CN116377050A - 一种发育性癫痫性脑病2型致病基因cdkl5突变位点的应用及其检测试剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种发育性癫痫性脑病2型致病基因CDKL5突变位点的应用及其诊断试剂，属于基因诊断技术领域。本发明通过外显子组测序技术首次发现了CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点突变可以导致发育性癫痫性脑病2型(MIM300672)。本发明提供的检测致病基因CDKL5突变位点试剂可以用于筛查或诊断发育性癫痫性脑病2型致病基因突变携带者或患者，以指导患者治疗和帮助优生优育，为发育性癫痫性脑病2型的发病机制研究提供了新的基础和途径，为发育性癫痫性脑病2型的治疗提供新的理论依据，可以为治疗发育性癫痫性脑病2型提供可能的药物靶点。

Description

一种发育性癫痫性脑病2型致病基因CDKL5突变位点的应用及 其检测试剂和应用
技术领域
本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种发育性癫痫性脑病2型致病基因CDKL5突变位点的应用及其检测试剂和应用。
背景技术
发育性癫痫性脑病2型(Developmental and epileptic encephalopathy 2，DEE2；OMIM 300672)是一种罕见X连锁显性遗传病，在活产婴儿中发病率大约为1/42400，全世界患者至今估计超过2万，女性杂合子发病多见，女性患病率是男性的4倍，男性半合子表型更为严重，男性胎儿一般较难存活。CDKL5基因(MIM 300203)变异造成蛋白的功能丧失是其致病机制。CDKL5基因突变可导致X染色体显性遗传的发育性和癫痫性脑病2型临床表现为出生后几个月癫痫发作和严重的整体发育迟缓，导致智力发育受损和运动控制不良。其他特征包括语言发展匮乏、畸形面部特征、睡眠障碍、胃肠道问题和刻板的手部动作等。
DEE2主要症状是早发性癫痫，而且大多为药物难治性癫痫，只有极少部分的患儿无癫痫发作。癫痫发作的首发中位年龄为6周(1周至1.5岁)，90％的癫痫发作时间为生后3个月内。该类癫痫一般有着三个连续阶段:第一阶段，发作间期脑电图正常的早期癫痫(发作1～10周)；第二阶段，伴有婴儿痉挛和脑电图高峰失律的癫痫性脑病；第三阶段难治性强直性癫痫发作和肌阵挛。主要的非癫痫临床表现为认知障碍、运动发育落后、视觉受损、自主神经功能障碍和孤独症样表现等。
CDKL5基因(MIM 300203)定位于染色体Xp22.13，基因全长228.0kb，包含21个外显子和20个内含子，编码1030个氨基酸组成的CDKL5蛋白，其蛋白序列包括催化域中的ATP结合位点、丝氨酸-苏氨酸激酶活性位点、T-X-Y基序、核定位信号、核输出信号和信号肽酶Ⅰ丝氨酸活性位点。CDKL5蛋白主要位于细胞核中，广泛分布于大脑皮层、海马体、小脑、丘脑和脑干，是细胞周期调控中的重要因子，参与神经元的迁移、形成和生长，以及大脑成熟过程中突触的发育和功能。CDKL5突变可引起CDKL5蛋白失去功能或完全缺失，从而导致CDKL5缺乏症(CDKL5 deficiency disorder，CDD)/发育性癫痫性脑病2型。CDKL5基因突变包括错义突变、无义突变、移码突变等。也发现和收录CDKL5变异有数百种种，其中以错义突变和无义突变为主。根据CDKL5的功能丧失情况，突变可分为4种类型。A组：第172个氨基酸前出现截短突变导致催化区域功能丧失或整个基因缺失；B组：催化区域内的错义突变或框内突变(如缺失导致一部分激酶区域功能丧失但其后的蛋白编码完整)；C组：第172～781个氨基酸之间的截短突变，包括移码突变、无义突变等突变类型导致C末端区域丢失但仍有激酶活性；D组：第781～905个氨基酸之间的截短突变，保留了激酶活性及大部分C端区域。
基因突变是导致发育性癫痫性脑病2型发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊发育性癫痫性脑病2型的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，现有技术中对基因突变位点基因型的检测，可以采用其他方法限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等等，但这些检测方法均不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的目的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的发育性癫痫性脑病2型致病基因CDKL5突变位点c.2414delA在制备发育性癫痫性脑病2型诊断试剂或制备防治发育性癫痫性脑病2型的药物中的应用，为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
本发明的目的还在于提供一种用于发育性癫痫性脑病2型基因诊断的试剂，可准确检测突变位点的基因型，为诊断个体是否患有发育性癫痫性脑病2型提供有效工具。
本发明提供了一种基因CDKL5突变位点在制备发育性癫痫性脑病2型诊断试剂或制备防治发育性癫痫性脑病2型的药物中的应用，所述基因CDKL5突变位点为CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32。
本发明提供了一种用于检测导致发育性癫痫性脑病2型的致病基因突变位点的试剂，所述试剂是扩增致病基因CDKL5突变位点c.2414delA的引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的CDKL5-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDKL5-R。
优选的，所述试剂包括测序引物，所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDKL5-SeqF和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDKL5-SeqR。
本发明提供了一种发育性癫痫性脑病2型诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括所述的试剂。
优选的，所述试剂还包括PCR扩增试剂。
优选的，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶；
所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/LKCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2。
本发明提供了所述的试剂在制备发育性癫痫性脑病2型诊断试剂盒中的应用。
优选的，利用所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有发育性癫痫性脑病2型，所述基因突变位点是CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32，当检测结果为“c.2414delA半合子突变”，且为男性个体，则诊断患有发育性癫痫性脑病2型，当检测结果为“c.2414delA半合子突变”，且为女性个体，则诊断发育性癫痫性脑病2型携带者；当检测结果未发生突变时，不论男女，个体为正常人。
优选的，所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
本发明提供了所述的试剂在制备检测CDKL5基因突变的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种基因CDKL5突变位点在制备发育性癫痫性脑病2型诊断试剂或制备防治发育性癫痫性脑病2型的药物中的应用，所述基因CDKL5突变位点为CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32。本发明首次基因CDKL5复合杂合突变c.2414delA可以导致发育性癫痫性脑病2型发病。因此所述突变位点作为分子标记物用于诊断发育性癫痫性脑病2型。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，可以将发育性癫痫性脑病2型患者、携带者和正常人群区分开，用于遗传学上发育性癫痫性脑病2型的筛查或诊断，以提供优生优育和治疗干预指导。特别地，本发明所提供的诊断试剂或试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断发育性癫痫性脑病2型。另一方面，本发明为发育性癫痫性脑病2型的发病机制研究奠定了重要基础，为发育性癫痫性脑病2型患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗发育性癫痫性脑病2型提供可能的药物靶点。
本发明还提供了相应的诊断试剂盒，助力发育性癫痫性脑病2型基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
附图说明
图1显示发育性癫痫性脑病2型1号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，●表示女性患者，↗表示先证者。
图2显示利用Sanger测序检测1号家系CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点基因型的结果图，其中，C层：1号家系中杂合子突变者；A和B层：1号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
图3显示发育性癫痫性脑病2型2号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者。
图4显示利用Sanger测序检测2号家系CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32:p.G121S位点基因型的结果图，其中，C层：2号家系中半合子突变者；A、B和D层：2号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
具体实施方式
本发明提供了一种基因CDKL5突变位点在制备发育性癫痫性脑病2型诊断试剂或制备防治发育性癫痫性脑病2型的药物中的应用，所述致病基因CDKL5突变位点为CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32。
在本发明中，根据CDKL5突变位点c.2414delA上下游序列设计特异性扩增引物或者特异性检测探针来制备诊断试剂。
在本发明中，所述c.2414delA突变是指野生型CDKL5基因的第17号外显子的第2414位碱基A缺失，形成CDKL5基因突变体，所述CDKL5基因突变体的核苷酸序列优选如SEQID NO:6(cgttgc□gaaatc)所示(方框为缺失不同发生位点)。本发明所述CDKL5突变体蛋白与野生型CDKL5基因编码的蛋白相比，第805位氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)，即所述CDKL5突变体蛋白含有p.Q805Rfs*32的突变，所述突变是由于c.2414delA的移码突变引起的；所述CDKL5突变体蛋白的氨基酸序列如
Figure BDA0004002173520000021
所示(加粗下划线字母为移码突变第一个氨基酸，加粗斜体字母为移码突变氨基酸序列)。
本发明提供了一种用于发育性癫痫性脑病2型基因诊断的试剂，所述试剂是扩增致病基因CDKL5复合杂合突变c.2414delA的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(ATGGAATGAGGATACGACA)所示的CDKL5-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2(ATTTATGGGCTGGGACT)所示的CDKL5-R。所述试剂优选包括测序引物，所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3(TTTACTGGGTTATTTGAGTTTTG)所示的CDKL5-SeqF、核苷酸序列如SEQ ID NO:4(ATGGGTCACTGAAGCAAGAT)所示的CDKL5-SeqR。所述试剂优选还包括PCR扩增试剂。所述PCR扩增试剂包括但不限于dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶。10×PCR缓冲液包括以下组分的水溶液：500mmol/LKCl、100mmol/LTris-Cl(pH 8.3)和15mmol/LMgCl2。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法获得即可。
本发明提供了所述的试剂在制备发育性癫痫性脑病2型诊断试剂盒中的应用。
在本发明中，所述诊断方法优选利用所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有发育性癫痫性脑病2型，所述基因突变位点是CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32，当检测结果为“c.2414delA半合子突变”，且为男性个体，则诊断患有发育性癫痫性脑病2型，当检测结果为“c.2414delA半合子突变”，且为女性个体，则诊断发育性癫痫性脑病2型携带者；当检测结果“c.2414delA纯合子突变”，说明个体为女性，判断为个体为患者；当检测结果未发生突变时，不论男女，则个体为正常人。
在本发明中，所述样本优选为血液、羊水和活检样本中的至少一种。
本发明提供了所述的试剂在制备检测CDKL5基因突变的试剂盒中的应用。
在本发明中，检测CDKL5基因突变的方法，优选包括以下步骤：
提取待检样本基因组DNA；
以基因组DNA为模板，用上述方案中所述试剂扩增CDKL5基因序列；
将CDKL5基因的扩增产物进行DNA测序；
将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，结果完全一致时说明待检样本中CDKL5基因未发生突变为野生型，当比对结果出现CDKL5基因(NM_004208.4)第17号外显子2414位碱基A缺失时说明CDKL5基因发生了突变，需进一步结合患者性别判断患病情况。
在本发明中，所述扩增CDKL5基因序列的方法优选为PCR法，所述PCR扩增CDKL5基因序列的反应体系为10×PCR缓冲液2.0μL、10mmol/L dNTPs 0.4μL、100ng/μL CDKL5-1F0.5μL、100ng/μLCDKL5-1R 0.5μL、100ng/μL抽提DNA 1.0μL、5U/μL Taq酶0.2μL、ddH2O15.4μL。针对CDKL5:NM_004208.4:exon14:c.2414delA位点的PCR扩增程序如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→50℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃保温。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，指基因序列或DNA序列中一个或数个(例如几个)碱基的添加、缺失和/或置换，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。术语“突变”当用于描述基因所编码的产物或者蛋白质时，“突变”指的是所述蛋白质或编码产物中一个或数个(例如几个)氨基酸残基的添加、缺失和/或置换。
在本发明中，术语“半合子突变”是指突变存在性染色体中，由于男性只有一条X染色体，基因为单价，没有相应的等位基因，这种突变则称为“半合子突变”。
在本发明中，术语“杂合子突变”/“杂合突变”是指是等位基因中只有其中一个基因出现突变。
文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，
术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增CDKL5基因是指，在PCR反应中引物只扩增CDKL5基因，而不扩增其他基因。
下面结合实施例对本发明提供的一种发育性癫痫性脑病2型致病基因CDKL5突变位点的应用及其诊断试剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
样本获取
发明人发现了1个发育性癫痫性脑病2型家系(简称1号家系)，家系部分成员的临床信息见表1。图1显示了CDKL5基因突变家系图谱，其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，●表示女性患者，↗表示先证者。
1.诊断标准：
可参照《人类单基因遗传疾病》2010年版。
发育性癫痫性脑病2型为X连锁显性遗传的严重神经系统疾病，临床主要表现为早期婴儿期难治性癫痫，肌张力低下，严重智力发育落后、运动障碍以及自闭症表现等。
表1发育性癫痫性脑病2型1号家系成员的临床信息
Figure BDA0004002173520000041
如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
1号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅱ1外周血DNA用于测序。
实施例2外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2仪器设备一览表
Figure BDA0004002173520000042
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。
3.试剂配方
5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
试剂 Tris 硼酸 EDTA(pH8.0,0.5mol/L) ddH2O
体积/重量 5.4g 750mg 2mL 90mL
用ddH2O将最终体积调整为100mL。
0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释10倍即可。
10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
试剂 NH4Cl KHCO3 EDTA 加ddH2O
体积/重量 82.9g 10g 0.37g 至1000mL
高压灭菌，4℃保存。
1×细胞核裂解液按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
试剂 2MTris-HCl，pH8.2 4MNaCl 2mMEDTA
体积/重量 0.5mL 10mL 0.4mL
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ1、Ⅰ2及Ⅱ1成员外周血DNA作为研究样品。
4.1样本DNA提取
1)将样本3-5mL装入15mL离心管中，加2-3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。对于羊水样本直接进入下一步。
2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；
2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；
3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；
4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到具有致病意义的基因突变CDKL5:NM_003159.3:exon17:
c.2414delA:p.Q805Rfs*32；其中exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32的突变位于CDKL5基因的第17号外显子的第2414位碱基A缺失，可导致移码突变，所编码的蛋白质第805氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)，在31位氨基酸后终止。
在1号家系女性患者个体中CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.
Q805Rfs*31位点的基因型是“c.2414delA杂合子突变”，在CDKL5家系正常个体中该位点的基因型是“野生型”。
实施例3
Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对CDKL5:NM_
003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系3名人员(先证者、先证者母亲、先证者父亲)和100名家系外正常人进行CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1、DNA提取
按照实施例1的方法提基因组DNA。
2、候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。
2.2针对突变位点c.2414delA设计20对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。
表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
Figure BDA0004002173520000061
Figure BDA0004002173520000071
注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：
①引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；
②G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；
③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；
④引物内部不应出现互补序列；
⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；
⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
2.3候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。
表7引物检测PCR反应体系
Figure BDA0004002173520000072
Figure BDA0004002173520000081
反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10-15分钟。
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价：
1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；
2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中两位点1号对候选引物)作为突变家系检测用引物：
针对CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点的PCR扩增引物序列如下：
5’-ATGGAATGAGGATACGACA-3’(SEQ ID NO：1)
5’-ATTTATGGGCTGGGACT-3’(SEQ ID NO：2)。
3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8突变位点PCR反应体系
Figure BDA0004002173520000091
/>
反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：
针对CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点的PCR扩增程序如下：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→50℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9BigDye反应体系
Figure BDA0004002173520000092
Figure BDA0004002173520000101
测序PCR循环条件：
第一步：96℃，1分钟；
第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；
2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；
3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；
4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序。
测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物：
针对CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点的测序引物序列如下：
5’-TTTACTGGGTTATTTGAGTTTTG-3’(SEQ ID NO:3)；
5’-ATGGGTCACTGAAGCAAGAT-3’(SEQ ID NO:4)。
9、结果分析
Sanger测序结果显示，1号家系中1名女性患者CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点基因型是“c.2414delA的杂合突变”；家系2名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点基因型是“野生型”。图2测序图中箭头所指位置C层显示家系患者CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点基因型是“c.2414delA杂合子突变”，图2中先证者父母亲该基因位点为野生型。
实施例4
发育性癫痫性脑病2型诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
1)扩增引物(每条引物1.2μg)：如实施例3所示；
2)缓冲液(500μL的10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)，15mmol/LMgCl2)；
3)Taq酶(20U)；
4)dNTPs(四种dNTP各4mM)；
5)CDKL5:c.2414delA阳性突变参考品DNA，该阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示：
Figure BDA0004002173520000102
其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框为点突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。
6)测序引物：如实施例3所示。
2、使用方法：
共筛查和检测18个癫痫家系中56位个体，并再次发现契合本发明的家系，并以2号家系为实施例阐述基因突变检测试剂盒的应用。
表10发育性癫痫性脑病2型2号家系成员的临床信息
Figure BDA0004002173520000111
如图3所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。其中，□表示男性正常个体，○表示女性携带者，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者。
2号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1外周血DNA和Ⅱ2羊水DNA用于该试剂盒检测。
1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。
2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；
3)对PCR扩增产物进行纯化；
4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；
5)对BiyDye反应产物纯化；
6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
试剂盒检测结果显示，2号家系中先证者CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点基因型是“c.2414delA”半合子突变。图4测序图中C层箭头所指位置显示家系中先证者CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32位点基因型是“c.2414delA”半合子突变；检测结果确认先证者为发育性癫痫性脑病2型患者，先证者父亲、母亲、胎儿基因型为野生型，为正常个体。该突变为新发突变，但不能排除低比例嵌合的点突变，遗传咨询意见为先证者母亲继续妊娠，并做好孕期监测，出生后随访结果提示，该婴儿未见发育性癫痫性脑病2型相关表型；尽管患者父母以后生发育性癫痫性脑病2型患者的概率低，但建议以后如需再生育需来医院行产前诊断。
由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的CDKL5基因突变体，且确认了新突变体与发育性癫痫性脑病2型的发病密切相关，所述致病突变体可用于发育性癫痫性脑病2型的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基因CDKL5突变位点在制备发育性癫痫性脑病2型诊断试剂或制备防治发育性癫痫性脑病2型的药物中的应用，所述基因CDKL5突变位点为CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32。
2.一种用于检测导致发育性癫痫性脑病2型的致病基因突变位点的试剂，其特征在于，所述试剂是扩增致病基因CDKL5突变位点c.2414delA的引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的CDKL5-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDKL5-R。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括测序引物，所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDKL5-SeqF和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDKL5-SeqR。
4.一种发育性癫痫性脑病2型诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括权利要求2或3所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括PCR扩增试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶；
所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/LKCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2。
7.权利要求2或3所述的试剂在制备发育性癫痫性脑病2型诊断试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有发育性癫痫性脑病2型，所述基因突变位点是CDKL5:NM_003159.3:exon17:c.2414delA:p.Q805Rfs*32，当检测结果为“c.2414delA半合子突变”，且为男性个体，则诊断患有发育性癫痫性脑病2型，当检测结果为“c.2414delA半合子突变”，且为女性个体，则诊断发育性癫痫性脑病2型携带者；当检测结果未发生突变时，不论男女，则个体为正常人。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样本为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
10.权利要求2或3所述的试剂在制备检测CDKL5基因突变的试剂盒中的应用。
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