-2R。
在本发明中，所述试剂优选包括测序引物；所述测序引物包括核苷酸序列如SEQID NO:5(CTTTTGAGTATGGTCCTGTT)所示的NEK1-Seq1F、核苷酸序列如SEQ ID NO:6(CAACTGAACAAAGGTGGC)所示的NEK1-Seq1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:7(AGGCTTTATGTTTGTTAGTA)所示的NEK1-Seq2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:8(TTACTATCTCAGAAGCAAAG)所示的NEK1-Seq2R。所述试剂优选还包括PCR扩增试剂。所述PCR扩增试剂包括但不限于dNTP、PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶等。
本发明提供了所述诊断试剂在制备SRTD 6型基因诊断试剂盒中的应用。
在本发明中，所述诊断的方法优选为利用试剂盒检测样本基因NEK1复合杂合突变位点的基因型判断是否患SRTD 6型疾病，所述基因NEK1复合杂合突变位点为NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*的基因型，检测结果为“c.242A>T和c.1318C>T”双突变，则判断NEK1基因存在复合杂合突变，样本为患者；若位点存在“c.242A>T”或“c.1318C>T”单个杂合突变，则判断NEK1基因为单杂合突变，样本为携带者；若位点没有突变，则判断NEK1基因为野生型，样本是正常人。所述样本优选为血液和/或羊水。所述试剂盒检测样本基因NEK1复合杂合突变位点的基因型的方法，优选为提取样本基因组DNA，用扩增引物进行PCR扩增，得到的PCR产物进行DNA测序，测序结果242位碱基为AT，同时1318位碱基为CT时，判断NEK1基因存在复合杂合突变，样本为SRTD 6型患者，若位点存在242位碱基为AT或1318位碱基为CT时，则判断NEK1基因为单杂合突变，样本为SRTD 6型疾病携带者；若两个位点均没有突变，则判断NEK1基因为野生型，样本是正常人。
本发明提供了一种用于SRTD 6型基因诊断试剂盒，包括所述诊断试剂。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。
在本发明中，术语“复合杂合突变”是指是指等位基因均出现1处或以上的杂合突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。
文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患胎的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，
术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增NEK1基因是指，在PCR反应中引物只扩增NEK1基因，而不扩增其他基因。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下面结合实施例对本发明提供的一种SRTD 6型致病基因NEK1复合杂合突变位点的应用及其诊断试剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
样本获取
发明人发现了一个短肋胸廓发育不良综合征6型家系(简称NEK1家系)，该NEK1家系部分成员的临床信息见表1。图1显示了NEK1家系图谱，其中，
表示男性携带者，
表示女性携带者，■表示男性患者，◆表示患病胎儿，↗表示先证者。
1.诊断标准：
可参照《人类单基因遗传疾病》2010版：
主要临床表现为侏儒症，胸廓狭窄，肋骨短，管状骨短，髋臼顶的“三叉戟”外观，软骨发育不良，多指畸形，视网膜营养不良，远视，唇腭裂，肺发育不良，多囊肾，生殖器官发育异常。
表1短肋胸廓发育不良综合征6型家系成员的临床信息
如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)、Ⅱ1(先证者)外周血和Ⅱ2(胎儿)羊水DNA用于测序分析。
实施例2
外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2仪器设备一览表
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminator V3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。
3.试剂配方
5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
| 试剂 | 体积/重量 |
| Tris | 5.4g |
| 硼酸 | 750mg |
| EDTA(pH 8.0,0.5mol/L) | 2mL |
| ddH2O | 90mL |
用ddH2O将最终体积调整为100mL。
0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释10倍即可。
10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
| 试剂 | 体积/重量 |
| NH4Cl | 82.9g |
| KHCO3 | 10g |
| EDTA | 0.37g |
| 加dH2O | 至1000mL |
高压灭菌，4℃保存。
1×细胞核裂解液按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
| 试剂 | 体积/重量 |
| 2M Tris-HCl,pH8.2 | 0.5mL |
| 4M NaCl | 10mL |
| 2mM EDTA | 0.4mL |
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集家系中Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)、Ⅱ1(先证者)等成员的外周血3～5mL和Ⅱ2(胎儿)羊水5～10mL。
4.1样本DNA提取
1)如为肝素抗凝外周血样本，则将外周血3-5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。羊水样本直接进入下一步。
2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150～250bp片段；
2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；
3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；
4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到2个具有致病意义的基因突变NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*；c.242A>T突变造成第81天冬氨酸变为缬氨酸，c.1318C>T突变为无义突变，造成第440位氨基酸由精氨酸变为终止密码子，造成截短蛋白少了819个氨基酸残基。在家系患者个体中NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*位点的基因型是“c.242A>T和c.1318C>T”复合杂合突变，在NEK1家系在携带者个体中基因型是“c.242A>T”或“c.1318C>T”单个杂合突变。
实施例3
Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*位点进行验证。分别对实施例1中的Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ2等家系人员和100名家系外正常人进行NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1、DNA提取
按照实施例1的方法提基因组DNA。
2、候选引物设计、验证及优选
2.1引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，引物序列由上海生工生物技术公司合成。
2.2针对c.242A>T和c.1318C>T位点分别设计16对和15对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况
表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：
①引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；
②G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；
③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；
④引物内部不应出现互补序列；
⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；
⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
2.3候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。
表7引物检测PCR反应体系
反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10-15分钟。
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价：
1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；
2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中两突变位点1号对引物)作为突变家系检测用引物，引物序列如下所示：针对NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V位点的引物序列如下所示：
5’-GAAAACTAAGATAACCCAT-3’(SEQ ID NO：1)
5’-GTAAGCCAGATTGACAGA-3’(SEQ ID NO：2)
针对NEK1:NM_001199397:exon17:c.1318C>T:p.R440*位点的引物序列如下所示：
5’-CATAAACAACGGAACAGA-3’(SEQ ID NO:3)
5’-ATGCTTTCAGAGTAATCAA-3’(SEQ ID NO:4)
3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8突变位点PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 10×PCR缓冲液 | 2.0μL |
| 10mmol/L dNTPs | 0.4μL |
| 100ng/μL NEK1-F | 0.5μL |
| 100ng/μL NEK1-R | 0.5μL |
| 100ng/μL外周血抽提DNA | 1.0μL |
| 5U/μL Taq酶 | 0.2μL |
| ddH2O | 15.4μL |
反应条件：将反应体系放入PCR仪，
针对NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V执行以下反应程序：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→44℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
针对NEK1:NM_001199397:exon17:c.1318C>T:p.R440*执行以下反应程序：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→46℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9 BigDye反应体系
| 试剂 | 用量 |
| PCR产物纯化后DNA | 2.0μL |
| 3.2pmol/μL测序引物 | 1.0μL |
| BigDye | 0.5μL |
| 5×BigDye测序缓冲液 | 2.0μL |
| ddH2O | 4.5μL |
测序PCR循环条件：
第一步：96℃，1分钟；
第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc(pH5.2)；
2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；
3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；
4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，引物序列如下所示：
针对NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V位点的引物序列如下所示：
5’-CTTTTGAGTATGGTCCTGTT-3’(SEQ ID NO:5)
5’-CAACTGAACAAAGGTGGC-3’(SEQ ID NO:6)
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，针对NEK1:NM_001199397:exon17:c.1318C>T:p.R440*位点的引物序列如下所示：
5’-AGGCTTTATGTTTGTTAGTA-3’(SEQ ID NO:7)
5’-TTACTATCTCAGAAGCAAAG-3’(SEQ ID NO:8)
9、结果分析
图2的Sanger测序结果显示，家系3名人员NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V位点基因型是“c.242A>T”杂合突变。图2测序图中箭头所指位置显示B、C和D层NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V位点基因型是“c.242A>T”杂合突变，图A层该基因位点为野生型。
图3的Sanger测序结果显示，家系3名人员NEK1:NM_001199397:exon17:c.1318C>T:p.R440*位点基因型是“c.1318C>T”杂合突变。图3测序图中箭头所指位置显示A、C和D层个体NEK1:NM_001199397:exon17:c.1318C>T:p.R440*位点基因型是“c.1318C>T”杂合突变，图B层该位点基因型野生型。
实施例4
NEK1基因c.242A>T、c.1318C>T复合杂合突变诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
1)扩增引物：如实施例3所示
2)缓冲液
3)Taq酶
4)dNTPs
5)NEK1:c.242A>T、c.1318C>T阳性突变参考品DNA，该参考品为一段双链DNA，c.242A>T阳性突变参考品DNA具体序列如下所示：
c.1318C>T阳性突变参考品DNA具体序列如下所示：
其中，加粗碱基为PCR扩增上下游引物，单下划线碱基表示突变位点，双下划线碱基表示上下游测序引物。
6)测序引物：如实施例3所示。
2、使用方法：
应用于2号家系对基因突变进行检测。
表10短肋胸廓发育不良综合征6型家2号系成员的临床信息
如图4所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)和Ⅱ1(先证者)外周血DNA用于测序分析。
1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。
2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；
3)对PCR扩增产物进行纯化；
4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；
5)对BiyDye反应产物纯化；
6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
图5显示2号家系NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V位点基因型检测结果，2号家系中先证者、先证者父亲为c.242A>T杂合突变，先证者母亲为野生型。图6显示2号家系NEK1:NM_001199397:exon17:c.1318C>T:p.R440*位点基因型检测结果图，2号家系中先证者、先证者母亲为c.1318C>T杂合突变，先证者父亲为野生型。检测结果确认先证者为短肋胸廓发育不良综合征6型患者，其父母为突变基因携带者，下次妊娠出生患孩的概率是1/4，妊娠出生携带者的概率是1/2，出生正常个体的概率是1/4；遗传咨询建议其父母下次妊娠前行胚胎植入前遗传学诊断或妊娠后行产前诊断。
由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的NEK1基因突变，且确认了新突变体与短肋胸廓发育不良综合征6型的发病密切相关，所述致病突变体可用于短肋胸廓发育不良综合征6型的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种SRTD 6型致病基因NEK1复合杂合突变位点NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*在制备SRTD 6型诊断试剂或制备预防和/或治疗SRTD 6型药物中的应用。
2.一种SRTD 6型基因诊断试剂，其特征在于，所述试剂是扩增基因NEK1复合杂合突变位点NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的NEK1-1F、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的NEK1-1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的NEK1-2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的NEK1-2R。
3.根据权利要求2所述诊断试剂，其特征在于，所述试剂包括测序引物；所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的NEK1-Seq1F、苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的NEK1-Seq1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的NEK1-Seq2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的NEK1-Seq2R。
4.根据权利要求2或3所述诊断试剂，其特征在于，所述试剂还包括PCR扩增试剂。
5.权利要求2～4任意一项所述诊断试剂在制备SRTD 6型基因诊断试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述诊断的方法为利用试剂盒检测样本基因NEK1复合杂合突变位点判断是否患SRTD 6型疾病，所述基因NEK1复合杂合突变位点为NEK1:NM_001199397:exon5:c.242A>T:p.D81V和exon17:c.1318C>T:p.R440*的基因型，检测结果为“c.242A>T和c.1318C>T”双杂合突变，则判断NEK1基因存在复合杂合突变，样本为患者；若位点存在“c.242A>T”或“c.1318C>T”单个杂合突变，则判断NEK1基因为单杂合突变，样本为携带者；若位点没有突变，则判断NEK1基因为野生型，样本是正常人。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述样本为血液/或羊水。
8.一种用于SRTD 6型基因诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求2～4任意一项所述诊断试剂。
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