CN116042812A - 一种基因clcn4复合杂合突变的应用及检测试剂和应用 - Google Patents

一种基因clcn4复合杂合突变的应用及检测试剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基因CLCN4复合杂合突变的应用及检测试剂和应用，属于医学诊断技术领域。本发明首次发现了CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点复合杂合突变可以导致Raynaud‑Claes综合征(MIM 300114)。本发明检测所述基因突变位点的试剂用于Raynaud‑Claes综合征的遗传学诊断和优生优育指导，为Raynaud‑Claes综合征的发病机制研究提供了新的基础和途径，可以为治疗Raynaud‑Claes综合征提供可能的药物靶点。

Description

一种基因CLCN4复合杂合突变的应用及检测试剂和应用
技术领域
本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及一种基因CLCN4复合杂合突变的应用及检测试剂和应用。
背景技术
Raynaud-Claes综合征(MIM 300114)是一种X染色体连锁的显性遗传病。临床特征包括长脸、下巴突出、直鼻等面部畸形，严重的精神运动发育迟缓、智力障碍，肌张力减退，部分患者出现脊柱侧凸、步态异常、癫痫、行为问题、进行性共济失调及大脑异常等。致病基因CLCN4基因(MIM 302910)位于X染色体，男性(46,XY)患者表型明显，女性患者(46,XX)临床表现存在异质性，部分女性影响非常轻微，而另一些则表现出与男性患者表型相似但轻重不一的一系列临床表型。Raynaud-Claes综合征引起智力障碍的范围从临界到严重；行为和精神疾病在儿童和成年期都很常见，包括孤独症特征，情绪障碍，强迫行为以及异性和自发攻击；癫痫病很常见，严重程度从癫痫性脑病到控制良好的癫痫发作不等。部分患者在脑神经影像学上显示出白质变化，并出现进行性神经系统症状，包括运动障碍和痉挛等。
CLCN4基因(MIM 302910)定位于染色体Xp22.2，基因全长80.7kb，包含13个外显子和12个内含子，编码760个氨基酸组成的CHLORIDE CHANNEL 4蛋白。CLCN4蛋白是电压依赖的2Clˉ/H+交换体ClC-4。CLCN4基因突变可引起X连锁的智力障碍、癫痫、行为异常和先天性畸形。CLCN4突变导致的癫痫多为药物难治性，发病机制尚不明确，预后差，目前无有效的治疗方法。CLCN4突变谱包括移码，错义和剪接位点变异以及一个单外显子缺失等。
基因突变是导致Raynaud-Claes综合征发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊Raynaud-Claes综合征的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，现有技术中对基因突变位点基因型的检测，可以采用其他方法限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等等，但这些检测方法均不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的目的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种导致Raynaud-Claes综合征的致病基因CLCN4复合杂合突变的应用，开发一种新型的致病基因复合杂合突变可以作为诊断Raynaud-Claes综合征的生物标志物，区分Raynaud-Claes综合征患者、携带者和正常人群。
本发明的目的还在于提供一种检测导致Raynaud-Claes综合征的致病基因CLCN4复合杂合突变的试剂和应用，助力Raynaud-Claes综合征基因突变的筛查和诊断。
本发明提供了一种基因CLCN4复合杂合突变位点在制备Raynaud-Claes综合征诊断试剂或制备防治Raynaud-Claes综合征的药物中的应用，所述致病基因CLCN4复合杂合突变位点为CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F。
本发明提供了一种用于检测Raynaud-Claes综合征的致病基因CLCN4复合杂合突变位点的试剂，包括检测致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的引物和检测致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的引物；
所述检测致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CLCN4-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CLCN4-1R；
所述检测致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CLCN4-2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CLCN4-2R。
优选的，还包括测序引物；
所述测序引物包括致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的测序引物和/或致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的测序引物；
所述致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的CLCN4-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的CLCN4-Seq1R；
所述致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的CLCN4-Seq2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的CLCN4-Seq2R。
本发明提供了一种Raynaud-Claes综合征诊断试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。
优选的，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶；
所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/LKCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2。
本发明提供了所述试剂在制备检测Raynaud-Claes综合征的致病基因CLCN4突变位点的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种检测致病基因CLCN4复合杂合突变位点的引物在制备辅助诊断Raynaud-Claes综合征的试剂盒中的应用，所述致病基因CLCN4复合杂合突变位点为CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F。
优选的，所述引物为上述方案所述试剂。
优选的，所述辅助诊断Raynaud-Claes综合征的方法，包括以下步骤：用所述试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有Raynaud-Claes综合征的风险：
若男性个体检测基因型是CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点的基因型是“c.1595C>A半合子突变”或“c.1873C>T半合子突变”，则为患者；若女性该位点的基因型是“c.1595C>A杂合子突变”或“c.1873C>T杂合子突变”，则为女性患者；若该位点的基因型是“野生型”，则个体为正常人。
优选的，所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
本发明提供了一种基因CLCN4复合杂合突变位点在制备Raynaud-Claes综合征诊断试剂或制备防治Raynaud-Claes综合征的药物中的应用，所述致病基因CLCN4复合杂合突变位点为CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532KCLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F。
本发明通过外显子组测序技术首次发现了CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和exon11:c.1873C>T:p.L625F位点复合杂合突变可以导致Raynaud-Claes综合征发病。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断Raynaud-Claes综合征的遗传学诊断，以指导治疗。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断Raynaud-Claes综合征。另一方面，本发明为Raynaud-Claes综合征的发病机制研究奠定了重要基础，为Raynaud-Claes综合征患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗Raynaud-Claes综合征提供可能的药物靶点。
本发明还提供了一种用于检测Raynaud-Claes综合征的致病基因CLCN4突变位点的试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。通过优化检测致病基因CLCN4突变位点的引物和反应体系，大大提高检测结果的准确性和可靠性，极大助力Raynaud-Claes综合征基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
附图说明
图1显示Raynaud-Claes综合征1号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者，↗表示先证者。
图2显示利用Sanger测序检测1号家系CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K位点基因型的结果图，其中，A层：1号家系中半合子突变者；B和C层：1号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
图3显示Raynaud-Claes综合征2号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者。
图4显示利用Sanger测序检测2号家系CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点基因型的结果图，其中，A层：2号家系中半合子突变者；B、C和D层：2号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
图5显示Raynaud-Claes综合征3号家系遗传图谱；其中，其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者，↗表示先证者。
图6显示利用试剂盒检测3号家系CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K位点基因型的结果图；其中，C层：3号家系中半合子突变者；A层和B层：3号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
图7显示Raynaud-Claes综合征4号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者。
图8显示利用试剂盒检测4号家系CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点基因型的结果图，其中，A层：4号家系中半合子突变者；B、C和D层：4号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
具体实施方式
本发明提供了一种基因CLCN4复合杂合突变位点在制备Raynaud-Claes综合征诊断试剂或制备防治Raynaud-Claes综合征的药物中的应用，所述致病基因CLCN4复合杂合突变位点为CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F。
在本发明中，首先利用外显子测序筛选与Raynaud-Claes综合征高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，之后通过Sanger测序进行验证，最终获得Raynaud-Claes综合征的致病基因复合杂合突变，具体为CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和exon11:c.1873C>T:p.L625F。所述致病基因复合杂合突变可以作为诊断Raynaud-Claes综合征的生物标志物，将Raynaud-Claes综合征患者、携带者和正常人群区分开。其中CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K突变指野生型CLCN4基因的第11号外显子的第1595位碱基由C突变为A，形成CLCN4基因突变体，所述CLCN4基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：9(GGATGAAGGTGTC，方框为缺失突变发生位置)所示。本发明所述CLCN4突变体蛋白与野生型CLCN4基因编码的蛋白相比，第532位氨基酸由苏氨酸(T)突变为赖氨酸(K)，即所述CLCN4突变体蛋白含有p.T532K的突变，所述突变是由于c.1595C>A的错义突变引起的；所述CLCN4突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10(TRMKVSL)所示。所述CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F突变指野生型CLCN4基因的第11号外显子的第1873位碱基C突变为T，形成CLCN4基因突变体，所述CLCN4基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：11(GAGACGTTCATCA，方框为缺失突变发生位置)所示。本发明所述CLCN4突变体蛋白与野生型CLCN4基因编码的蛋白相比，第625位氨基酸由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，即所述CLCN4突变体蛋白含有p.L625F的突变，所述突变是由于c.1873C>T的错义突变引起的；所述CLCN4突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12(VETFIKE)所示。
在本发明中，根据CLCN4两个突变位点的上下游序列设计特异性扩增引物或者特异性检测探针来制备诊断试剂。
本发明提供了一种用于检测Raynaud-Claes综合征的致病基因CLCN4复合杂合突变位点的试剂，包括检测致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的引物和检测致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的引物；所述检测致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(AATGCCTGTTGCTTTTG)所示的CLCN4-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2(TGTAGTCGGTCTCCTTGAT)所示的CLCN4-1R；所述检测致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3(ACTCCTCCCCTCTGTTG)所示的CLCN4-2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:4(TTCGGCTCTTGGTAAAAT)所示的CLCN4-2R。
在本发明中，所述试剂优选还包括测序引物。所述测序引物包括致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的测序引物和/或致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的测序引物。所述致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5(AACTTCAGGCTCCCCAACG)所示的CLCN4-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:6(CCTCGTAGATGCCTTCTTT)所示的CLCN4-Seq1R；所述致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7(CATTTGGGAAAGAAGGC)所示的CLCN4-Seq2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:8(CCCTCCTCTGGGCAAAT)所示的CLCN4-Seq2R。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法即可。
本发明提供了一种Raynaud-Claes综合征诊断试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。
在本发明中，所述PCR扩增试剂优选包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶。所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2。
本发明提供了所述试剂在制备检测Raynaud-Claes综合征的致病基因CLCN4突变位点的试剂盒中的应用。
在本发明中，所述检测Raynaud-Claes综合征的致病基因CLCN4突变位点的方法，优选包括以下步骤：
提取待检样本基因组DNA；
以基因组DNA为模板，用上述方案中所述试剂扩增CLCN4基因序列；
将CLCN4基因的扩增产物进行DNA测序；
将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，结果完全一致时说明待检样本中CLCN4基因未发生突变为野生型，当比对结果出现唯一的X染色体中一个等位基因存在CLCN4基因(NM_001830.4)第11号外显子1595位碱基由C突变为A，则该突变位点的基因型为“c.1595C>A:p.T532K半合子突变”；若其中一条X染色体上一个等位基因存在第11号外显子1873位碱基C突变为T时，另外一个X染色体上的等位基因不发生突变，则该突变位点的基因型为“c.1873C>T:p.L625F杂合突变”。
在本发明中，所述扩增CLCN4基因序列的反应体系优选为10×PCR缓冲液2.0μL、10mmol/LdNTPs 0.4μL、100ng/μL CLCN4-1F(或CLCN4-2F)0.5μL、100ng/μL CLCN4-1R(或CLCN4-2R)0.5μL、100ng/μL抽提DNA 1.0μL、5U/μLTaq酶0.2μL、ddH2O 15.4μL。对于CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K突变位点的PCR扩增反应程序优选如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→49℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃保温。对于CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F突变位点反应程序如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→50℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃保温。
本发明提供了一种检测致病基因CLCN4复合杂合突变位点的引物在制备辅助诊断Raynaud-Claes综合征的试剂盒中的应用，所述致病基因CLCN4复合杂合突变位点为CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F。
在本发明中，基于所述致病基因CLCN4突变位点上下游序列设计特异性引物，采用所述引物扩增含所述突变位点的DNA片段，通过DNA片段的基因型判断是否有患Raynaud-Claes综合征的风险。在本发明实施例中，所述引物优选为上述方案所述试剂。
在本发明中，所述辅助诊断Raynaud-Claes综合征的方法，优选包括以下步骤：用所述试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有Raynaud-Claes综合征的风险：若男性个体检测基因型是CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点的基因型是“c.1595C>A半合子突变”或“c.1873C>T半合子突变”，则为患者；若女性该位点的基因型是“c.1595C>A杂合子突变”或“c.1873C>T杂合子突变”，则为女性患者；若该位点的基因型是“野生型”，则个体为正常人。
在本发明中，所述样本优选为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。
在本发明中，术语“杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。
在本发明中，术语“复合杂合突变”是指是指等位基因均出现1处或以上的杂合突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。
文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，
术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增CLCN4基因是指，在PCR反应中引物只扩增CLCN4基因，而不扩增其他基因。
下面结合实施例对本发明提供的一种导致Raynaud-Claes综合征的致病基因CLCN4复合杂合突变的应用及检测试剂和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(Molecular CloningALABORATORYMANUAL 1SECOND EDITION；NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
样本检测
发明人发现了2个Raynaud-Claes综合征家系(简称1号和2号家系)，家系部分成员的临床信息见表1。图1和3显示了CLCN4基因突变家系图谱，其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者。
1.诊断标准：
可参照《人类单基因遗传疾病》2010年版和《罕见病诊疗指南》2019年版。
Raynaud-Claes综合征临床特征包括长脸、下巴突出、直鼻等面部畸形，严重的精神运动发育迟缓、智力障碍，肌张力减退，部分患者出现脊柱侧凸、步态异常、癫痫、行为问题、进行性共济失调及大脑异常等。
表1 Raynaud-Claes综合征1号和2号家系成员的临床信息
如图1、3所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
1号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅱ1外周血DNA用于测序。
2号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1外周血DNA和Ⅱ2羊水DNA用于测序。
实施例2外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2仪器设备一览表
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。
3.试剂配方
5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
试剂 Tris 硼酸 EDTA(pH 8.0,0.5mol/L) <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>
体积/重量 5.4g 750mg 2mL 90mL
用ddH2O将最终体积调整为100mL。
0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释10倍即可。
10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
试剂 <![CDATA[NH<sub>4</sub>Cl]]> <![CDATA[KHCO<sub>3</sub>]]> EDTA <![CDATA[加ddH<sub>2</sub>O]]>
体积/重量 82.9g 10g 0.37g 至1000mL
高压灭菌，4℃保存。
1×细胞核裂解液按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
试剂 2M Tris-HCl，pH 8.2 4M NaCl 2mM EDTA
体积/重量 0.5mL 10mL 0.4mL
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1成员及2号家系中Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1成员的外周血3-5mL和家系2中Ⅱ2羊水DNA作为研究样品。
4.1样本DNA提取
1)将3-5mL样本装入15mL离心管中，加2-3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。
2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；
2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；
3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；
4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到具有致病意义的基因突变CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和exon11:c.1873C>T:p.L625F；其中exon11:c.1595C>A:p.T532K的突变位于CLCN4基因的第11号外显子第1595位碱基C突变为A，可导致错义突变，所编码的蛋白质第532氨基酸由苏氨酸(T)突变为赖氨酸(K)；exon11:c.1873C>T的突变为CLCN4基因的第11号外显子的第1873位碱基C突变为T，可导致错义突变，所编码的蛋白质第625氨基酸由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)。
在1号家系男性患者中CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K位点的基因型是“c.1595C>A半合子突变”，在家系正常个体中该位点的基因型是“野生型”。
在2号家系男性患者中CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点的基因型是“c.1873C>T半合子突变”，在正常个体中该位点基因型为“野生型”。
实施例3
Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对
CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和exon11:c.1873C>T:p.L625F位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系3名人员(先证者、先证者父亲、先证者母亲)、2号家系4名人员(先证者、先证者母亲、先证者父亲、胎儿)和100名家系外正常人进行CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和exon11:c.1873C>T:p.L625F位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1、DNA提取
按照实施例1的方法提基因组DNA。
2、候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。
2.2针对突变位点c.1595C>A和c.1873C>T分别设计16对和15对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。
表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：
①引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；
②G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；
③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；
④引物内部不应出现互补序列；
⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；
⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
2.3候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。
表7引物检测PCR反应体系
反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10-15分钟。
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价：
1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；
2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中两位点1号对候选引物)作为突变家系检测用引物：
针对CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K位点的PCR扩增引物序列如下：
5’-AATGCCTGTTGCTTTTG-3’(SEQ ID NO:1)
5’-TGTAGTCGGTCTCCTTGAT-3’(SEQ ID NO:2)
针对CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点的PCR扩增引物序列如下：
5’-ACTCCTCCCCTCTGTTG-3’(SEQ ID NO:3)
5’-TTCGGCTCTTGGTAAAAT-3’(SEQ ID NO:4)
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8突变位点PCR反应体系
反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：
针对CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K位点的PCR扩增程序如下：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→49℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
针对CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点的PCR扩增程序如下：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→50℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9 BigDye反应体系
试剂 PCR产物纯化后DNA 3.2pmol/μL测序引物 BigDye 5×BigDye测序缓冲液 <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>
体积 2.0μL 1.0μL 0.5μL 2.0μL 4.5μL
测序PCR循环条件：
第一步：96℃，1分钟；
第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；
2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；
3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；
4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序。
测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物：
针对CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K位点的测序引物序列如下：
5’-AACTTCAGGCTCCCCAACG-3’(SEQ ID NO:5)；
5’-CCTCGTAGATGCCTTCTTT-3’(SEQ ID NO:6)。
针对CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点的测序引物序列如下：
5’-CATTTGGGAAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO:7)；
5’-CCCTCCTCTGGGCAAAT-3’(SEQ ID NO:8)。
9、结果分析
Sanger测序结果显示，1号家系中1名男性患者CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K位点基因型是“c.1595C>A”半合子突变；1号家系中2名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和exon11:c.1873C>T:p.L625F位点基因型是“野生型”。图2测序图中箭头所指位置A层显示家系患者CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K位点基因型是“c.1595C>A”半合子突变，图2中B、C层中先证者父母该基因位点为野生型。
Sanger测序结果显示，2号家系中1名男性患者CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点基因型是“c.1873C>T”半合子突变；2号家系中3名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点基因型是“野生型”。图4测序图中箭头所指位置A层显示家系中患者CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点基因型是“c.1873C>T”半合子突变，图4中B、C和D层显示家系中正常个体CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点基因型是“野生型”。
实施例5
Raynaud-Claes综合征诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
1)扩增引物：如实施例3所示
2)缓冲液
3)Taq酶
4)dNTPs
5)CLCN4:c.1595C>A和c.1873C>T阳性突变参考品DNA，c.1595C>A阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示：
c.1873C>T阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示：
其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为点突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。
6)测序引物：如实施例3所示
2、使用方法：
共筛查和检测18个癫痫家系中56位个体，并再次发现如下家系，并将本试剂盒应用于3号和4号家系基因突变检测。
表10Raynaud-Claes综合征3号与4号家系成员的临床信息
如图5、图7所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者。
3号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅱ1外周血DNA和用于该试剂盒检测；
4号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1外周血DNA和Ⅱ2羊水DNA用于该试剂盒检测。
1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。
2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；
3)对PCR扩增产物进行纯化；
4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；
5)对BiyDye反应产物纯化；
6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
试剂盒检测结果显示，3号家系中先证者CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K位点基因型是“c.1595C>A”半合子突变。图6测序图中C层箭头所指位置显示家系中先证者CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K位点基因型是“c.1595C>A”半合子突变；检测结果确认先证者为Raynaud-Claes综合征患者，先证者父母基因型为野生型，为正常个体。患者父母以后出生Raynaud-Claes综合征患者的概率低，但建议以后如需再生育，需来医院行产前诊断。
试剂盒检测结果显示，4号家系中先证者CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点基因型是“c.1873C>T”半合子突变。图8测序图中A层箭头所指位置显示家系中先证者CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点基因型是“c.1873C>T”半合子突变；检测结果确认先证者为Raynaud-Claes综合征患者，先证者父亲、母亲及胎儿未检测到上述突变。遗传咨询建议先证者父母继续妊娠，并做好妊娠期监测。出生后随访结果表明，新生儿未见Raynaud-Claes综合征相关表型。
由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的CLCN4基因突变体，且确认了新突变体与Raynaud-Claes综合征的发病密切相关，所述致病突变体可用于Raynaud-Claes综合征的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基因CLCN4复合杂合突变位点在制备Raynaud-Claes综合征诊断试剂或制备防治Raynaud-Claes综合征的药物中的应用，所述基因CLCN4复合杂合突变位点为CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F。
2.一种用于检测Raynaud-Claes综合征的致病基因CLCN4复合杂合突变位点的试剂，其特征在于，包括检测致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的引物和检测致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的引物；
所述检测致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的引物包括核苷酸序列如SEQID NO:1所示的CLCN4-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CLCN4-1R；
所述检测致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的引物包括核苷酸序列如SEQID NO:3所示的CLCN4-2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CLCN4-2R。
3.根据权利要求2所述试剂，其特征在于，还包括测序引物；
所述测序引物包括致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的测序引物和/或致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的测序引物；
所述致病基因CLCN4突变位点c.1595C>A:p.T532K的测序引物包括核苷酸序列如SEQID NO:5所示的CLCN4-Seq1F和核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示的CLCN4-Seq1R；
所述致病基因CLCN4突变位点c.1873C>T:p.L625F的测序引物包括核苷酸序列如SEQID NO:7所示的CLCN4-Seq2F和核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示的CLCN4-Seq2R。
4.一种Raynaud-Claes综合征诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述试剂和PCR扩增试剂。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶；
所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/LKCl、pH8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2。
6.权利要求2或3所述试剂在制备检测Raynaud-Claes综合征的致病基因CLCN4突变位点的试剂盒中的应用。
7.一种检测致病基因CLCN4复合杂合突变位点的引物在制备辅助诊断Raynaud-Claes综合征的试剂盒中的应用，所述致病基因CLCN4复合杂合突变位点为CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述引物为权利要求2或3所述试剂。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述辅助诊断Raynaud-Claes综合征的方法，包括以下步骤：用所述试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有Raynaud-Claes综合征的风险：
若男性个体检测基因型是CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1595C>A:p.T532K和CLCN4:NM_001830.4:exon11:c.1873C>T:p.L625F位点的基因型是“c.1595C>A半合子突变”或“c.1873C>T半合子突变”，则为患者；若女性该位点的基因型是“c.1595C>A杂合子突变”或“c.1873C>T杂合子突变”，则为女性患者；若该位点的基因型是“野生型”，则个体为正常人。
10.根据权利要求7～9任意一项所述的应用，其特征在于，所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
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