CN116004804A

CN116004804A - 一种导致mcph3型小头畸形的致病基因复合杂合突变的应用及检测试剂和应用

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Publication number: CN116004804A
Application number: CN202211614132.4A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 熊亚; 吴伟娟; 廖乙山
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-12-15
Filing date: 2022-12-15
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明提供了一种导致MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2复合杂合突变的应用及检测试剂和应用，属于医学诊断技术领域。本发明首次发现了CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*和CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点复合杂合突变可以导致MCPH3型小头畸形(MIM 604804)。本发明检测所述基因突变位点的试剂用于MCPH3型小头畸形的遗传学诊断和优生优育指导，为MCPH3型小头畸形的发病机制研究提供了新的基础和途径，为MCPH3型小头畸形的治疗提供新的理论依据，可以为治疗MCPH3型小头畸形提供可能的药物靶点。

Description

一种导致MCPH3型小头畸形的致病基因复合杂合突变的应用及检测试剂和应用

技术领域

本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及一种导致MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2复合杂合突变的应用及检测试剂和应用。

背景技术

原发性小头畸形(congenital microcephaly)又称为真性小头畸形或常染色体隐形遗传小头畸形(autosomal recessive primary microcephaly，MCPH)，是一种神经系统发育障碍疾病，其主要临床特征是头围减小伴随一定程度非进行性智力退化。

临床特征：大脑的发育包括胎儿阶段及出生后阶段，MCPH主要影响胎儿阶段大脑的发育，早在孕24周左右即可应用超声波技术、核磁共振扫描发现患儿头围测值及脑容量低于正常同龄胎儿。尽管相比于头颅MRI及CT等客观标准，头围测量难以准确地反映脑容量的大小，但由于其方法简单易行，出生后头围测量仍是诊断小头畸形最常用的方式之一。临床上常用小于正常同龄儿头围3个标准差作为诊断小头畸形的标准。使用头围测量值作为诊断小头畸形标准时应当注意年龄、性别和种族等相关因素的修正。临床还以中-轻度的智力退化作为重要的辅助诊断依据。散在报道中存在头围小于正常值3个标准差而智力正常的个体，而小于正常值4个标准差并智力正常的个体十分罕见。小头畸形分为原发性和继发性，该分类的重要标志是原发性小头畸形出生后其智力退化及脑容量不足水平相对静止，继发性小头畸形往往出现进行性脑退化。原发性小头畸形则包扩非遗传类原发性小头畸形和遗传类小头畸形(MCPH)，非遗传类原发性小头畸形的病因有先天性弓形虫感染及母体妊娠阶段酒精摄入过量等。MCPH是排除了继发因素及非遗传性小头畸形，由基因突变导致的一类常染色体隐性遗传疾病。迄今为止已有多个MCPH相关基因位点被陆续发现，如CDK5RAP2、CEP152、microcephalin、WDR62、ASPM、CNPJ、STIL等。其中CDK5RAP2基因(MIM608201)突变可导致常染色体隐性遗传的原发性小头畸形3型(MCPH3)，特征是出生时就存在枕额围(OFC)减少，并与智力低下和语言发育迟缓有关，其他特征可能包括身材矮小或轻度癫痫发作。

CDK5RAP2基因(2(cyclin dependant kinase 5regulatory associatedprotein2，MIM 608201)定位于染色体9q33.2，包括38个外显子和37个内含子，基因长191.3kb，开放读码框5682bp，编码1893个氨基酸序列的蛋白CDK5RAP2。CDK5RAP2蛋白的N端存在一个与γ微管蛋白环形复合体(γTuRC)反应位点，C端存在着与细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1的反应位点，中间存在一些螺旋结构。CDK5RAP2蛋白与中心体功能相关，携带此基因的mRNA人类及哺乳动物细胞中广泛存在，在神经系统中含量最高。CDK5RAP2蛋白在海拉细胞周期中被定位在中心体周围，其N端反应位点在γ微管蛋白环形复合体与中心体的结合过程中发挥作用。基因突变导致CDK5RAP2蛋白功能异常，进一步导致γ微管蛋白无法定位在中心体上，抑制了微管成核，从而形成细胞纺锤丝紊乱、星状体缺如，染色体分离障碍及纺锤体检测点蛋白减少，在大脑中从而抑制神经细胞的自我更新及增殖能力，致使神经祖细胞在增殖过程中出现有丝分裂异常，从而影响了大脑发育，降低了脑容量。

因此，基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊小头畸形的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术以提前实现疾病诊断。然而目前临床上用于诊断小头畸形的基因突变的种类十分有限，目前还没有针对MCPH3型小头畸形的致病基因的突变位点的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种导致MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2复合杂合突变的应用，开发一种新型的致病基因复合杂合突变可以作为诊断MCPH3型小头畸形的生物标志物，区分MCPH3型小头畸形患者、携带者和正常人群。

本发明的目的还在于提供一种检测导致MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2复合杂合突变的试剂和应用，助力MCPH3型小头畸形基因突变的筛查和诊断。

本发明提供了一种基因CDK5RAP2复合杂合突变位点在制备MCPH3型小头畸形诊断试剂或制备防治MCPH3型小头畸形的药物中的应用，所述致病基因CDK5RAP2复合杂合突变位点为CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*和CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7。

本发明提供了一种用于检测MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2复合杂合突变位点的试剂，包括检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.778C>T的引物和检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.3315delC的引物；

所述检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.778C>T的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的CDK5RAP2-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDK5RAP2-1R；

所述检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.3315delC的引物包括核苷酸序列如SEQID NO:3所示的CDK5RAP2-2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDK5RAP2-2R。

优选的，还包括测序引物；

所述测序引物包括致病基因CDK5RAP2突变位点c.778C>T的测序引物和/或致病基因CDK5RAP2突变位点c.3315delC的测序引物；

所述致病基因CDK5RAP2突变位点c.778C>T的测序引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示的CDK5RAP2-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDK5RAP2-Seq1R；

所述致病基因CDK5RAP2突变位点c.3315delC的测序引物包括括核苷酸序列如SEQID NO:7所示的CDK5RAP2-Seq2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的CDK5RAP2-Seq2R。

本发明提供了一种MCPH3型小头畸形诊断试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。

优选的，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶；

所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/L MgCl₂。

本发明提供了所述试剂在制备检测MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2突变位点的试剂盒中的应用。

本发明提供了一种检测致病基因CDK5RAP2复合杂合突变位点的引物在制备辅助诊断MCPH3型小头畸形的试剂盒中的应用，所述致病基因CDK5RAP2复合杂合突变位点为CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*和CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7。

优选的，所述引物为上述方案所述试剂。

优选的，所述辅助诊断MCPH3型小头畸形的方法，包括以下步骤：用所述试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有MCPH3型小头畸形的风险：

当检测基因型是“c.778C>T杂合子+c.3315delC杂合子”，则判断CDK5RAP2基因存在复合杂合突变，个体为患者；

若检测基因型为单个杂合突变“c.778C>T杂合突变”或“c.3315delC杂合突变”，则个体为携带者；

若检测突变位点没有发生突变，则判断CDK5RAP2基因为野生型，个体是正常人。

优选的，所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。

本发明提供了一种基因CDK5RAP2复合杂合突变位点在制备MCPH3型小头畸形诊断试剂或制备防治MCPH3型小头畸形的药物中的应用，所述致病基因CDK5RAP2复合杂合突变位点为CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*CDK5RAP2:NM_018136.5:exon18:c.3315delC:p.R2230Kfs*6。本发明通过外显子组测序技术首次发现了CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*和exon18:c.6684_6685 delAA:p.R2230Kfs*6位点复合杂合突变可以导致MCPH3型小头畸形发病。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断MCPH3型小头畸形的遗传学诊断，以指导治疗。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断MCPH3型小头畸形。另一方面，本发明为MCPH3型小头畸形的发病机制研究奠定了重要基础，为MCPH3型小头畸形患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗MCPH3型小头畸形提供可能的药物靶点。

本发明还提供了一种用于检测MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2突变位点的试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。通过优化检测致病基因CDK5RAP2突变位点的引物和反应体系，大大提高检测结果的准确性和可靠性，极大助力MCPH3型小头畸形基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

附图说明

图1显示MCPH3型小头畸形1号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，

表示女性携带者，表示流产胎儿，■表示男性患者，

表示先证者。

图2显示利用Sanger测序检测CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*位点基因型的结果图，其中1号家系先证者、先证者母亲为“c.778C>T杂合突变”，先证者父亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

图3显示利用Sanger测序检测CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点基因型的结果图，其中1号家系先证者、先证者父亲为“c.3315delC杂合突变”，先证者母亲野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

图4显示MCPH3型小头畸形2号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，

表示女性携带者，●表示女性患者，

表示先证者。

图5显示利用试剂盒检测2号家系CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*位点基因型的结果图，其中2号家系先证者、先证者父亲为“c.778C>T杂合突变”，先证者母亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

图6显示利用试剂盒检测2号家系CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点基因型的结果图，其中2号家系先证者、先证者母亲为“c.3315delC杂合突变”，先证者父亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

具体实施方式

在本发明中，首先利用外显子测序筛选与MCPH3型小头畸形高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，之后通过Sanger测序进行验证，最终获得MCPH3型小头畸形的致病基因复合杂合突变，具体为CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*和CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7。所述致病基因复合杂合突变可以作为诊断MCPH3型小头畸形的生物标志物，将MCPH3型小头畸形患者、携带者和正常人群区分开。其中CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*突变指野生型CDK5RAP2基因(NM_018249.6)的第8号外显子的第778位碱基由C突变为T，形成CDK5RAP2基因突变体，所述CDK5RAP2基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：9(AGCTCTGAGGA，加粗下划线字母为突变发生位置)所示。本发明所述CDK5RAP2突变体蛋白与野生型CDK5RAP2基因编码的蛋白相比，第260位氨基酸由精氨酸(R)突变为终止密码子(*)，及发生无义突变，即所述CDK5RAP2突变体蛋白含有p.R260*的突变，所述突变是由于c.778C>T的移码突变引起的；所述CDK5RAP2突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10(VSSGEL*)所示。所述CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7突变指野生型CDK5RAP2基因的第24号外显子的第3315位碱基C的缺失，形成CDK5RAP2基因突变体，所述CDK5RAP2基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：11(TAATAC□TCAAAT，方框为缺失突变发生位置)所示。本发明所述CDK5RAP2突变体蛋白与野生型CDK5RAP2基因编码的蛋白相比，第2230位氨基酸由丝氨酸(S)发生谷氨酰胺(Q)，并发生移码突变，在后面6位氨基酸后终止，即所述CDK5RAP2突变体蛋白含有p.S1106Qfs*7的突变，所述突变是由于c.3315delC的移码突变引起的；所述CDK5RAP2突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：12(TQMRQNT*，加粗斜体字母为移码后的氨基酸序列，下划线字母为第一个移码氨基酸)所示。

在本发明中，根据CDK5RAP2两个突变位点的上下游序列设计特异性扩增引物或者特异性检测探针来制备诊断试剂。

本发明提供了一种用于检测MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2复合杂合突变位点的试剂，包括检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.778C>T的引物和检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.3315delC的引物；所述检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.778C>T的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(GGTTTTGTTTGCTTAGGTT)所示的CDK5RAP2-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2(AGCCCGATACGAGTTAGT)所示的CDK5RAP2-1R；所述检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.3315delC的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3(GCAGTGGTCTTGGCTTGG)所示的CDK5RAP2-2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:4(ACGGCAGAGGTGGAACG)所示的CDK5RAP2-2R。

在本发明中，所述试剂优选还包括测序引物。所述测序引物包括致病基因CDK5RAP2突变位点c.778C>T的测序引物和/或致病基因CDK5RAP2突变位点c.3315delC的测序引物。所述致病基因CDK5RAP2突变位点c.778C>T的测序引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:5(GGACCGTTGAAGGTATTT)所示的CDK5RAP2-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:6(AGTCCCCAGGTAACAACA)所示的CDK5RAP2-Seq1R；所述致病基因CDK5RAP2突变位点c.3315delC的测序引物包括括核苷酸序列如SEQ ID NO:7(ATTTGCCCACCTGATGA)所示的CDK5RAP2-Seq2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:8(CACCCTGCTGTCAATCAT)所示的CDK5RAP2-Seq2R。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法即可。

在本发明中，所述PCR扩增试剂优选包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶。所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/LKCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl₂。

在本发明中，所述检测MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2突变位点的方法，优选包括以下步骤：

提取待检样本基因组DNA；

以基因组DNA为模板，用上述方案中所述试剂扩增CDK5RAP2基因序列；

将CDK5RAP2基因的扩增产物进行DNA测序；

将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，结果完全一致时说明待检样本中CDK5RAP2基因未发生突变为野生型，当比对结果出现染色体中一个等位基因存在CDK5RAP2基因(NM_018249.6)第8号外显子778位碱基由C突变为T，另外一个等位基因不突变，则该突变位点的基因型为“c.778C>T杂合突变”，同样的，染色体上一个等位基因存在第24号外显子3315位缺失C，另外一个等位基因不发生突变，则该突变位点的基因型为“c.3315delC杂合突变”。

在本发明中，所述扩增CDK5RAP2基因序列的反应体系优选为10×PCR缓冲液2.0μL、10mmol/LdNTPs 0.4μL、100ng/μL CDK5RAP2-1F(或CDK5RAP2-2F)0.5μL、100ng/μLCDK5RAP2-1R(或CDK5RAP2-2R)0.5μL、100ng/μL抽提DNA 1.0μL、5U/μL Taq酶0.2μL、ddH₂O15.4μL。对于CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*突变位点的PCR扩增反应程序优选如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→49℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃保温。对于CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7突变位点反应程序如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→52℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃保温。

在本发明中，基于所述致病基因CDK5RAP2突变位点上下游序列设计特异性引物，采用所述引物扩增含所述突变位点的DNA片段，通过DNA片段的基因型判断是否有患MCPH3型小头畸形的风险。在本发明实施例中，所述引物优选为上述方案所述试剂。

在本发明中，所述辅助诊断MCPH3型小头畸形的方法，优选包括以下步骤：用所述试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有MCPH3型小头畸形的风险：当检测基因型是“c.778C>T杂合子+c.3315delC杂合子”，则判断CDK5RAP2基因存在复合杂合突变，个体为患者；若检测基因型为单个杂合突变“c.778C>T杂合突变”或“c.3315delC杂合突变”，则个体为携带者；若检测突变位点没有发生突变，则判断CDK5RAP2基因为野生型，个体是正常人。

在本发明中，所述样本优选为血液、羊水和活检组织中的至少一种。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。

文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。

在本发明中，术语“杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。

在本发明中，术语“复合杂合突变”是指是指等位基因均出现1处或以上的杂合突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。

文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。

在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，

术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增CDK5RAP2基因是指，在PCR反应中引物只扩增CDK5RAP2基因，而不扩增其他基因。

下面结合实施例对本发明提供的一种导致MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2复合杂合突变的应用及检测试剂和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 1SECOND EDITION；NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

样本获取

发明人发现了1个MCPH3型小头畸形家系(简称1号家系)，该家系部分成员的临床信息见表1。图1家系图谱，其中，

表示男性携带者，

表示女性携带者，

表示流产胎儿，■表示男性患者，

表示先证者。

1.诊断标准：

可参照《人类单基因遗传疾病》2010版：

MCPH诊断标准为：

1)MCPH为先天性疾病，出生时头围测量小于正常同龄儿4个标准差；

2)非进行性智力退化，一般不伴有其他的神经异常症状，如癫痫、持续痉挛等，若出现神经异常症状，则不能作为排除标准；

3)体重、身高、外貌基本正常，基因组检查及大脑结构无异常，但对于MCPH1变异个体，常存在身高发育不足、室周神经元细胞异位。

表1 MCPH3型小头畸形1号家系成员的临床信息

如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

1号家系人员Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ2(先证者)外周血DNA用于测序分析。

实施例2

外显子测序

1.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备一览表

2.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。

3.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	Tris	硼酸	EDTA(pH 8.0,0.5mol/L)	<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>
					体积/重量	5.4g	750mg	2mL	90mL

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。

0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

试剂	<![CDATA[NH<sub>4</sub>Cl]]>	<![CDATA[KHCO<sub>3</sub>]]>	EDTA	<![CDATA[加ddH<sub>2</sub>O]]>
					体积/重量	82.9g	10g	0.37g	至1000mL

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	2M Tris-HCl，pH8.2	4M NaCl	2mM EDTA
				体积/重量	0.5mL	10mL	0.4mL

4.实验步骤

签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ2(先证者)等成员的外周血3-5mL。

4.1样本DNA提取

1)将样本3-5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。

2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1 v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

4.2外显子测序

参考人类全外显子测序试剂盒(Agilent)说明书和分子克隆实验室手册(第三版；Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 1 SECOND EDITION；New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress，2014)操作指南。

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

4.3结果

最终得到1个具有致病意义的基因复合杂合突变CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*和exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7；c.778C>T突变为第778位碱基C突变为T，造成了无义突变，导致第260位氨基酸由精氨酸(R)突变为终止密码子(*)；c.3315delC突变是第3315位碱基C缺失，导致发生移码突变，第1106位氨基酸发生由丝氨酸(S)突变为谷氨酰胺(Q)。在1号家系患者(先证者)CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*和exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点的基因型是“c.778C>T杂合子+c.3315delC杂合子”复合杂合突变；在1号家系携带者该位点的基因型为“c.778C>T”杂合突变或“c.3315delC”杂合突变。

实施例3

Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*和exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点进行验证。分别对实施例1中的1号系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ2(先证者)等3名人员和100名家系外正常人进行CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*和exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1的方法提基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。

2.2针对c.778C>T、c.3315delC位点分别设计17对和16对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况

表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：

①引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；

②G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；

③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；

④引物内部不应出现互补序列；

⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；

⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5分钟；

第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。

第三步：72℃，7分钟；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10～15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中1号)作为突变家系检测用引物。

针对CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*位点的PCR引物序列如下所示：

5’-GGTTTTGTTTGCTTAGGTT-3’(SEQ ID NO：1)

5’-AGCCCGATACGAGTTAGT-3’(SEQ ID NO：2)

针对CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点的引物序列如下所示：

5’-GCAGTGGTCTTGGCTTGG-3’(SEQ ID NO：3)

5’-ACGGCAGAGGTGGAACG-3’(SEQ ID NO：4)

其他候选引物因为存在引发发夹结构、或引物二聚体、或非特异性结合扩增，导致PCR效果较差，故舍弃。

3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变位点PCR反应体系

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

对于CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*位点反应程序如下：

第一步：95℃，5分钟；

第二步：30个循环(95℃，30秒→49℃，30秒→72℃，60秒)；

第三步：72℃，7分钟；

第四步：4℃直至取样时。

对于CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点反应程序如下：

第一步：95℃，5分钟；

第二步：30个循环(95℃，30秒→56℃，30秒→72℃，60秒)；

第三步：72℃，7分钟；

第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。

6、BigDye反应，BigDye反应体系见表9。

表9BigDye反应体系

测序PCR循环条件：

第一步：96℃，1分钟；

第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；

第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；

3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；

4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，针对CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*位点的测序引物序列如下所示：

5’-GGACCGTTGAAGGTATTT-3’(SEQ ID NO:5)

5’-AGTCCCCAGGTAACAACA-3’(SEQ ID NO:6)

针对CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点的测序引物序列如下所示：

5’-ATTTGCCCACCTGATGA-3’(SEQ ID NO:7)

5’-CACCCTGCTGTCAATCAT-3’(SEQ ID NO:8)

9、结果分析

图2的Sanger测序结果显示，1号家系2名人员CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*位点基因型是“c.778C>T杂合子”。图2测序图中箭头所指位置显示A和C层CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*位点基因型是“c.778C>T杂合子”突变；图2测序图中箭头所指位置显示B层个体基因型为野生型。

图3的Sanger测序结果显示，1号家系2名成员CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点基因型是“c.778C>T杂合子”。图3测序图中箭头所指位置显示A和B层个体CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点基因型是“c.3315delC杂合子”突变；图3测序图中箭头所指位置显示C层个体基因型为野生型。

综合上述检测结果，先证者CDK5RAP2基因型为c.778C>T、c.3315delC复合杂合突变。

实施例4CDK5RAP2基因c.778C>T、c.3315delC突变诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

1)扩增引物(每条引物1.2μg)：如实施例3所示

2)缓冲液(500μL的10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)，15mmol/LMgCl2)

3)Taq酶(20U)

4)dNTPs(四种dNTP各4mM)

5)CDK5RAP2:c.778C>T、c.3315delC阳性突变参考品DNA该参考品为一段双链DNA，c.778C>T阳性突变参考品DNA具体序列如下所示：

c.3315delC阳性突变参考品DNA具体序列如下所示：

其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。

6)测序引物：如实施例3所示

2、使用方法：

共筛查和检测28个脑部发育异常的家系中94位个体，并再次发现契合本发明的家系，并以2号家系实施为例阐述该检测试剂盒的应用(2号家系患者情况见表10)。

表10MCPH3型小头畸形2号家系成员的临床信息

如图4所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

2号家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)和Ⅱ1(先证者)外周血DNA用于试剂盒检测。

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应，如实施例3；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

图5的试剂盒检测结果显示，2号家系父亲和先证者CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*位点基因型是“c.778C>T杂合子”。图5测序图中箭头所指位置显示A和C层CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*位点基因型是“c.778C>T杂合子”突变；图5测序图中箭头所指位置显示B层个体基因型为野生型。图6的试剂盒检测结果显示，2号家系母亲和先证者CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点基因型是“c.3315delC杂合子”。图6测序图中箭头所指位置显示B和C层CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7位点基因型是“c.3315delC杂合子”突变；图6测序图中箭头所指位置显示A层个体基因型为野生型。检测结果确认先证者为MCPH3型小头畸形患者，其母亲和父亲为突变基因携带者；遗传咨询意见为该夫妻再生育MCPH3型小头畸形患者的几率是1/4，生育携带者后代的几率是1/2，生育完成正常个体的几率是1/4，建议夫妻计划再生育时行胚胎植入前遗传学诊断以及妊娠后来医院行产前诊断。

由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的CDK5RAP2基因突变体，且确认了新突变体与MCPH3型小头畸形的发病密切相关，所述致病突变体可用于MCPH3型小头畸形的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种基因CDK5RAP2复合杂合突变位点在制备MCPH3型小头畸形诊断试剂或制备防治MCPH3型小头畸形的药物中的应用，所述致病基因CDK5RAP2复合杂合突变位点为CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*和CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7。

2.一种用于检测MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2复合杂合突变位点的试剂，其特征在于，包括检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.778C>T的引物和检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.3315delC的引物；

所述检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.778C>T的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDK5RAP2-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDK5RAP2-1R；

所述检测致病基因CDK5RAP2突变位点c.3315delC的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示的CDK5RAP2-2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDK5RAP2-2R。

3.根据权利要求2所述试剂，其特征在于，还包括测序引物；

所述致病基因CDK5RAP2突变位点c.778C>T的测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDK5RAP2-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDK5RAP2-Seq1R；

所述致病基因CDK5RAP2突变位点c.3315delC的测序引物包括括核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示的CDK5RAP2-Seq2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的CDK5RAP2-Seq2R。

4.一种MCPH3型小头畸形诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述试剂和PCR扩增试剂。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶；

所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl₂。

6.权利要求2或3所述试剂在制备检测MCPH3型小头畸形的致病基因CDK5RAP2突变位点的试剂盒中的应用。

7.一种检测致病基因CDK5RAP2复合杂合突变位点的引物在制备辅助诊断MCPH3型小头畸形的试剂盒中的应用，所述致病基因CDK5RAP2复合杂合突变位点为CDK5RAP2:NM_018249.6:exon8:c.778C>T:p.R260*和CDK5RAP2:NM_018249.6:exon24:c.3315delC:p.S1106Qfs*7。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述引物为权利要求2或3所述试剂。

9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述辅助诊断MCPH3型小头畸形的方法，包括以下步骤：用所述试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有MCPH3型小头畸形的风险：

10.根据权利要求7～9任意一项所述的应用，其特征在于，所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。