CN116004788B

CN116004788B - 一种Angelman综合症致病基因UBE3A突变位点的应用及其诊断试剂

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Publication number: CN116004788B
Application number: CN202210914145.7A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 刘鑫林; 薛斌
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-08-01
Filing date: 2022-08-01
Publication date: 2024-05-31
Anticipated expiration: 2042-08-01
Also published as: CN116004788A

Abstract

本发明提供了一种Angelman综合症致病基因UBE3A突变位点的应用及其诊断试剂，属于基因诊断技术领域。本发明首次证实UBE3A基因突变位点:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L和UBE3A:NM_000462.4:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5导致Angelman综合征发病。该突变位点在制备Angelman综合征诊断试剂或制备防治Angelman综合征的药物中的应用。针对该突变位点的检测试剂用于快速有效预测或诊断Angelman综合征，为Angelman综合征的发病机制研究奠定了重要基础，也为治疗Angelman综合征提供可能的药物靶点。

Description

一种Angelman综合症致病基因UBE3A突变位点的应用及其诊断试剂

技术领域

本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种Angelman综合症致病基因UBE3A突变位点的应用及其诊断试剂。

背景技术

Angelman综合征(angelman syndrome，AS)(MIM 105830)又称快乐木偶综合征，是一种遗传异常所致的神经发育障碍性疾病，属于非进展性脑病。特征性表现为智力低下、快乐行为、严重语言障碍、共济失调、睡眠障碍及癫痫发作等。发病率约为1/20000-1/12000。

Angelman综合征主要临床特征为：

1)典型表现(100％)：严重生长发育迟缓；语言障碍，无或仅能说少量词语接受非言语交往的能力较言语交往的能力高；活动或平衡障碍，通常步态不稳或四肢震颤；频繁大笑，明显的兴奋动作；易激惹，常伴有手扑翼样运动；多动，注意力仅能短暂集中。

2)常见表现(≥80％)：头围生长延迟，不对称通常导致小头畸形；癫痫发作，通常3岁前开始，伴有大量慢性棘波和三相波。

3)相关表现(20％-80％)：枕部扁平，枕沟；喜欢吐舌，吮吸或吞咽障碍，婴儿期喂养困难；突颌，大口牙间隙宽，频繁流延，过度咀嚼；皮肤色素减少，与家人相比头发和颜色颜色浅(仅见于缺失的病例)；下肢过度活动，腱反射亢进；举上肢时屈肘，尤其是在行走时；热敏感增强，睡眠紊乱，对水感兴趣。

主要由基因缺陷引起，源于15q11-q13 UBE3A基因(MIM 601623)表达异常或功能缺陷，本病由母系单基因遗传缺陷所致，如来自母亲的第15号染色体印迹基因区15q部分缺陷，或同时拥有两条来自父亲的带有此缺陷的第15号染色体。

Angelman综合征的遗传学发病机制类型有：

Ⅰ型(缺失型)：母源15号染色体q11.2-13区域约5-7Mb缺失，约占68％。

Ⅱ型(UPD型)：q11.2-13区域父源单亲二倍体(uniparental disomy，UPD)所致，即患者的两条15号染色体或15号染色体q11.2-13片段均来自父亲，约占7％。

Ⅲ型(ID型)：印迹缺陷(imprinting defects)所致，患者虽然从双亲各遗传了1条15号染色体，但母源15号染色体q11.2-13区域内的印迹中心(imprinting center)呈现DNA甲基化异常或基因表达缺失，通常为6-200kb微缺失，约占3％。

Ⅳ型(UBE3A突变型)：UBE3A基因突变所致，基因内大片段缺失/重复或整个基因缺失/重复突变罕见，通常表现为UBE3A基因点突变或小的插入缺失，约占11％。

另有10％的患者遗传机制不明确。

根据不同的遗传学异常，可采用不同的遗传学检测方法，包括FISH、array CGH、SNP array、甲基化PCR和测序等方法。对于UBE3A突变型最常用的间的方法是测序法。

UBE3A基因位于染色体15q11.2，基因全长105.3kb，编码泛素蛋白连接酶E3A，泛素蛋白连接酶是靶向细胞内其他蛋白质分解(降解)的酶，这些酶将泛素小分子附着在应该被降解的蛋白质上，这种带上泛素标签的蛋白质被识别并消化降解。蛋白质降解是细胞正常的生理过程，可去除受损或不必要的蛋白质，以维持细胞正常功能。泛素蛋白连接酶E3A在神经系统的正常发育和功能中起关键作用，它有助于调节蛋白质合成和降解的平衡，当UBE3A异常或功能缺陷时则影响该平衡系统，引起患者黑质、纹状体、海马及小脑浦肯野细胞蛋白泛素化异常。人们通常继承两个拷贝的UBE3A基因，父源和母源每个亲本各一个。UBE3A基因的两个拷贝都在大多数身体细胞组织中活跃表达，然而在大脑的某些区域，只有母源副本UBE3A基因才有效，这种亲本特异性基因激活是由基因组印记所导致。

因此，基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断和发现基因突变是确诊Angelman综合征的重要标准。针对不同突变建立相应的检测技术是全面诊断Glass综合征的必要手段。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的Angelman综合征致病基因UBE3A突变位点UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L或UBE3A:NM_000462.4:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5在制备Angelman综合征诊断试剂或制备防治Angelman综合征的药物中的应用。

本发明提供了一种Angelman综合征致病基因UBE3A突变位点UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L或UBE3A:NM_000462.4:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5在制备Angelman综合征诊断试剂或制备防治Angelman综合征的药物中的应用。

本发明提供了一种用于Angelman综合征基因诊断的试剂，所述试剂是扩增UBE3A基因突变位点UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L和exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的UBE3A-1F和核苷酸序列如SEQID NO:2所示的UBE3A-1R。

优选的，所述试剂包括测序引物，所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的UBE3A-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的UBE3A-Seq1R。

优选的，所述试剂还包括PCR扩增试剂。

本发明提供了所述的试剂在制备Angelman综合征诊断试剂盒中的应用。

优选的，利用所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有Angelman综合征，所述基因突变位点是UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L或exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5，当UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点的基因型是“c.469T>C杂合子”，则判断UBE3A基因存在突变，若突变点位于母源染色体上则个体为患者；若位点的无突变，则判断UBE3A基因为野生型，个体是正常人；

或者当UBE3A:NM_000462:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点的基因型是“c.556dupG杂合子”，则判断UBE3A基因存在突变，若突变点位于母源染色体上则个体为患者；若位点的无突变，则判断UBE3A基因为野生型，个体是正常人。

优选的，所述样本为血液和/或羊水。

本发明提供了一种Angelman综合征诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括所述的试剂。

本发明首次UBE3A突变位点UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L或UBE3A:NM_000462.4:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点突变可以导致Glass综合征发病。因此所述突变位点作为分子标记物用于诊断Angelman综合征。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，用于遗传学上Angelman综合征的筛查或诊断，以指导治疗。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断Angelman综合征。另一方面，本发明为Angelman综合征的发病机制研究奠定了重要基础，为Glass综合征患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗Angelman综合征提供可能的药物靶点。

本发明还提供了相应的诊断试剂盒，助力Angelman综合征基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

附图说明

图1为Angelman综合征1号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者个体，◇表示正常胎儿，↗表示先证者。

图2为Angelman综合征2号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者个体，◇表示正常胎儿，↗表示先证者。

图3为1号家系利用Sanger测序检测UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型的结果图，其中，C：家系中Angelman综合征患者；A、B、D：家系中正常个体(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

图4为2号家系利用Sanger测序检测UBE3A:NM_000462:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点基因型的结果图，其中，C：家系中Angelman综合征患者；A、B、D和E：家系中正常个体(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

图5为Angelman综合征3号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者个体，↗表示先证者。

图6为Angelman综合征4号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，表示无表型携带基因突变的女性个体，/>表示死亡男性患者，■表示男性患者个体，↗表示先证者。

图7为3号家系利用试剂盒检测UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型的结果图，其中，C：家系中Angelman综合征患者；A和B：家系中正常个体(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

图8为4号家系利用试剂盒检测UBE3A:NM_000462:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点基因型的结果图，其中，C：家系中Angelman综合征患者；B：家系中携带该突变但无表型的个体；A：家系中正常个体(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

具体实施方式

在本发明中，所述c.469T>C突变是指野生型UBE3A基因的第7号外显子的第469位碱基由T突变为C，形成UBE3A基因突变体，所述基因UBE3A突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO:7(GAGTTCTTTCT)所示。本发明所述UBE3A突变体蛋白与野生型UBE3A基因编码蛋白相比，UBE3A蛋白质第157位氨基酸残基由苯丙氨酸(F)突变为亮氨酸(L)，即所述的UBE3A突变体蛋白含有p.F157L的突变，所述突变是由于c.469T>C突变引起的；所述的UBE3A突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8(GRVLSSA)。

本发明所述c.556dupG突变是指野生型UBE3A基因的第7号外显子的第556位碱基G重复，形成UBE3A基因突变体，所述基因UBE3A突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:9(AAGATGGAAGAC)所示。本发明所述UBE3A突变体蛋白与野生型UBE3A基因编码蛋白相比，UBE3A蛋白质第186位氨基酸残基由谷氨酸(E)突变为甘氨酸(G)，并造成后续移码突变，在后面5位氨基酸残基后终止，即所述的UBE3A突变体蛋白含有p.E186Gfs*5的突变，所述突变是由于c.556dupG突变引起的；所述的UBE3A突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:10(KDGRQR)。

本发明提供了一种用于Angelman综合征基因诊断的试剂，所述试剂是扩增UBE3A基因突变位点UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L和exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(TAGAATGTTTGGCTGTT)所示的UBE3A-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2(ATTGTTGTCTCCCTGTG)所示的UBE3A-1R。所述试剂优选包括测序引物，所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3(TGCAACAGAGTAAACATAC)所示的UBE3A-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:4(TTCTGAGTCTTCTTCCATA)所示的UBE3A-Seq1R。所述试剂优选还包括PCR扩增试剂。所述PCR扩增试剂包括但不限于dNTP、PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶。

在本发明中，所述诊断方法优选利用所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有Angelman综合征，所述基因突变位点是UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L或exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5，当UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点的基因型是“c.469T>C杂合子”，则判断UBE3A基因存在突变，若突变点位于母源染色体上则个体为患者；若位点的无突变，则判断UBE3A基因为野生型，个体是正常人；

或者当UBE3A:NM_000462:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点的基因型是“c.556dupG杂合子”，则判断UBE3A基因存在突变，若突变点位于母源染色体上则个体为患者；若位点的无突变，则判断UBE3A基因为野生型，个体是正常人。所述样本优选为血液和/或羊水。所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型的方法优选提取样本的基因组DNA，利用扩增引物进行PCR扩增，PCR产物经过DNA测序，根据测序结果判断基因型，当469位点同时存在TC，说明为469位点为TC基因型时，即存在c.469T>C杂合子”突变，或者当556位点为存在插入G突变杂合时，即556位点为“c.556dupG杂合子”基因型。基因突变位点未突变，属于野生型。

除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。

文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患胎的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。

文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。

在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，

术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增SATB2基因是指，在PCR反应中引物只扩增UBE3A基因，而不扩增其他基因。

下面结合实施例对本发明提供的一种Angelman综合症致病基因UBE3A突变位点的应用及其诊断试剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

样本获取

发明人发现了2个Angelman综合征家系(简称家系1和家系2)，该2个家系部分成员的临床信息见表1。图1显示了家系1图谱，图2显示了家系2图谱，其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者个体，◇表示正常胎儿，↗表示先证者。

1.诊断标准：

可参照《罕见病诊疗指南》2019年版：

1)诊断标准

符合AS临床诊断标准共识和(或)分子遗传学检测结果表明母源UBE3A等位基因存在表达或功能缺陷时，即可给予诊断。

AS临床诊断共识标准包括均出现表现(几乎全部患者均出现的表现)、经常性表现(超过80％患者出现的表现)以及相关性表现(少于80％患者出现的现)。均出现的表现包括发育迟滞、语言障碍、运动或平衡障碍，通常是步态障碍和(或)肢体颤动、行为独特包括频繁大笑/微笑；明显的快乐举止、易兴奋性，往往伴有手颤和运动过度行为等。经常性表现包括头围发育延迟、癫痫发作以及特征性异常脑电图(高波幅棘-慢波等)。相关性表现包括平枕/枕骨凹陷、下颌突出、宽嘴、齿缝稀疏、频繁流口水、过多的嘴部动作、肤色及发色浅淡、运动时屈曲手臂、睡眠障碍等。

表1 Angelman综合征1号和2号家系成员的临床信息

如图1、2所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

1号家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)、Ⅱ1(儿子/先证者)外周血DNA及Ⅱ2(胎儿)羊水DNA用于测序分析。

2号家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)、Ⅱ1(儿子/先证者)、Ⅱ2(妹妹)外周血及Ⅱ3(胎儿)DNA用于测序分析。

实施例2

外显子测序

2.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备一览表

3.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。

4.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	体积/重量
		Tris	5.4g
硼酸	750mg
		EDTA(pH8.0,0.5mol/L)	2.0mL
ddH₂O	90.0mL

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。

0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

试剂	体积/重量
		NH4Cl	82.9g
KHCO₃	10.0g
		EDTA	0.37g
加dH₂O	至1000mL

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	体积/重量
		2MTris-HCl，pH8.2	0.5mL
4MNaCl	10.0mL
		2mMEDTA	0.4mL

5.实验步骤

签署知情同意书后，采集1号家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)、Ⅱ1(儿子/先证者)外周血DNA及2号家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)、Ⅱ1(儿子/先证者)、Ⅱ2(妹妹)外周血成员的外周血3-5mL。采集1号家系Ⅱ2(胎儿)和号家系Ⅱ3(胎儿)羊水5-10mL。

5.1样本DNA提取

1)如为肝素抗凝外周血样本，则将外周血3-5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。如为羊水样本则直接进入下一步。

2)4℃，3000转/分离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

5.2外显子测序

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

5.3结果

最终在2个家系中得到2个具有致病意义的基因突变UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L和exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5；c.469T>C突变导致所编码的UBE3A蛋白质第157位氨基酸残基由苯丙氨酸变为亮氨酸，c.556dupG导致所编码的UBE3A蛋白质第168位氨基酸残基由谷氨酸变为甘氨酸，并造成后续移码突变，在后面5位氨基酸残基后终止。

在家系1患者个体中UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点的基因型是“c.469T>C杂合子”突变，根据家系人员全外显子测序数据对比分析发现突变位点位于母源染色体；在家系1正常个体中基因型是野生型。

在家系2患者个体中UBE3A:NM_000462:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点的基因型是“c.556dupG杂合子”突变，根据家系人员全外显子测序数据对比分析发现突变位点位于母源染色体；在家系2正常个体中基因型是野生型。

实施例3

Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L和exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点进行验证。分别对实施例1中的2个家系中9名人员和100名家系外正常人进行UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L和exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1的方法提基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3。

2.2针对c.469T>C和c.556dupG位点均位于第7个外显子中，两者非常靠近，相距只有60个碱基，故设计共同引物进行PCR检测，共设计20对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况

表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

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注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：

①引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；

②G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；

③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；

④引物内部不应出现互补序列；

⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；

⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

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反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5min；

第二步：30个循环(95℃，30sec→Tm，30sec→72℃，60sec)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。

第三步：72℃，7min；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10～15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中2位点1号)作为突变家系检测用引物，引物序列如下所示：

5’-TAGAATGTTTGGCTGTT-3’(SEQ ID NO：1)

5’-ATTGTTGTCTCCCTGTG-3’(SEQ ID NO：2)

3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变位点PCR反应体系

试剂	体积
		10×PCR缓冲液	2.0μL
10mmol/L dNTPs	0.4μL
		100ng/μL UBE3A-F(或UBE3A-F)	0.5μL
100ng/μL UBE3A-R(或UBE3A-R)	0.5μL
		100ng/μL抽提DNA	1.0μL
5u/μL Taq酶	0.2μL
		ddH2O	15.4μL

PCR反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5分钟；

第二步：30个循环(95℃，30秒→44℃，30秒→72℃，60秒)；

第三步：72℃，7分钟；

第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

试剂	用量
		PCR产物纯化后DNA	2.0μL
3.2pmol/μL测序引物	1.0μL
		BigDye	0.5μL
5×BigDye测序缓冲液	2.0μL
		ddH₂O	4.5μL

测序PCR循环条件：

第一步：96℃，1分钟；

第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；

第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc(Ph5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；

3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；

4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，测序引物序列如下所示：

5’-TGCAACAGAGTAAACATAC-3’(SEQ ID NO：3)

5’-TTCTGAGTCTTCTTCCATA-3’(SEQ ID NO：4)

9、结果分析

图3的Sanger测序结果和测序图中箭头所指位置显示，家系1中1名患者UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型是“c.469T>C杂合子”；家系3名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型是野生型。图3中A和B、D层显示家系中正常个体UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型是野生型，图3中C层显示Angelman综合征患者UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型是“c.469T>C杂合子”突变，根据实施例2的数据，该突变位于母源染色体上。

图4的Sanger测序结果和测序图中箭头所指位置显示，家系2中1名患者UBE3A:NM_000462:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点基因型是“c.556dupG杂合子”；家系4名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的UBE3A:NM_000462:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点基因型是野生型。图4中A、B、D和E层显示家系中正常个体UBE3A:NM_000462:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点基因型是野生型，图4中C层显示Angelman综合征患者UBE3A:NM_000462:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点基因型是“c.556dupG杂合子”突变，根据实施例2的数据，该突变位于母源染色体上。

实施例4

Angelman综合征诊断试剂盒

1、试剂盒组成：

1)扩增引物：如实施例3所示

2)缓冲液

3)Taq酶

4)dNTPs

5)UBE3A:c.469T>C和c.556dupG阳性突变参考品DNA该参考品为一段双链DNA，c.469T>C阳性突变参考品具体序列如下所示：

c.556dupG阳性突变参考品具体序列如下所示：

其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为点突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。

6)测序引物：如实施例3所示

2、使用方法：

试剂盒应用于另外2个家系的患者进行检测(见表10)。

表10 Angelman综合征3号和4号家系成员的临床信息

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如图5、6所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

3号家系人员Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ1(先证者)外周血DNA用于试剂盒检测。

4号家系人员Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ2(先证者弟弟)外周血DNA用于试剂盒检测。

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

图7的试剂盒检测序结果和测序图中箭头所指位置显示，家系3中1名患者UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型是“c.469T>C杂合子”；家系2名正常个体的UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型是野生型。图7中A和B层显示家系中正常个体UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型是野生型，图7中C层显示Angelman综合征患者UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型是“c.469T>C杂合子”突变。结合病史和家系图，检测结果表明该突变为新发突变，先证者父母再次妊娠后出生Angelman综合征患者的可能性低(<1％)。

图8的试剂盒检测结果和测序图中箭头所指位置显示，家系4中先证者弟弟UBE3A:NM_000462:exon7:c.556dupG:p.E186Gfs*5位点基因型是“c.556dupG杂合子”；图8中A显示家系中正常个体UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型是野生型，图8中C层显示Angelman综合征患者UBE3A:NM_000462:exon7:c.469T>C:p.F157L位点基因型是“c.469T>C杂合子”突变。结合病史和家系图，检测结果表明该突变是遗传自其母亲(突变位于母源染色体上)，同先证者一样，其弟弟也为Angelman综合征患者。先证者父母再次妊娠后出生Angelman综合征患者的可能性高(50％)，强烈建议先证者父母下次妊娠时行产前诊断。

由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的UBE3A基因突变体，且确认了新突变体与Angelman综合征的发病密切相关，所述致病突变体可用于Angelman综合征的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种基因UBE3A突变体作为检测靶点在制备Angelman综合征诊断试剂中的应用，所述基因UBE3A突变体为在登录号NM_000462.4所示核苷酸序列的编码区中第556位碱基G后插入一个碱基G。

2.一种用于Angelman综合征基因诊断的试剂，其特征在于，所述试剂包括扩增UBE3A基因突变体的引物和测序引物，所述扩增UBE3A基因突变体的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的UBE3A-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的UBE3A-1R；

所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的UBE3A-Seq1F和核苷酸序列如SEQID NO:4所示的UBE3A-Seq1R。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括PCR扩增试剂。

4.权利要求2或3所述的试剂在制备Angelman综合征诊断试剂盒中的应用。

5.一种Angelman综合征诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括权利要求2或3所述的试剂。