CN116144753A - 一种致病基因chd1突变位点的应用及检测试剂 - Google Patents
一种致病基因chd1突变位点的应用及检测试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116144753A CN116144753A CN202211683413.5A CN202211683413A CN116144753A CN 116144753 A CN116144753 A CN 116144753A CN 202211683413 A CN202211683413 A CN 202211683413A CN 116144753 A CN116144753 A CN 116144753A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chd1
- bjornsson
- syndrome
- gene
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 80
- 101000777047 Homo sapiens Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 16
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims abstract description 43
- 102100031235 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 1 Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 22
- 101150110129 CHD1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 30
- 208000036497 Intellectual disability-autism-speech apraxia-craniofacial dysmorphism syndrome Diseases 0.000 claims description 17
- 208000011613 Pilarowski-Bjornsson syndrome Diseases 0.000 claims description 17
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 8
- 238000007482 whole exome sequencing Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 4
- 102100038220 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 6 Human genes 0.000 description 4
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 101000883736 Homo sapiens Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 6 Proteins 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000702559 Homo sapiens Probable global transcription activator SNF2L2 Proteins 0.000 description 3
- 101000702545 Homo sapiens Transcription activator BRG1 Proteins 0.000 description 3
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102100031021 Probable global transcription activator SNF2L2 Human genes 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 2
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 2
- 102100031265 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100031266 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100038214 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 101000764817 Chromohalobacter salexigens (strain ATCC BAA-138 / DSM 3043 / CIP 106854 / NCIMB 13768 / 1H11) Oxygen-dependent choline dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- 101000943088 Homo sapiens Choline dehydrogenase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 101000777079 Homo sapiens Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000777071 Homo sapiens Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000883749 Homo sapiens Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000883731 Homo sapiens Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 5 Proteins 0.000 description 2
- 101000880945 Homo sapiens Down syndrome cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 2
- 101001038390 Homo sapiens Guided entry of tail-anchored proteins factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 201000007201 aphasia Diseases 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108091064702 1 family Proteins 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710181272 Choline dehydrogenase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101100220549 Mus musculus Chd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003988 neural development Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003303 reheating Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012418 validation experiment Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/172—Haplotypes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种致病基因CHD1突变位点c.5377T>C的应用及诊断试剂,属于基因诊断技术领域。本发明通过外显子组测序技术首次发现了CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点突变导致Pilarowski‑Bjornsson综合征。本发明中检测CHD1基因突变c.5377T>C:p.W1793R的试剂用于筛查或诊断Pilarowski‑Bjornsson综合征致病,以指导患者治疗和帮助优生优育,为Pilarowski‑Bjornsson综合征的发病机制研究提供了新的基础和途径。
Description
技术领域
本发明属于基因诊断技术领域,具体涉及一种致病基因CHD1突变位点的应用及检测试剂。
背景技术
Pilarowski-Bjornsson综合征(MIM617682)是一种常染色体显性遗传疾病,Pilarowski-Bjornsson综合征的主要临床特征为发育迟缓、智力障碍,常伴有自闭症特征、言语失用和轻度畸形特征,有些病人可能会有癫痫发作,表型多变。
CHD1基因(MIM602118)基因突变是导致Pilarowski-Bjornsson综合征(MIM617682)的原因,CHD1基因定位于染色体5q15-q21.1,包括37个外显子和36个内含子,基因长75.0kb,编1798个氨基酸序列的蛋白色素域解旋酶DNA结合蛋白1chromodomainhelicaseDNAbindingprotein1。人类CHD蛋白家族属于SWI2/SNF2相关的ATP酶超家族,该家族因蛋白质从氨基酸开始依次含有染色质调节域(Chromdomains)、类SWI2/SNF2ATP酶/解旋酶域(SWI2/SNF2-likeATPase/Helicase)和DNA结合域(DNA-bindingdomain)而得名。DNA结合域最为保守,该域位于CHD蛋白的C末端,可以选择性地与富含AT的双链DNA结合,参与染色质凝集、染色质修饰和基因的表达调控,包括参与染色质的重塑与凝集,重塑复合物的翻译后修饰,参与基因的转录调控,参与细胞的发育和分化等。到目前为止,已经发现6个人类CHD蛋白家族成员,包括CHD1、CHD2、CHD3、CHD4、CHD5和CHD6。根据编码蛋白序列的保守性,该家族被划分为三个亚族:CHD1和CHD2组成了Ⅰ亚族,CHD3、CHD4和CHD5为Ⅱ亚族,CHD6为Ⅲ亚族。其中CHD1基因仅在脑和神经组织中表达,在神经发育过程中发挥重要作用。CHD1基因突变时导致蛋白功能异常,进而导致相应的神经系统表型。
因此,基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础,基因诊断是确诊Pilarowski-Bjornsson综合征的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。现有技术中对基因突变位点的基因型进行检测,可以采用其他方法限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等等,但这些检测方法均不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的目的,所以需要针对特异突变位点的特异性扩增引物。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种致病基因CHD1突变位点的应用,不仅能丰富基因诊断Pilarowski-Bjornsson综合征的突变位点,还能作为靶点为药物筛选、药效评价及靶向治疗提供基础。
本发明的目的还在于提供一种检测导致Pilarowski-Bjornsson综合征的致病基因CHD1突变位点的试剂,助力Pilarowski-Bjornsson综合征基因突变的筛查和诊断。
本发明提供了一种基因CHD1突变位点在制备防治Pilarowski-Bjornsson综合征诊断试剂或制备防治Pilarowski-Bjornsson综合征的药物中的应用,所述基因CHD1突变位点为CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R。
本发明提供了一种用于检测导致Pilarowski-Bjornsson综合征的致病基因CHD1突变位点的试剂,包括检测致病基因CHD1突变位点c.5377T>C:p.W1793R的引物;
所述检测致病基因CHD1突变位点c.5377T>C:p.W1793R的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的CHD1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CHD1-R。
优选的,所述试剂还包括测序引物;
所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CHD1-SeqF和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CHD1-SeqR。
本发明提供了一种Pilarowski-Bjornsson综合征诊断试剂盒,包括所述试剂和PCR扩增试剂。
优选的,所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶;
所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液:500mmol/LKCl、pH8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2。
本发明提供了所述试剂在制备检测导致Pilarowski-Bjornsson综合征的致病基因CHD1突变位点的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种检测基因CHD1突变位点的引物在制备Pilarowski-Bjornsson综合征辅助诊断试剂盒中的应用,所述基因CHD1突变位点为CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R。
优选的,所述引物为所述试剂。
优选的,利用所述试剂盒辅助诊断Pilarowski-Bjornsson综合征的方法,包括以下步骤:
用所述试剂盒检测样本中CHD1基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有Pilarowski-Bjornsson综合征:
若检测基因型存在单个杂合突变“c.5377T>C:p.W1793R杂合突变”,则个体患Pilarowski-Bjornsson综合征;
若检测基因型是“野生型”,则诊断受试个体为正常人。
优选的,所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
本发明提供了一种基因CHD1突变位点在制备防治Pilarowski-Bjornsson综合征诊断试剂或制备防治Pilarowski-Bjornsson综合征的药物中的应用,所述基因CHD1突变位点为CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R。本发明通过外显子组测序技术首次发现了CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点突变导致Pilarowski-Bjornsson综合征发病。一方面,通过检测受试者是否携带有上述突变,用于筛查或诊断Pilarowski-Bjornsson综合征致病基因突变患者,以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面,本发明为Pilarowski-Bjornsson综合征的发病机制研究奠定了重要基础,为Pilarowski-Bjornsson综合征患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面,本发明可以为治疗Pilarowski-Bjornsson综合征提供可能的药物靶点。
本发明所提供的诊断试剂盒,通过优化检测致病基因CHD1突变位点的引物和反应体系,大大提高检测结果的准确性和可靠性,可用于快速、有效地预测或诊断Pilarowski-Bjornsson综合征。
附图说明
图1显示Pilarowski-Bjornsson综合征1号家系遗传图谱;其中,○表示正常女性个体,□表示正常男性个体,■表示男性患者,↗表示先证者。
图2显示利用Sanger测序检测CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点基因型的结果图,其中1号家系先证者为“c.5377T>C”杂合突变,先证者父母为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
图3显示Pilarowski-Bjornsson综合征2号家系遗传图谱;其中,○表示正常女性个体,□表示正常男性个体,●表示女性患者,↗表示先证者。
图4显示利用试剂盒检测2号家系CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点基因型的结果图,其中2号家系先证者为“c.5377T>C”杂合突变,先证者父亲、先证者母亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
具体实施方式
本发明提供了一种基因CHD1突变位点在制备防治Pilarowski-Bjornsson综合征诊断试剂或制备防治Pilarowski-Bjornsson综合征的药物中的应用,所述基因CHD1突变位点为CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R。
本发明首先利用外显子测序筛选与Pilarowski-Bjornsson综合征高度相关的致病基因突变,为了避免假阳性结果出现,之后通过Sanger测序进行验证,最终获得Pilarowski-Bjornsson综合征的致病基因突变,CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R。本发明筛选的致病基因突变中可以将Pilarowski-Bjornsson综合征患者和正常人群区分开,因此,本发明的致病基因突变可以作为诊断Pilarowski-Bjornsson综合征的生物标志物。本发明所述CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R突变位点指野生型CHD1基因的第37号外显子的第5377位碱基T突变为C,形成CHD1基因突变体,所述CHD1基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:5(CATACCCGGAGTA)所示。本发明所述CHD1突变体蛋白与野生型CHD1基因编码的蛋白相比,第1973位氨基酸由色氨酸(W)突变为精氨酸(R),即所述CHD1突变体蛋白含有p.W1793R的突变,所述突变是由于c.5377T>C的错义突变引起的;所述CHD1突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6(EHTRSSR)所示。
本发明提供了一种用于检测导致Pilarowski-Bjornsson综合征的致病基因CHD1突变位点的试剂,包括检测致病基因CHD1突变位点c.5377T>C:p.W1793R的引物;所述检测致病基因CHD1突变位点c.5377T>C的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(GGGGTTTTGTATGGTTCGC)所示的CHD1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2(GCAAGGTGGTCGCAGTGTA)所示的CHD1-R。
在本发明中,所述试剂优选还包括测序引物。所述测序引物包括核苷酸序列如SEQID NO:3(TACGCACCATAAATCTTCC)所示的CHD1-SeqF和核苷酸序列如SEQ ID NO:4(TCCTGGAAAGAAGTAACAAT)所示的CHD1-SeqR。本发明对所述引物的来源没有特殊限制,采用本领域所熟知的引物合成方法即可。
本发明提供了所述试剂在制备检测导致Pilarowski-Bjornsson综合征的致病基因CHD1突变位点的试剂盒中的应用。
在本发明中,所述检测导致Pilarowski-Bjornsson综合征的致病基因CHD1突变位点的方法,优选包括以下步骤:
提取待测样本的基因组DNA;
以所述基因组DNA为模板,用所述试剂扩增CHD1基因序列;
对扩增的CHD1基因序列进行DNA测序;
将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对,结果完全一致时说明待检样本中CHD1基因未发生突变为野生型;若比对结果出现CHD1基因(NM_001364113.3)的一个等位基因第37号外显子中5377位碱基T突变为C,则判断该基因型为“c.5377T>C:p.W1793R杂合突变”。
在本发明中,扩增CHD1基因序列的反应体系优选为10×PCR缓冲液2.0μL、10mmol/LdNTPs0.4μL、100ng/μLCHD1-F0.5μL、100ng/μLCHD1-R0.5μL、100ng/μL抽提DNA1.0μL、5U/μLTaq酶0.2μL,ddH2O15.4μL。所述扩增CHD1基因序列的反应程序优选为第一步:95℃,5分钟;第二步:30个循环(95℃,30秒→57℃,30秒→72℃,60秒);第三步:72℃,7分钟;第四步:4℃保温。
本发明提供了一种Pilarowski-Bjornsson综合征诊断试剂盒,包括所述试剂和PCR扩增试剂。
在本发明中,所述PCR扩增试剂优选包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶。所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液:500mmol/LKCl、pH8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2。
本发明提供了一种检测基因CHD1突变位点的引物在制备Pilarowski-Bjornsson综合征辅助诊断试剂盒中的应用,所述基因CHD1突变位点为CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R。
在本发明中,基于所述基因CHD1突变位点上下游序列设计特异性引物,采用所述引物扩增含所述突变位点的DNA片段,通过DNA片段的基因型判断是否有患Pilarowski-Bjornsson综合征的风险。在本发明实施例中,所述引物优选为所述试剂。
在本发明中,利用所述试剂盒辅助诊断Pilarowski-Bjornsson综合征的方法,优选包括以下步骤:
用所述试剂盒检测样本中CHD1基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有Pilarowski-Bjornsson综合征:
若检测基因型存在单个杂合突变“c.5377T>C:p.W1793R杂合突变”,则个体为携带者;
若检测基因型是“野生型”,则诊断受试个体为正常人。
在本发明中,所述样本优选为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变,指基因序列或DNA序列中一个或数个(例如几个)碱基的添加、缺失和/或置换,成为变异体,变异体可以是天然发生的或非天然发生的。术语“突变”当用于描述基因所编码的产物或者蛋白质时,“突变”指的是所述蛋白质或编码产物中一个或数个(例如几个)氨基酸残基的添加、缺失和/或置换。
在本发明中,术语“纯合突变”/“杂合突变”是指是等位基因中只有其中一个基因出现突变。
文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上,主要通过遗传学检测和影像学检查,对高风险胎儿进行明确诊断,通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的,从而降低出生缺陷率,提高优生质量和人口素质。
在本发明中,“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段,其通常为寡核苷酸,例如含有至少5个碱基,例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补,只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的,
术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因,而不扩增其他基因。例如,特异性扩增CHD1基因是指,在PCR反应中引物只扩增CHD1基因,而不扩增其他基因。
下面结合实施例对本发明提供的一种致病基因CHD1突变位点的应用及检测试剂进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2014)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
样本获取
发明人发现了1个Pilarowski-Bjornsson综合征家系(简称1号家系),该家系部分成员的临床信息见表1。图1家系图谱,其中,○表示正常女性个体,□表示正常男性个体,■表示男性患者,↗表示先证者。
1.诊断标准:
可参照《人类单基因遗传疾病》2010版和《罕见病诊疗指南》2019版:
Pilarowski-Bjornsson综合征的主要临床特征为发育迟缓、智力障碍,常伴有自闭症特征、言语失用和轻度畸形特征,有些病人可能会有癫痫发作,表型多变。
表1 Pilarowski-Bjornsson综合征1号家系成员的临床信息
如图1所示,编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
1号家系人员Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)和Ⅱ1(先证者)外周血DNA用于测序分析。
实施例2
外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2仪器设备一览表
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTer分钟atorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。
3.试剂配方
5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
试剂 | Tris | 硼酸 | EDTA(pH8.0,0.5mol/L) | ddH2O |
体积/重量 | 5.4g | 750mg | 2mL | 90mL |
用ddH2O将最终体积调整为100mL。
0.5×TBE电泳液工作液,用ddH2O稀释10倍即可。
10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
试剂 | NH4Cl | KHCO3 | EDTA | 加ddH2O |
体积/重量 | 82.9g | 10g | 0.37g | 至1000mL |
高压灭菌,4℃保存。
1×细胞核裂解液按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
试剂 | 2MTris-HCl,pH8.2 | 4MNaCl | 2mMEDTA |
体积/重量 | 0.5mL | 10mL | 0.4mL |
4.实验步骤
签署知情同意书后,采集1号家系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)和Ⅱ1(先证者)成员的外周血3~5mL。
4.1样本DNA提取
1)将样本3~5mL装入15mL离心管中,加2~3倍体积的1×红细胞裂解液,混匀,冰上静置30分钟,直至溶液变透明。
2)4℃,3000转/分钟离心10分钟,小心去上清液。沉淀中加1mL1×细胞核裂解液,混匀,再加2mL1×细胞核裂解液和150μL20%SDS,摇匀,至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K,摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3)加等体积饱和酚,轻摇混匀,室温3000转/分钟离心10分钟。
4)小心移上清至另一离心管,加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀,室温3000转/分钟离心10分钟。
5)小心移上清,若上清不清亮透明,则用等体积氯仿再抽提一次。
6)将上清移入另一离心管中,加二倍体积无水乙醇,摇匀,见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出,70%乙醇洗二次,室温干燥5分钟,再将DNA溶于200μL1×TE中,转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7)TE溶解的DNA,在4℃下可保存一年,如要求长期保存,则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
参考人类全外显子测序试剂盒(Agilent)说明书和分子克隆实验室手册(第三版;Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 1 SECOND EDITION;New York:Cold SpringHarbor LaboratoryPress,2014)操作指南。
1)取2μgDNA,机械打断,使片段大小在200bp左右,切胶回收150~250bp片段;
2)DNA片段做末端修复和3’末端加A;
3)连接测序接头,对连接产物进行纯化,再行PCR扩增,扩增产物纯化;
4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获,杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增,再行最终产物回收,取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析;
5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到1个具有致病意义的基因杂合突变CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R;c.5377T>C突变为第37外显子的第5377碱基由T突变为C,造成了错义突变,即第1793位氨基酸由色氨酸(W)突变为精氨酸(R)。在1号家系患者(先证者)CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点的基因型是“c.5377T>C”杂合突变;在1号家系正常个体该位点的基因型为野生型。。
实施例3
Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法,对CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点进行验证。分别对实施例1中的1号系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ1(先证者)3名人员和100名家系外正常人进行CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点基因型检测。
具体方法步骤如下:
1、DNA提取
按照实施例1的方法提基因组DNA。
2、候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome,或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redirect=manual&source=genome.ucsc.edu)。
2.2针对c.5377T>C:p.W1793R位点分别设计19对候选引物(见表6),并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况
表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
注:正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带,若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果;目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对:
①引物长度为15~30nt,常用为20nt左右;
②G+C含量以40%~60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布;
③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照;
④引物内部不应出现互补序列;
⑤两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3`端的互补重叠;
⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增;
2.3候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上;每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。
表7引物检测PCR反应体系
反应条件:将上述测试反应管放入PCR仪,执行以下反应程序:
第一步:95℃,5分钟;
第二步:30个循环(95℃,30秒→Tm,30秒→72℃,60秒);(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数,如为双引物则取Tm平均值)。
第三步:72℃,7分钟;
第四步:4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测,以评估引物反应的有效性、特异性:
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好,置于一水平台面上,在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中,加入100mL0.5×TBE电泳缓冲液,摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热,沸腾后取出摇匀,再加热,直至凝胶完全熔解,取出室温冷却。
3)待凝胶冷却至50℃左右,倒入封好的凝胶成样器,使厚度在5mm左右。
4)凝胶凝固拆除胶带,将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5)加入电泳缓冲液,使液面高于胶面1-2mm,向上拔出梳子;用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后,加入各加样孔内,由于载样液中蔗糖比重较大,DNA沉入孔底。
6)盖上电泳槽,接通电源,调至适当电压,开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示,判断样品的大概位置,决定是否终止电泳。
7)切断电源,取出凝胶,放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10~15分钟。
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果,波长254nm,并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价:
1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带,无其它条带,则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强;
2)如果7号管没有出现目的条带,则判断该对引物和反应体系无效;
3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带,并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带,则判断该对引物和反应体系有效性差;
4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带,并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带,则判断该对引物和反应体系特异性差;
5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带,并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带,则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表6验证测试后统计的结果,选择其中最优一对(表6中位点1号对候选引物)作为突变家系检测用引物:
针对CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点的PCR扩增引物序列如下:5’-TGTTGGGTAGATGAGGTATG-3’(SEQ ID NO:1);5’-GTGGTGTTTCCAGTAGCAG-3’(SEQIDNO:2)。
其他候选引物因为存在引发发夹结构、或引物二聚体、或非特异性结合扩增,导致PCR效果较差,故舍弃。
3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8突变位点PCR反应体系
试剂 | 体积 |
10×PCR缓冲液 | 2.0μL |
10mmol/LdNTPs | 0.4μL |
100ng/μLCHD1-1F | 0.5μL |
100ng/μLCHD1-1R | 0.5μL |
100ng/μL抽提DNA | 1.0μL |
5U/μLTaq酶 | 0.2μL |
ddH2O | 15.4μL |
反应条件:将反应体系放入PCR仪,执行以下反应程序:
针对CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点的PCR扩增程序如下:
第一步:95℃,5分钟;
第二步:30个循环(95℃,30秒→57℃,30秒→72℃,60秒);
第三步:72℃,7分钟;
第四步:4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化:5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(ExoI),1μL碱性磷酸酶(AIP),37℃消化15分钟,85℃使酶失活15分钟。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9 BigDye反应体系
试剂 | 用量 |
PCR产物纯化后DNA | 2.0μL |
3.2pmol/μL测序引物 | 1.0μL |
BigDye | 0.5μL |
5×BigDye测序缓冲液 | 2.0μL |
ddH2O | 4.5μL |
测序PCR循环条件:
第一步:96℃,1分钟;
第二步:33个循环(96℃,30秒→55℃,15秒→60℃,4分钟);
第三步:4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化:
1)每管加入1μL125mMEDTA(pH8.0),加到管底,再加入1μL3mol/LNaAc(pH5.2);
2)加入70μL70%酒精,震荡混匀4次,室温放置15分钟;
3)3000g,4℃离心30分钟;马上倒置96孔板,185g离心1分钟;
4)室温放置5分钟,让残余的酒精在室温挥发干,加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA,96℃变性4分钟,迅速置冰上4分钟,上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序。
测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物:
针对CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点的测序引物序列如下:
5’-TACGCACCATAAATCTTCC-3’(SEQ ID NO:3);
5’-TCCTGGAAAGAAGTAACAAT-3’(SEQ ID NO:4)。
9、结果分析
图2的Sanger测序结果显示,1号家系1名人员CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点基因型是“c.5377T>C”杂合突变。图2测序图中箭头所指位置显示A层CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点基因型是“c.5377T>C”杂合突变;图2测序图中箭头所指位置显示B和C层CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点基因型为野生型。
实施例4
Pilarowski-Bjornsson综合征诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成:
1)扩增引物(每条引物1.2μg):如实施例3所示;
2)缓冲液(500μL的10×PCR缓冲液:500mmol/LKCl,100mmol/LTris-Cl(pH8.3),15mmol/LMgCl2);
3)Taq酶(20U);
4)dNTPs(四种dNTP各4mM);
5)CHD1:c.5377T>C:p.W1793R阳性突变参考品DNA,阳性参考品为一段双链DNA,具体序列如下所示:
GGGGTTTTGTATGGTTCGCTTTAGTTTTATGAATCAAATAGTTTTTCCAAAGAGATATATCCAGTGATTTTTGAGTTAATTAAGTAAGTTTTATAATGCAACACTGAATTTCTATACAATTAAAAACATGTTTTAAGGTATTTTTATGTTTTTTAGTTATCTTTTATTTGGAAACATTTTAATTTGCATGATTTGTCTAAAATTCTCAATTTTTCTTTATTAGATATTACAGTGACAGAGAGAAACACAGAAAACTGGATGATCACAGGAGTAGAGATCACAGGTCAAATTTGGAAGGAAGTTTAAAAGATAGATCTCATTCTGATCATCGTTCTCACTCAGATCATCGGTTACATTCAGACCACCGGTCAAGTTCTGAATATACGCACCATAAATCTTCCAGGGATTATAGGTATCACTCAGACTGGCAAATGGACCACAGAGCTTCCAGCAGTGGCCCTAGGTCACCACTAGATCAGAGATCTCCTTATGGCTCCAGATCTCCATTTGAACATTCAGTTGAACACAAAAGTACACCGGAGCATACCCGGAGTAGTCGGAAAACATAACAAAAACTGATACTTCGTCTTTCTGGACTTTTCTTTTAGCCATATATCATAAACCAACACAGTAATTGCCTTACATGACTTGAAAGATATAAACAGATCTTCTATCAGTAGCAGTATTGTTACTTCTTTCCAGGATGCAAGGTCTATTATCCCAACAGAAGAGAAAATATTTTTATATTTAAGGATTATGCTGCACTGTACTACAAAATTGTAGTACTTTTTTTTGTTTTCTTTTTTAAAGAAATGGAAAATGTTTACTATTACAGGGACCTCAACACTGCCCTCCCATACAGGCTGGATAAAACTGTTTTTAAGTCAGTGATTTTAGACTGACCTCCATTTAAATTATGTTTATATATGAACTTTACTCTGACCTGTGATCATGTTTCAGGAAGGAATGAAAGAGAGTTCTTTCTTAATAAAGAAAAACACTCAAGGACTTTGTTCATTTCCAAAGCTACTTGTTTACATTGTACACTGCGACCAC CTTGC(SEQ IDNO:43)。
其中,单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置,方框内碱基为点突变位点,双下划线碱基为上下游测序引物位置。
6)测序引物:如实施例3所示。
2、使用方法:
共筛查和检测23个智力障碍家系中104位个体,并再次发现如下家系,并将本试剂盒应用于2号家系患者检测(见表10)。
表10Pilarowski-Bjornsson综合征2号家系成员的临床信息
如图3所示,编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
2号家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)和Ⅱ1(先证者)外周血DNA用于试剂盒检测。
1)基因组DNA提取:提取样本基因组DNA。
2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应,如实施例3;
3)对PCR扩增产物进行纯化;
4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应;
5)对BiyDye反应产物纯化;
6)对BiyDye反应产物测序,测序序列与正常序列相比较。
图4的试剂盒检测结果显示,2号家系先证者CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点基因型是“c.5377T>C”杂合突变。图4测序图中箭头所指位置显示A层CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R位点基因型是“c.5377T>C”杂合突变。检测结果确认先证者为Pilarowski-Bjornsson综合征患者;先证者父亲、母亲未发现携带该突变,尽管出生Pilarowski-Bjornsson综合征患儿的概率低,但再生育时,建议来医院行产前诊断。
由以上实施例结果可以看出,本发明发现了新的CHD1基因突变体,且确认了新突变体与Pilarowski-Bjornsson综合征的发病密切相关,所述致病突变体可用于Pilarowski-Bjornsson综合征的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基因CHD1突变位点在制备防治Pilarowski-Bjornsson综合征诊断试剂或制备防治Pilarowski-Bjornsson综合征的药物中的应用,所述基因CHD1突变位点为CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R。
2.一种用于检测导致Pilarowski-Bjornsson综合征的致病基因CHD1突变位点的试剂,其特征在于,包括检测致病基因CHD1突变位点c.5377T>C:p.W1793R的引物;
所述检测致病基因CHD1突变位点c.5377T>C:p.W1793R的引物包括核苷酸序列如SEQID NO:1所示的CHD1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CHD1-R。
3.根据权利要求2所述试剂,其特征在于,所述试剂还包括测序引物;
所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CHD1-SeqF和核苷酸序列如SEQID NO:4所示的CHD1-SeqR。
4.一种Pilarowski-Bjornsson综合征诊断试剂盒,其特征在于,包括权利要求2或3所述试剂和PCR扩增试剂。
5.根据权利要求4所述试剂盒,其特征在于,所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶;
所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液:500mmol/L KCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2。
6.权利要求2或3所述试剂在制备检测导致Pilarowski-Bjornsson综合征的致病基因CHD1突变位点的试剂盒中的应用。
7.一种检测基因CHD1突变位点的引物在制备Pilarowski-Bjornsson综合征辅助诊断试剂盒中的应用,所述基因CHD1突变位点为CHD1:NM_001364113.3:exon37:c.5377T>C:p.W1793R。
8.根据权利要求7所述应用,其特征在于,所述引物为权利要求2或3所述试剂。
9.根据权利要求7所述应用,其特征在于,利用所述试剂盒辅助诊断Pilarowski-Bjornsson综合征的方法,包括以下步骤:
用所述试剂盒检测样本中CHD1基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有Pilarowski-Bjornsson综合征:
若检测基因型存在单个杂合突变“c.5377T>C:p.W1793R杂合突变”,则个体为Pilarowski-Bjornsson综合征;
若检测基因型是“野生型”,则诊断受试个体为正常人。
10.根据权利要求7~9任意一项所述应用,其特征在于,所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211683413.5A CN116144753A (zh) | 2022-12-27 | 2022-12-27 | 一种致病基因chd1突变位点的应用及检测试剂 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211683413.5A CN116144753A (zh) | 2022-12-27 | 2022-12-27 | 一种致病基因chd1突变位点的应用及检测试剂 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116144753A true CN116144753A (zh) | 2023-05-23 |
Family
ID=86351804
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211683413.5A Pending CN116144753A (zh) | 2022-12-27 | 2022-12-27 | 一种致病基因chd1突变位点的应用及检测试剂 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116144753A (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999045112A2 (en) * | 1998-03-04 | 1999-09-10 | Myriad Genetics, Inc. | Chromosome 11-linked coronary heart disease susceptibility gene chd1 |
CN115074443A (zh) * | 2019-12-13 | 2022-09-20 | 北京艾迪康医学检验实验室有限公司 | 人基因chd1位点突变和检测cdh1基因的多个位点突变的试剂盒 |
-
2022
- 2022-12-27 CN CN202211683413.5A patent/CN116144753A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999045112A2 (en) * | 1998-03-04 | 1999-09-10 | Myriad Genetics, Inc. | Chromosome 11-linked coronary heart disease susceptibility gene chd1 |
CN115074443A (zh) * | 2019-12-13 | 2022-09-20 | 北京艾迪康医学检验实验室有限公司 | 人基因chd1位点突变和检测cdh1基因的多个位点突变的试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BRENT H. WYATT等: "Using an aquatic model, Xenopus laevis, to uncover the role of chromodomain 1 in craniofacial disorders", GENESIS, vol. 59, pages 1 - 18 * |
GENAY O. PILAROWSKI等: "Missense variants in the chromatin remodeler CHD1 are associated with neurodevelopmental disability", J MED GENET., vol. 55, no. 8, pages 561 - 566 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN115772214B (zh) | F8突变体蛋白、f8基因突变体、检测f8基因突变体的引物组合、试剂及应用 | |
CN116240280A (zh) | 导致Rubinstein-Taybi综合征的致病基因、检测及应用 | |
CN115141884B (zh) | 一种新的atp7b突变基因及其诊断试剂 | |
CN115141837B (zh) | 一种新slc9a6突变基因及其诊断试剂 | |
CN116287213A (zh) | 导致mrd7型智力障碍的致病基因、检测及应用 | |
CN116121365A (zh) | 导致cofs综合征的致病基因、检测及应用 | |
CN116377054A (zh) | 导致Snijders Blok型智力障碍的致病基因、检测及应用 | |
CN116024222B (zh) | 一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的nac1基因突变体及其应用 | |
CN115927356B (zh) | Slc45a2致病突变基因、致病突变体及在制备眼皮肤白化病ⅳ型诊断试剂盒中的应用 | |
CN116179686A (zh) | 导致Malan综合征的致病基因、检测及应用 | |
CN116426630A (zh) | 导致Joubert综合征的致病基因、检测及应用 | |
CN116083556A (zh) | 一种导致mrd52型智力障碍的致病基因ash1l突变位点的应用及检测试剂和应用 | |
CN116656801A (zh) | 一种Cowchock综合征致病基因AIFM1突变位点的应用及其检测试剂和应用 | |
CN115725716A (zh) | Pkd1致病突变基因及在制备多囊肾病诊断试剂盒中的应用 | |
CN115992212A (zh) | 一种ube3a突变体蛋白、ube3a基因突变体、扩增引物、检测试剂及应用 | |
CN116144753A (zh) | 一种致病基因chd1突变位点的应用及检测试剂 | |
CN115948530B (zh) | 一种Turner型X连锁综合征性智力低下的致病基因、引物对及其应用 | |
CN115851918B (zh) | 一种导致视网膜营养不良的致病基因cfap410突变位点的应用及检测试剂 | |
CN115851898B (zh) | 一种bpes综合征致病基因foxl2突变位点的应用及其诊断试剂 | |
CN116004799B (zh) | Crtap致病突变体及在制备脆骨症ⅶ型诊断试剂盒中的应用 | |
CN115992224A (zh) | 一种导致charge综合征的致病基因chd7突变位点的应用及检测试剂 | |
CN116004789B (zh) | 一种Seckel综合征致病基因CEP152突变位点的应用及其诊断试剂 | |
CN116042812A (zh) | 一种基因clcn4复合杂合突变的应用及检测试剂和应用 | |
CN116042811A (zh) | 一种导致mrd26型神经发育迟滞的致病基因auts2突变的应用及检测试剂 | |
CN116218990A (zh) | 一种导致Bohring-Opitz综合征的致病基因ASXL1突变的应用及检测试剂 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |