CN117106886A - 一种导致脑桥小脑发育不良的致病基因cask突变的应用及检测试剂和应用 - Google Patents

一种导致脑桥小脑发育不良的致病基因cask突变的应用及检测试剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变的应用及检测试剂和应用，属于基因诊断技术领域。本发明通过外显子组测序技术首次发现了CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点突变可以导致脑桥小脑发育不良(MIM306700)。本发明检测所述基因突变位点的试剂用于筛查或诊断脑桥小脑发育不良致病基因突变患者，以指导患者治疗和帮助优生优育，为脑桥小脑发育不良的发病机制研究提供了新的基础和途径，为脑桥小脑发育不良的治疗提供新的理论依据，可以为治疗脑桥小脑发育不良提供可能的药物靶点。

Description

一种导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变的应用及检 测试剂和应用
技术领域
本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变的应用及检测试剂和应用。
背景技术
智力障碍、小头畸形伴脑桥小脑发育不良(mental retardation andmicrocephaly with pontine and cerebellar hypoplasia，MICPCH，OMIM 300749)是一种罕见X连锁显性遗传病，女性杂合子发病多见，男性半合子表型更为严重。CASK基因变异造成蛋白的功能丧失是其致病机制。
MICPCH的核心特征为较为严重的智力障碍、小头畸形和不同程度的脑桥小脑发育不良，部分存在四肢肌张力增高及躯干肌张力减低，眼部异常、癫痫发作、感觉神经性耳聋、睡眠障碍、面容异常等。MICPCH患者出生时头围多正常，出生后出现进行性小头畸形，CASK基因变异导致的MICPCH患者头颅MRI可看到小脑呈“蝴蝶状”，这是由于小脑半球和蚓部弥漫性发育不良造成的，且胼胝体发育大多正常。癫痫起病年龄为生后第1天至生后4个月，癫痫发作类型以痉挛发作、肌阵挛发作及强直发作为主要表现，癫痫表型多为大田原综合征、婴儿痉挛症、早发肌阵挛性脑病。
CASK基因(NM_001367721.1)定位于染色体Xp11.4，基因全长408.6kb，包含27个外显子和26个内含子，编码926个氨基酸组成的CASK蛋白，为钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶蛋白，属于膜相关的鸟苷激酶(membrane associated guanylate kinase，MAGUK)家族，在中枢神经系统高度表达，具有参与大脑发育、突触功能、转录调控及细胞骨架形成等重要功能。目前已报道一百多种CASK基因变异，CASK基因变异类型包括无义变异、错义变异、移码变异、剪切变异、小片段插入缺失、大片段结构性变异，无明显热点突变区域。基因突变是导致脑桥小脑发育不良发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊脑桥小脑发育不良的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。然而目前临床上用于诊断脑桥小脑发育不良的基因突变的种类十分有限，例如目前仅有报道公开基因检测用于脑桥小脑发育不良的早期诊断，具体为通过基因检测CASK基因发现存在新发杂合无义突变，为c.3106(外显子12)C>T，导致蛋白质改变为p.(Arg1036*)。丰富诊断脑桥小脑发育不良的基因突变位点为全面高效准确筛查患脑桥小脑发育不良的人群，为指导优生有十分重要意义。
现有技术中对基因突变位点基因型的检测方法，可以采用限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等方法完成，但这些检测方法均不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的目的，所以需要针对特异突变位点的特异性扩增引物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变的应用，丰富基因诊断脑桥小脑发育不良的突变位点的同时还能作为靶点为药物筛选、药效评价及靶向治疗提供基础。
本发明的目的还在于提供一种检测导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变位点的试剂，助力脑桥小脑发育不良基因突变的筛查和诊断。
本发明提供了一种基因CASK突变位点在制备脑桥小脑发育不良诊断试剂或制备防治脑桥小脑发育不良的药物中的应用，所述致病基因CASK突变位点为CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2。
本发明提供了一种用于检测导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变位点的试剂，包括检测CASK基因突变位点c.202delA的引物；
所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CASK-F和核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的CASK-R。
优选的，所述试剂还包括测序引物；
所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CASK-SeqF和核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示的CASK-SeqR。
本发明提供了一种脑桥小脑发育不良诊断试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。
优选的，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶；
所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2。
本发明提供了所述试剂在制备检测导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变位点的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种检测基因CASK突变位点的引物在制备脑桥小脑发育不良辅助诊断试剂盒中的应用，所述基因CASK突变位点为CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2。
优选的，所述引物为所述试剂。
优选的，利用所述试剂盒辅助诊断脑桥小脑发育不良的方法，包括以下步骤：
用所述试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有脑桥小脑发育不良的风险；
若检测基因型是“c.202delA杂合子突变”，则为患者；
若检测基因型是“野生型”，则个体为正常人。
优选的，所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
本发明提供了一种基因CASK突变位点在制备脑桥小脑发育不良诊断试剂或制备防治脑桥小脑发育不良的药物中的应用，所述致病基因CASK突变位点为CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2。本发明通过外显子组测序技术首次发现了CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点突变可以导致脑桥小脑发育不良发病。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断脑桥小脑发育不良致病基因突变患者，以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面，本发明为脑桥小脑发育不良的发病机制研究奠定了重要基础，为脑桥小脑发育不良患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗脑桥小脑发育不良提供可能的药物靶点。
本发明所提供的脑桥小脑发育不良诊断试剂盒，通过优化检测致病基因CASK突变位点的引物和反应体系，大大提高检测结果的准确性和可靠性，可用于快速、有效地预测或诊断脑桥小脑发育不良，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
附图说明
图1显示脑桥小脑发育不良1号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，表示流产胎儿，●表示女性患者，↗表示先证者；
图2显示利用Sanger测序检测1号家系CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点基因型的结果图，其中，A层：1号家系中杂合子突变者；B和C层：1号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；
图3显示脑桥小脑发育不良2号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者，↗表示先证者；
图4显示利用Sanger测序检测2号家系CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2:p.G121S位点基因型的结果图，其中，D层：2号家系中半合子突变者；A、B和C层：2号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
具体实施方式
本发明提供了一种基因CASK突变位点在制备脑桥小脑发育不良诊断试剂或制备防治脑桥小脑发育不良的药物中的应用，所述致病基因CASK突变位点为CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2。
本发明首先利用外显子测序筛选与脑桥小脑发育不良高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，之后通过Sanger测序进行验证，最终获得脑桥小脑发育不良的致病基因突变，CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2。所述致病基因突变位点可以将脑桥小脑发育不良患者和正常人群区分开，因此，本发明的致病基因突变可以作为诊断脑桥小脑发育不良的生物标志物。所述基因CASK突变位点c.202delA指野生型CASK基因的第3号外显子的第202位碱基A缺失，形成CASK基因突变体，所述CASK基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5(TGTCAT□TGCTGA)所示(方框为碱基A缺失突变发生位置)。本发明所述CASK突变体蛋白与野生型CASK基因编码的蛋白相比，第68位氨基酸由甲硫氨酸(M)突变为半胱氨酸(C)，即所述CASK突变体蛋白含有p.M68Cfs*1的突变，所述突变是由于c.202delA的移码突变引起的；所述CASK突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6(ASICHC*)所示(加粗下划线字母为移码突变第一个氨基酸位置)。
在本发明中，根据基因CASK突变位点的上下游引物设计特异性扩增引物或者特异性检测探针来制备诊断试剂。
本发明提供了一种用于检测导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变位点的试剂，包括检测CASK基因突变位点c.202delA的引物；所述引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:1(ATTACAGGTGCGAGCCA)所示的CASK-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2(TGCTTCCTTTGCCACTG)所示的CASK-R。
在本发明中，所述试剂优选还包括测序引物。所述测序引物包括核苷酸序列如SEQID NO:3(ATCAAGGAAGAGTTACAAA)所示的CASK-SeqF和核苷酸序列如SEQ ID NO:4(CACCAACATTGCTTCAA)所示的CASK-SeqR。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法即可。
本发明提供了一种脑桥小脑发育不良诊断试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。
在本发明中，所述PCR扩增试剂优选包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶。所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2。
本发明提供了所述试剂在制备检测导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变位点的试剂盒中的应用。
在本发明中，所述检测导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变位点的方法，优选包括以下步骤：
提取待测样本的基因组DNA；
以所述基因组DNA为模板，用所述试剂扩增CASK基因序列；
对扩增的CASK基因序列进行DNA测序；
将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，结果完全一致时说明待检样本中CASK基因未发生突变为野生型；若比对结果出现染色体一个等位基因存在CASK基因第12号外显子3343位碱基C突变为T，而两外一个等位基因不存在突变，说明该位点的基因型为“c.202delA杂合子突变”。
在本发明中，所述扩增CASK基因序列的反应体系优选为10×PCR缓冲液2.0μL、10mmol/LdNTPs 0.4μL、100ng/μL CASK-F 0.5μL、100ng/μL CASK-R 0.5μL、100ng/μL抽提DNA 1.0μL、5U/μLTaq酶0.2μL，ddH2O 15.4μL。所述扩增CASK基因序列的反应程序：第一步：96℃，1分钟；第二步：33个循环(96℃，30秒→52℃，15秒→60℃，4分钟)；第三步：72℃7min，第四步：4℃保温。
本发明提供了一种检测基因CASK突变位点的引物在制备脑桥小脑发育不良辅助诊断试剂盒中的应用，所述基因CASK突变位点为CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2。
在本发明中，基于所述基因CASK突变位点上下游序列设计特异性引物，采用所述引物扩增含所述突变位点的DNA片段，通过DNA片段的基因型判断是否有患脑桥小脑发育不良的风险。在本发明实施例中，所述引物优选为所述试剂。
在本发明中，利用所述试剂盒辅助诊断脑桥小脑发育不良的方法，优选包括以下步骤：用所述试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有脑桥小脑发育不良的风险；若检测基因型是“c.202delA杂合子突变”，则为患者；若检测基因型是“野生型”，则个体为正常人。在本发明中，所述样本优选为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，指基因序列或DNA序列中一个或数个(例如几个)碱基的添加、缺失和/或置换，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。术语“突变”当用于描述基因所编码的产物或者蛋白质时，“突变”指的是所述蛋白质或编码产物中一个或数个(例如几个)氨基酸残基的添加、缺失和/或置换。
在本发明中，术语“杂合子突变”/“杂合突变”是指是等位基因中只有其中一个基因出现突变。
文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，
术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增CASK基因是指，在PCR反应中引物只扩增CASK基因，而不扩增其他基因。
下面结合实施例对本发明提供的一种导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变的应用及检测试剂和应用。进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
样本获取
发明人发现了1个脑桥小脑发育不良家系(简称1号家系)，家系部分成员的临床信息见表1。图1显示了CASK基因突变家系图谱，其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，表示流产胎儿，●表示女性患者，↗表示先证者。
1.诊断标准：
可参照《人类单基因遗传疾病》2010年版。
诊断：MICPCH临床表现为严重的精神发育迟滞、颅面异常和不同程度的脑桥小脑发育不良，男性患者症状比女性患者更为严重，且容易早期死亡。
表1脑桥小脑发育不良1号家系成员的临床信息
如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
1号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅱ2外周血DNA用于测序。
实施例2
外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2仪器设备一览表
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。
3.试剂配方
5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
试剂 Tris 硼酸 EDTA(pH8.0,0.5mol/L) ddH2O
体积/重量 5.4g 750mg 2mL 90mL
用ddH2O将最终体积调整为100mL。
0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释10倍即可。
10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
试剂 NH4Cl KHCO3 EDTA 加ddH2O
体积/重量 82.9g 10g 0.37g 至1000mL
高压灭菌，4℃保存。
1×细胞核裂解液按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
试剂 2MTris-HCl，pH8.2 4MNaCl 2mMEDTA
体积/重量 0.5mL 10mL 0.4mL
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ1、Ⅰ2及Ⅱ2成员外周血DNA作为研究样品。
4.1样本DNA提取
1)将样本3-5mL装入15mL离心管中，加2-3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。对于羊水样本直接进入下一步。
2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；
2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；
3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；
4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到具有致病意义的基因突变CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2；其中exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2的突变位于CASK基因的第3号外显子的第202位碱基A缺失，可导致移码突变，所编码的蛋白质第68氨基酸由甲硫氨酸(M)突变为半胱氨酸(C)，在1位氨基酸后终止。
在1号家系女性患者个体中CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点的基因型是“c.202delA杂合子突变”，在CASK家系正常个体中该位点的基因型是“野生型”。
实施例3
Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系3名人员(先证者、先证者母亲、先证者父亲)和100名家系外正常人进行CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1、DNA提取
按照实施例1的方法提基因组DNA。
2、候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。
2.2针对突变位点c.202delA设计20对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。
表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：
①引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；
②G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；
③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；
④引物内部不应出现互补序列；
⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；
⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
2.3候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。
表7引物检测PCR反应体系
/>
反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10-15分钟。
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价：
1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；
2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中两位点1号对候选引物)作为突变家系检测用引物：
针对CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点的PCR扩增引物序列如下：
5’-ATTACAGGTGCGAGCCA-3’(SEQ ID NO：1)
5’-TGCTTCCTTTGCCACTG-3’(SEQ ID NO：2)
其他候选引物因为存在引发发夹结构、或引物二聚体、或非特异性结合扩增，导致PCR效果较差，故舍弃。
3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8突变位点PCR反应体系
反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：
针对CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点的PCR扩增程序如下：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→52℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9BigDye反应体系
测序PCR循环条件：
第一步：96℃，1分钟；
第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH 8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；
2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；
3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；
4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序。
测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物：
针对CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点的测序引物序列如下：
5’-ATCAAGGAAGAGTTACAAA-3’(SEQ ID NO：3)
5’-CACCAACATTGCTTCAA-3’(SEQ ID NO：4)
9、结果分析
Sanger测序结果显示，1号家系中1名女性患者CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点基因型是“c.202delA的杂合突变”；家系2名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点基因型是“野生型”。图2测序图中箭头所指位置A层显示家系患者CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点基因型是“c.202delA杂合子突变”，图2中先证者父母亲该基因位点为野生型。
实施例5
脑桥小脑发育不良诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
1)扩增引物(每条引物1.2μg)：如实施例3所示
2)缓冲液(500μL的10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)，15mmol/LMgCl2)
3)Taq酶(20U)
4)dNTPs(四种dNTP各4mM)
5)CASK:c.202delA阳性突变参考品DNA，该阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示：
ATTACAGGTGCGAGCCACCACGCCTGGCCCCAGCACATTTTATAAATGATATTTTAAAAATTC
TGACTTTGACTCTAGGAATAGTGCCTTTTCTGTTTAAACCATACTATTTTTTGTTCCCTATTCCG
TATAACTTCCCTGATAGGTCTATAAATGCTAGATTTTAGGCTAAAGAATAGACAACATATTTT
TATTTTATTTAGGGAAAACTAAGAAAAAGAGGTAAAAATCAAAACAGTAAATTGAGTTATTAGTTTATTAGCAGTTTGGAGGCTAAGATTTTATTAGAAGAGTTGGGGAAAGTATTTGTGGTTTGTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTTTTGGGGAAAGTATTAAGAAATGTGTACTTTTTTTATTAAAAGCTCACTCTATACTGTATATAGATTTAAGCTTGCAAAAAATATGAAAAGCTATAGTCAAAGATTTTAAAGGGTAAAAAGTTAAGCTAAGTTTAAATGGGGGATTTCATCTCTCTAGTTAGAGAAGTATCCATGTTACCATAGATCACATCCATTCATTCATCATTCACTCTAATTGTCTTTTGTTCCTACCTAATGAAGTATGCTGTATGTTTGTTTTACAGATCTAAAGCGGGAAGCCAGTATCTGTCAT/>TGCTGAAACATCCACACATTGTAGAGTTATTGGAGACATATAGCTCAGATGGAATGCTTTACATGGTTTTCGAATTGTGAGTGTGTATTTTAATTCTTAAAGGGTAAAAC/>TTGGATAATGCTAACACTTTTCTCTTGAAATTTAGCAGTAGTTGTGAACTTATCTGTTCAGAAAGACCTAAAGTCACAAGAAAAAAGGATTATGTCATCATAAGGTTTACAGTGGCAAAGGAAGCA(SEQ ID NO：45)
其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框为点突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。
6)测序引物：如实施例3所示
2、使用方法：
共筛查和检测28个脑部发育异常的家系中94位个体，并再次发现契合本发明的家系，并以2号家系实施为例阐述该基因突变检测试剂盒的应用。
表10脑桥小脑发育不良2号家系成员的临床信息
如图3所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。其中，□表示男性正常个体，○表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者。
2号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1和Ⅱ2外周血DNA用于该试剂盒检测。
1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。
2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；
3)对PCR扩增产物进行纯化；
4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；
5)对BiyDye反应产物纯化；
6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
试剂盒检测结果显示，2号家系中先证者CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点基因型是“c.202delA”半合子突变。图4测序图中D层箭头所指位置显示家系中先证者CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2位点基因型是“c.202delA”半合子突变；检测结果确认先证者为脑桥小脑发育不良患者，先证者父亲、母亲、姐姐基因型为野生型，为正常个体。患者父母以后生脑桥小脑发育不良患者的概率低，但不能排除低比例嵌合的点突变，建议以后如需再生育，需来医院行产前诊断。
由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的CASK基因突变体，且确认了新突变体与脑桥小脑发育不良的发病密切相关，所述致病突变体可用于脑桥小脑发育不良的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基因CASK突变位点在制备脑桥小脑发育不良诊断试剂或制备防治脑桥小脑发育不良的药物中的应用，所述致病基因CASK突变位点为CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2。
2.一种用于检测导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变位点的试剂，其特征在于，包括检测CASK基因突变位点c.202delA的引物；
所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CASK-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CASK-R。
3.根据权利要求2所述试剂，其特征在于，所述试剂还包括测序引物；
所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CASK-SeqF和核苷酸序列如SEQID NO:4所示的CASK-SeqR。
4.一种脑桥小脑发育不良诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述试剂和PCR扩增试剂。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶；
所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2。
6.权利要求2或3所述试剂在制备检测导致脑桥小脑发育不良的致病基因CASK突变位点的试剂盒中的应用。
7.一种检测基因CASK突变位点的引物在制备脑桥小脑发育不良辅助诊断试剂盒中的应用，所述基因CASK突变位点为CASK:NM_001367721.1:exon3:c.202delA:p.M68Cfs*2。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述引物为权利要求2或3所述试剂。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，利用所述试剂盒辅助诊断脑桥小脑发育不良的方法，包括以下步骤：
用所述试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有脑桥小脑发育不良的风险；
若检测基因型是“c.202delA杂合子突变”，则为患者；
若检测基因型是“野生型”，则个体为正常人。
10.根据权利要求7～9任意一项所述的应用，其特征在于，所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
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