CN116426630A - 导致Joubert综合征的致病基因、检测及应用 - Google Patents

导致Joubert综合征的致病基因、检测及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种导致Joubert综合征的致病基因、检测及应用。致病基因相比于野生型CPLANE1基因，在野生型CPLANE1基因的第一位点和第二位点发生复合杂合突变；其中，第一位点为CPLANE1基因的第37号外显子的第7570位碱基对应的位点，第二位点为CPLANE1基因的第46号外显子的第8708至8709位碱基对应的位点。本发明的致病基因突变可以作为诊断Joubert综合征的生物标志物。本发明可通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断Joubert综合征的遗传学诊断，以指导治疗。本发明所提供的检测试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断Joubert综合征。

Description

导致Joubert综合征的致病基因、检测及应用
技术领域
本发明涉及检测试剂领域，尤其涉及一种导致Joubert综合征的致病基因、检测及应用。
背景技术
Joubert综合征(Joubert syndrome，JS，OMIM 614615)是一种以小脑蚓部发育发育不全为特征的典型纤毛病，于1969年由Joubert首次报道，大多为常染色体隐性遗传，少数为X连锁，同时涉及多种器官系统，表型复杂，遗传异质性高。Joubert综合征中最突出的是中枢神经系统的发育缺陷，其特征是先天性小脑和脑干缺陷，典型影像学特征为头颅“臼齿征”，其他临床表现包括胎儿发育迟缓、多指/趾畸形等，常合并智力障碍，新生儿常表现为阵发性呼吸加快、肌张力减退、共济失调、眼部异常(眼球震颤、眼球运动异常、视网膜营养不良)、多囊肾、肝纤维化、面部畸形等多系统受累。Joubert综合征患者表型轻重不一，但总体来说预后不良，新生儿5年生存率约50％，致死原因多为喂养困难及呼吸道感染。JS发病率低，不同人群和种族中发病率存在一定差异，其发病率约为1/80000～1/100000。JS具有显著的遗传异质性，目前已经发现至少35个基因与JS有关，其中CPLANE1、CEP290、AHI1、TMEM67等是主要致病基因。JS主要为常染色体隐性遗传，仅在OFD1所致JS中表现为X-连锁隐性遗传。JS的致病基因大部分参与纤毛功能及相关信号途径调控，因此JS是纤毛相关疾病的典型代表。
CPLANE1基因(MIM 614571)定位于染色体5p13.2，包括53个外显子和52个内含子，基因长143.2kb，开放读码框9591bp，编码3197个氨基酸序列的planar polarity effectorcomplex subunit 1(CPLANE1)蛋白，CPLANE1蛋白含有2个跨膜结构域(transmembranedomains，TM)和2个卷曲螺旋结构域(coiled coil domains，CCD)，是一个跨膜蛋白。CPLANE1广泛的表达于包括脑在内的人体各种组织中，而在其他脊椎动物中也有CPLANE1同源蛋白的存在。CPLANE复合物参与外周IFT-A蛋白向基底体的募集，即CPLANE1蛋白可能参与了纤毛的转运功能或者与纤毛相关的信号传导途径。由此可见，CPLANE1基因及其编码的蛋白与纤毛的结构、功能密切相关。纤毛结构缺陷、功能障碍导致的疾病称为纤毛病，该类疾病常由基因突变引起。纤毛病会导致大范围的结构性出生缺陷，包括眼睛的缺陷(视网膜变性等)，颅面、大脑畸形，四肢多指趾畸形，肾囊肿，心脏缺陷和左右不对称发育等。CPLANE1又称C5orf42，是第17个被发现于JS致病基因，因此CPLANE1基因变异所致JS又称为JS 17型。
因此，基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊Joubert综合征的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，本发明首次发现CPLANE1一种新型复合复合杂合突变，可导致Joubert综合征，并据此研制相应的诊断试剂盒，助力Joubert综合征基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种导致Joubert综合征的致病基因、检测及应用，以解决Joubert综合征的筛查和诊断的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种导致Joubert综合征的致病基因，所述致病基因相比于野生型CPLANE1基因，在所述野生型CPLANE1基因的第一位点和/或第二位点发生突变；
其中，所述第一位点为所述野生型CPLANE1基因的第37号外显子的第7570位碱基对应的位点，所述第二位点为所述野生型CPLANE1基因的第46号外显子的第8708至8709位碱基对应的位点。
本申请还提供了一种由上述致病基因引发的Joubert综合征的检测试剂，所述检测试剂包括针对所述基因突变的位点设计的特异性扩增引物。
根据本申请的实施方式，所述特异性扩增引物包括CPLANE1-1F、CPLANE1-1R、CPLANE1-2F、CPLANE1-2R，所述CPLANE1-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CPLANE1-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CPLANE1-2F的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述CPLANE1-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本申请还提供了一种Joubert综合征的检测试剂盒，包括上述检测试剂。
根据本申请的实施方式，还包括PCR扩增反应的试剂，和/或DNA测序时所需的试剂和测序引物。
根据本申请的实施方式，所述测序引物包括CPLANE1-Seq1F、CPLANE1-Seq1R、CPLANE1-Seq2F和CPLANE1-Seq2R，所述CPLANE1-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CPLANE1-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述CPLANE1-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CPLANE1-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本申请还提供了上述检测试剂盒在Joubert综合征的检测方法中的应用。
根据本申请的实施方式，所述检测试剂的检测样本包括血液和/或羊水。
本次申请提出的导致Joubert综合征的致病基因，可以有效将Joubert综合征患者和正常人群区分开，因此，本发明的致病基因突变可以作为诊断Joubert综合征的生物标志物。本发明可通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断Joubert综合征的遗传学诊断，以指导治疗。本发明所提供的检测试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断Joubert综合征。本发明为Joubert综合征的发病机制研究奠定了重要基础，为Joubert综合征患者的治疗提供全新的理论依据。本发明可以为治疗Joubert综合征提供可能的药物靶点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1显示Joubert综合征1号家系遗传图谱；其中，
Figure BDA0004138188350000031
表示男性携带者，
Figure BDA0004138188350000032
表示女性携带者，■表示男性患者，◆表示患病胎儿，↗表示先证者；
图2显示利用Sanger测序检测CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23位点基因型的结果图，其中1号家系先证者、先证者母亲、胎儿为“c.7570delG杂合突变”，先证者父亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；
图3显示利用Sanger测序检测CPLANE1:NM_023073.4:exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点基因型的结果图，其中1号家系先证者、先证者父亲、胎儿为“c.8708_8709delAA杂合突变”，先证者母亲野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；
图4显示Joubert综合征2号家系遗传图谱；其中，
Figure BDA0004138188350000033
表示男性携带者，
Figure BDA0004138188350000034
表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者；
图5显示利用试剂盒检测2号家系CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23位点基因型的结果图，其中2号家系先证者、先证者母亲为“c.7570delG杂合突变”，先证者父亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；
图6显示利用试剂盒检测2号家系CPLANE1:NM_023073.4:exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点基因型的结果图，其中2号家系先证者、先证者父亲为“c.8708_8709delAA杂合突变”，先证者母亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。
在本发明中，术语“复合杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。
在本发明中，术语“复合复合杂合突变”是指是指等位基因均出现1处或以上的复合杂合突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。
文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。
术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增CPLANE1基因是指，在PCR反应中引物只扩增CPLANE1基因，而不扩增其他基因。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 1SECOND EDITION；New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的研究思路如下：首先利用外显子测序筛选与Joubert综合征高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，之后通过Sanger测序进行验证，最终获得Joubert综合征的致病基因突变，CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23和exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10。
本发明筛选的致病基因复合杂合突变中可以将Joubert综合征患者、携带者和正常人群区分开，因此，本发明的致病基因复合杂合突变可以作为诊断Joubert综合征的生物标志物。
该致病基因相比于野生型CPLANE1基因，在野生型CPLANE1基因的第一位点和/或第二位点发生突变。其中，所述第一位点为所述野生型CPLANE1基因的第37号外显子的第7570位碱基对应的位点，所述第二位点为所述野生型CPLANE1基因的第46号外显子的第8708至8709位碱基对应的位点。
在一些实施例中，第一位点可以表示为CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23，第二位点可以表示为exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10。
在所述野生型CPLANE1的第一位点和/或第二位点发生突变，包括三种情形：
1、仅在所述野生型CPLANE1的第一位点发生突变，如发生杂合突变。
2、仅在所述野生型CPLANE1的第二位点发生突变，如发生杂合突变。
3、在所述野生型CPLANE1的第一位点和第二位点均发生突变，该种突变方式为复合杂合突变。
具体地，本发明所述c.7570delG突变指野生型CPLANE1基因的第37号外显子的第7570位碱基G缺失，形成CPLANE1基因突变体，所述CPLANE1基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.11(ttggatacttcg)所示。本发明所述CPLANE1突变体蛋白与野生型CPLANE1基因编码的蛋白相比，第2524位氨基酸由天冬氨酸(D)突变为苏氨酸(T)，及发生移码突变，即所述CPLANE1突变体蛋白含有p.D2524Tfs*23的突变，所述突变是由于c.7570delG的错义突变引起的；所述CPLANE1突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12(DTSTFLLKCYKMIILQLDCISWPL*)所示。
本发明所述c.8708_8709delAA突变指野生型CPLANE1基因的第46号外显子的第8708至8709位碱基AA缺失，形成CPLANE1基因突变体，所述CPLANE1基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.13(aaagaacgaaaa)所示。本发明所述CPLANE1突变体蛋白与野生型CPLANE1基因编码的蛋白相比，第2903位由赖氨酸(K)突变为苏氨酸(T)，并发生移码突变，即所述CPLANE1突变体蛋白含有p.K2903Tfs*10的突变，所述突变是由于c.8708_8709delAA的移码突变引起的；所述CPLANE1突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14(RTKRKNGKVLK*)所示。
本申请还提供了一种由上述致病基因引发的Joubert综合征的检测试剂，所述检测试剂包括针对所述基因突变的位点设计的特异性扩增引物。
根据本申请的实施方式，所述特异性扩增引物包括CPLANE1-1F、CPLANE1-1R、CPLANE1-2F、CPLANE1-2R，所述CPLANE1-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CPLANE1-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CPLANE1-2F的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述CPLANE1-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
具体地，针对c.7570delG位点其PCR引物碱基序列为：
CPLANE1-1F:GGCTGGTCTCCAACTCC
CPLANE1-1R:CTCATCCTACTGCCACTTCT
针对c.8708_8709delAA位点其PCR引物碱基序列为：
CPLANE1-2F:GCCCAGCCCTGTATTAGAA
CPLANE1-2R:TGGTCACCCAATCACTCAA
本申请还提供了一种Joubert综合征的检测试剂盒，包括上述检测试剂。
根据本申请的实施方式，还包括PCR扩增反应的试剂，和/或DNA测序时所需的试剂和测序引物。
根据本申请的实施方式，所述测序引物包括CPLANE1-Seq1F、CPLANE1-Seq1R、CPLANE1-Seq2F和CPLANE1-Seq2R，所述CPLANE1-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CPLANE1-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述CPLANE1-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CPLANE1-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
具体地，针对c.7570delG位点，其测序引物碱基序列为：
CPLANE1-Seq1F:GCCTCCTAAAACACTTGG
CPLANE1-Seq1R:TGGGCAGAAATGTAGGTAG
针对c.8708_8709delAA位点，其测序引物碱基序列为：
CPLANE1-Seq2F:AAGAAGAAGGGAAAATCG
CPLANE1-Seq2R:CAGACTTACTGGATTGCTTCT
进一步，所述PCR扩增反应中的其他常规试剂包括但不限于dNTP，PCR缓冲液，镁离子，Tap聚合酶等。所述PCR缓冲液为10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)，15mmol/L MgCl2。
本申请还提供了上述检测试剂盒在Joubert综合征的检测方法中的应用。
根据本申请的实施方式，所述检测试剂的检测样本包括血液和/或羊水。
本发明还提供了检测CPLANE1基因是否存在基因突变的方法，所述方法包括如下步骤：
1)提取样本基因组DNA；
2)扩增CPLANE1基因序列；
3)DNA测序；
4)将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，如果发现CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23和exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点的基因型是“c.7570delG+c.8708_8709delAA”复合杂合突变，个体为患者；若位点存在单个杂合突变“c.7570delG杂合突变”或“c.8708_8709delAA杂合突变”，则个体为携带者；若位点的没有突变，则判断CPLANE1基因为野生型，个体是正常人。
本发明还提供了一种诊断Joubert综合征的方法，所述方法包括如下步骤：检测CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23和exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点的基因型，如果CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23和exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点的基因型是“c.7570delG+c.8708_8709delAA”复合杂合突变，则诊断受试个体为Joubert综合征。
本发明的优点：本发明通过外显子组测序技术首次发现了CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23和exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点复合杂合突变可以导致Joubert综合征发病。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断Joubert综合征的遗传学诊断，以指导治疗。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断Joubert综合征。另一方面，本发明为Joubert综合征的发病机制研究奠定了重要基础，为Joubert综合征患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗Joubert综合征提供可能的药物靶点。
实施例1样本获取
发明人发现了1个Joubert综合征家系(简称1号家系)，该家系部分成员的临床信息见表1。图1家系图谱，其中，
Figure BDA0004138188350000061
表示男性携带者，
Figure BDA0004138188350000062
表示女性携带者，■表示男性患者，◆表示患病胎儿，↗表示先证者。
1.诊断标准：
可参照《人类单基因遗传疾病》2010版。
Joubert综合征是一种发病早，目前已有孕期超声检查提示“臼齿征”的报道。JS主要临床表现为发育迟缓、肌张力低下、阵发性呼吸异常(呼吸暂停/过度呼吸)、眼球活动异常和共济失调，部分患者可并发肝肾损害、视觉损害、口-面-指/趾缺陷等。JS诊断标准：1)小脑蚓部发育不全致影像学提示“臼齿征”；2)肌张力降低；3)发育迟缓/智力低下；4)异常呼吸和/或异常眼球运动(非必要但具有提示意义)。
表1Joubert综合征1号家系成员的临床信息
Figure BDA0004138188350000071
如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
1号家系人员Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ1(先证者)外周血DNA和Ⅱ2(胎儿)羊水DNA用于测序分析。
实施例2外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2仪器设备一览表
Figure BDA0004138188350000072
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminator V3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。
3.试剂配方
5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
试剂 Tris 硼酸 EDTA(pH 8.0,0.5mol/L) ddH2O
体积/重量 5.4g 750mg 2mL 90mL
用ddH2O将最终体积调整为100mL。
0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释10倍即可。
10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
试剂 NH4Cl KHCO3 EDTA 加ddH2O
体积/重量 82.9g 10g 0.37g 至1000mL
高压灭菌，4℃保存。
1×细胞核裂解液按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
试剂 2M Tris-HCl，pH8.2 4M NaCl 2mM EDTA
体积/重量 0.5mL 10mL 0.4mL
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)和Ⅱ1(先证者)的外周血3-5mL以及Ⅱ2(胎儿)羊水DNA 5-10mL。
4.1样本DNA提取
1)将样本3-5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。
2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
参考人类全外显子测序试剂盒(Agilent)说明书和分子克隆实验室手册(第三版；Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 1SECOND EDITION；New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress，2014)操作指南。
1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；
2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；
3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；
4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到1个具有致病意义的基因复合杂合突变CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23和exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10；c.7570delG突变为第7570位碱基G缺失，导致第2524位氨基酸由天冬氨酸(D)突变为苏氨酸(T)，并造成了移码突变，在后面23位氨基酸后终止；c.8708_8709delAA突变是第8708至8709位碱基AA缺失，导致第2903位由赖氨酸(K)突变为苏氨酸(T)，并发生移码突变，在后面10位氨基酸后终止。在1号家系患者(先证者)CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23和exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点的基因型是“c.7570delG+c.8708_8709delAA”复合杂合突变；在1号家系携带者该位点的基因型为“c.7570delG”杂合突变或“c.8708_8709delAA”杂合突变。
实施例3Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23和exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点进行验证。分别对实施例1中的1号系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ1(先证者)和Ⅱ2(胎儿)等4名人员和100名家系外正常人进行CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23和exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1、DNA提取
按照实施例1的方法提基因组DNA。
2、候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。
2.2针对c.7570delG、c.8708_8709delAA位点分别设计16对和18对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况
表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
Figure BDA0004138188350000091
Figure BDA0004138188350000101
Figure BDA0004138188350000111
Figure BDA0004138188350000121
注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：
①引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；
②G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；
③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；
④引物内部不应出现互补序列；
⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；
⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
2.3候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。
表7引物检测PCR反应体系
Figure BDA0004138188350000122
Figure BDA0004138188350000131
反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10～15分钟。
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价：
1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；
2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中1号)作为突变家系检测用引物。
针对CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23位点的PCR引物序列如下所示：
5’-GGCTGGTCTCCAACTCC-3’(SEQ ID NO.1)
5’-CTCATCCTACTGCCACTTCT-3’(SEQ ID NO.2)
针对CPLANE1:NM_023073.4:exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点的引物序列如下所示：
5’-GCCCAGCCCTGTATTAGAA-3’(SEQ ID NO.3)
5’-TGGTCACCCAATCACTCAA-3’(SEQ ID NO.4)
3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8突变位点PCR反应体系
Figure BDA0004138188350000141
反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：
对于CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23位点反应程序如下：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→52℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
对于CPLANE1:NM_023073.4:exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点反应程序如下：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→55℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9BigDye反应体系
Figure BDA0004138188350000151
测序PCR循环条件：
第一步：96℃，1分钟；
第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc(pH5.2)；
2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；
3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；
4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，针对CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23位点的测序引物序列如下所示：
5’-GCCTCCTAAAACACTTGG-3’(SEQ ID NO.5)
5’-TGGGCAGAAATGTAGGTAG-3’(SEQ ID NO.6)
针对CPLANE1:NM_023073.4:exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点的测序引物序列如下所示：
5’-AAGAAGAAGGGAAAATCG-3’(SEQ ID NO.7)
5’-CAGACTTACTGGATTGCTTCT-3’(SEQ ID NO.8)
9、结果分析
图2的Sanger测序结果显示，1号家系3名人员CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23位点基因型是“c.7570delG杂合子”。图2测序图中箭头所指位置显示A、B和D层CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23位点基因型是“c.7570delG杂合子”突变；图2测序图中箭头所指位置显示C层个体基因型为野生型。
图3的Sanger测序结果显示，1号家系3名成员CPLANE1:NM_023073.4:exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点基因型是“c.7570delG杂合子”。图3测序图中箭头所指位置显示A、C和D层个体CPLANE1:NM_023073.4:exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点基因型是“c.8708_8709delAA杂合子”突变；图3测序图中箭头所指位置显示B层个体基因型为野生型。
综合上述检测结果，先证者和胎儿CPLANE1基因型为c.7570delG、c.8708_8709delAA复合杂合突变。根据以上检测结果，提示胎儿CPLANE1基因检测到c.7570delG和c.8708_8709delAA复合杂合突变，出生后会患与先证者相同基因型的Joubert综合征，建议终止妊娠。
实施例4CPLANE1基因c.7570delG、c.8708_8709delAA突变诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
1)扩增引物(每条引物1.2μg)：如实施例3所示
2)缓冲液(500μL的10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)，15mmol/L MgCl2)
3)Taq酶(20U)
4)dNTPs(四种dNTP各4mM)
5)CPLANE1:c.7570delG、c.8708_8709delAA阳性突变参考品DNA该参考品为一段双链DNA，c.7570delG阳性突变参考品DNA具体序列如下所示：
Figure BDA0004138188350000161
c.8708_8709delAA阳性突变参考品DNA具体序列如下所示：
Figure BDA0004138188350000162
其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。
6)测序引物：如实施例3所示
2、使用方法：
共筛查和检测11个小脑异常疾病的家系中35位个体，并再次发现如下家系，并将本试剂盒应用于2号家系患者检测(见表10)。
表10Joubert综合征2号家系成员的临床信息
Figure BDA0004138188350000171
如图4所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
2号家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)和Ⅱ1(先证者)外周血DNA用于试剂盒检测。
1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。
2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应，如实施例3；
3)对PCR扩增产物进行纯化；
4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；
5)对BiyDye反应产物纯化；
6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
图5的试剂盒检测结果显示，2号家系母亲和先证者CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23位点基因型是“c.7570delG杂合子”。图5测序图中箭头所指位置显示A和C层CPLANE1:NM_023073.4:exon37:c.7570delG:p.D2524Tfs*23位点基因型是“c.7570delG杂合子”突变；图5测序图中箭头所指位置显示B层个体基因型为野生型。图6的试剂盒检测结果显示，2号家系父亲和先证者CPLANE1:NM_023073.4:exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点基因型是“c.8708_8709delAA杂合子”。图6测序图中箭头所指位置显示A和B层CPLANE1:NM_023073.4:exon46:c.8708_8709delAA:p.K2903Tfs*10位点基因型是“c.8708_8709delAA杂合子”突变；图6测序图中箭头所指位置显示C层个体基因型为野生型。检测结果确认先证者为Joubert综合征患者，其母亲和父亲为突变基因携带者；遗传咨询意见为该夫妻再生育Joubert综合征患者的几率是1/4，生育携带者后代的几率是1/2，生育完成正常个体的几率是1/4，建议夫妻计划再生育时行胚胎植入前遗传学诊断以及妊娠后来医院行产前诊断。
由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的CPLANE1基因突变体，且确认了新突变体与Joubert综合征的发病密切相关，所述致病突变体可用于Joubert综合征的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。
本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。

Claims (8)

1.一种导致Joubert综合征的致病基因，其特征在于，所述致病基因相比于野生型CPLANE1基因，在所述野生型CPLANE1基因的第一位点和/或第二位点发生突变；
其中，所述第一位点为所述野生型CPLANE1基因的第37号外显子的第7570位碱基对应的位点，所述第二位点为所述野生型CPLANE1基因的第46号外显子的第8708至8709位碱基对应的位点。
2.一种由权利要求1所述致病基因引发的Joubert综合征的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括针对所述基因突变的位点设计的特异性扩增引物。
3.根据权利要求2所述检测试剂，其特征在于，所述特异性扩增引物包括CPLANE1-1F、CPLANE1-1R、CPLANE1-2F、CPLANE1-2R，所述CPLANE1-1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述CPLANE1-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CPLANE1-2F的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述CPLANE1-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种Joubert综合征的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3的所述检测试剂。
5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增反应的试剂，和/或DNA测序时所需的试剂和测序引物。
6.根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，所述测序引物包括CPLANE1-Seq1F、CPLANE1-Seq1R、CPLANE1-Seq2F和CPLANE1-Seq2R，所述CPLANE1-Seq1F的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，所述CPLANE1-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述CPLANE1-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CPLANE1-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
7.权利要求2或3所述检测试剂或权利要求4～6任一项所述检测试剂盒在Joubert综合征的检测方法中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述检测试剂的检测样本包括血液和/或羊水。
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