CN115873861B

CN115873861B - Pah致病突变体及在制备苯丙酮尿症诊断试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN115873861B
Application number: CN202211149350.5A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 刘鑫林; 何博; 刘亚宁
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-09-21
Filing date: 2022-09-21
Publication date: 2024-04-26
Anticipated expiration: 2042-09-21
Also published as: CN115873861A

Abstract

本发明涉及基因诊断技术领域，特别是涉及PAH致病突变体及在制备苯丙酮尿症诊断试剂盒中的应用。本发明通过外显子组测序技术首次发现了c.485C>A和c.1025C>G位点复合杂合突变可以导致苯丙酮尿症，以上述突变基因为靶点制备的诊断试剂或试剂盒，可以特异性区分苯丙酮尿症患者、携带者和正常人群，可用于快速、有效地预测或诊断苯丙酮尿症，可以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面，本发明为苯丙酮尿症的发病机制研究奠定了重要基础，为苯丙酮尿症患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明提供的PAH致病突变体可以为苯丙酮尿症的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

Description

PAH致病突变体及在制备苯丙酮尿症诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及基因诊断技术领域，特别是涉及PAH致病突变体及在制备苯丙酮尿症诊断试剂盒中的应用。

背景技术

苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)(MIM 261600)是由于苯丙氨酸羟化酶(phenyalanine hydroxylase，PAH)缺乏引起血苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)浓度增高，并引起一系列临床症状的常染色体隐性遗传病。苯丙酮尿症是高苯丙氨酸血症的主要类型。

本病的致病基因PAH基因(MIM 612349)定位于染色体12q23.2，基因全长121.6kb，包含13个外显子和12个内含子，编码452个氨基酸组成的苯丙氨酸羟化酶(PAH)。PAH基因变异导致PAH活性降低或缺乏是PKU的主要病因。苯丙氨酸是人体必需氨基酸，其代谢所需的苯丙氨酸羟化酶活性降低或缺乏，使苯丙氨酸不能转化为酪氨酸(tyrosine，Tyr)，酪氨酸及其他正常代谢产物合成减少，血液和羊水中Phe含量增加，影响中枢神经系统发育。同时次要代谢途径增强，生成苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸，并从尿中大量排出，苯乳酸使患儿的尿液具有特殊的鼠尿臭味。目前发现的基因突变类型包括点突变、缺失和插入基因突变等可以引起苯丙酮尿症。中国人群PAH基因突变主要集中在3、5、6、7、11、12号外显子，其中7号外显子突变率最高。常见的突变主要由R243Q、Y204C、R111X、R413P和Y356X等。

基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊苯丙酮尿症的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。但目前并没有能特异性区分苯丙酮尿症患者、携带者和正常人群的诊断试剂盒的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了PAH致病突变体及在制备苯丙酮尿症诊断试剂盒中的应用。利用本发明提供的PAH致病突变体制备的诊断试剂盒，可以助力苯丙酮尿症基因突变的筛查和诊断或辅助诊断，可以特异性区分苯丙酮尿症患者、携带者和正常人群。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种PAH致病突变体，所述PAH致病突变体包括c.485C>A和/或c.1025C>G；所述c.485C>A在登录号为NM_000277.3的5号外显子的第485位存在C>A突变；所述c.1025C>G在登录号为NM_000277.3的10号外显子的第1025位存在C>G突变。

本发明还提供了上述PAH致病突变体作为检测靶点在制备苯丙酮尿症诊断或辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了上述PAH致病突变体作为治疗靶点在制备治疗苯丙酮尿症药物中的应用。

本发明还提供了扩增上述PAH致病突变体的引物，所述引物包括引物对1和/或引物对2；所述引物对1包括PAH-1F和PAH-1R，所述引物对2包括PAH-2F和PAH-2R；所述PAH-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PAH-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述PAH-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述PAH-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了上述的引物在制备苯丙酮尿症诊断或辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种苯丙酮尿症的诊断或辅助诊断试剂，所述诊断或辅助诊断试剂包括上述的引物。

优选的，所述诊断或辅助诊断试剂还包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种。

本发明还提供了一种苯丙酮尿症的诊断或辅助诊断试剂盒，所述诊断或辅助诊断试剂盒包括上述的试剂和测序引物。

优选的，所述测序引物包括测序引物对1和/或测序引物对2；所述测序引物对1包括PAH-Seq1F和PAH-Seq1R，所述测序引物对2包括PAH-Seq1F和PAH-Seq1R；所述PAH-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述PAH-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PAH-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述PAH-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

优选的，所述诊断或辅助诊断试剂盒还包括DNA1和/或DNA2；所述DNA1的单链核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述DNA2的单链核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

有益效果：

本发明提供了一种PAH致病突变体，所述PAH致病突变体包括c.485C>A和/或c.1025C>G；所述c.485C>A在登录号为NM_000277.3的5号外显子的第485位存在C>A突变；所述c.1025C>G在登录号为NM_000277.3的10号外显子的第1025位存在C>G突变。本发明通过外显子组测序技术首次发现了PAH:NM_000277.3:exon5:c.485C>A:p.A162D和exon10:c.1025C>G:p.A342G位点复合杂合突变可以导致苯丙酮尿症，以上述突变基因为靶点制备的诊断或辅助诊断试剂或试剂盒，可以特异性区分苯丙酮尿症患者、携带者和正常人群，可用于快速、有效地预测或诊断或辅助诊断苯丙酮尿症，可以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面，本发明为苯丙酮尿症的发病机制研究奠定了重要基础，为苯丙酮尿症患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明提供的PAH致病突变体可以为苯丙酮尿症的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为苯丙酮尿症1号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者；

图2为利用Sanger测序检测1号家系c.485C>A位点基因型的结果图；

图3为利用Sanger测序检测1号家系c.1025C>G位点基因型的结果图；

图4为苯丙酮尿症2号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者；

图5为利用试剂盒检测2号家系c.485C>A位点基因型的结果图；

图6为利用试剂盒检测2号家系c.1025C>G位点基因型的结果图；

图2、图3、图5和图6中箭头所指为突变发生位置。

具体实施方式

本发明所述c.485C>A突变指野生型PAH基因的第5号外显子的第485位C突变为A，形成PAH基因突变体，所述PAH基因突变体的核苷酸序列优选包括SEQ ID NO.11所示(gtttgatgaca)的序列，其中下划线a为突变位点；所述野生型PAH基因的cDNA序列参见Genbank登录号为NM_000277.3的序列。

本发明所述c.485C>A突变导致所编码的蛋白质与野生型PAH基因所编码的蛋白质第162氨基酸由丙氨酸(A)突变为天冬氨酸(D)，记为p.A162D，即PAH致病突变体编码的部分氨基酸序列优选包括如SEQ ID NO.12所示(KQFDDIA)的序列，其中下划线的D为p.A162D。

本发明所述c.1025C>G突变指野生型PAH基因的第10号外显子的第1025位C突变为G，形成PAH基因突变体，所述PAH基因突变体的核苷酸序列优选包括SEQ ID NO.13所示(aaagggatatg)的序列，其中加粗的g为突变位点；所述野生型PAH基因的cDNA序列参见Genbank登录号为NM_000277.3的序列。

本发明所述c.1025C>G突变导致所编码的蛋白质与野生型PAH基因所编码的蛋白质第342氨基酸由丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)，记为p.A342G，即PAH致病突变体编码的部分氨基酸序列优选包括如SEQ ID NO.14所示(SIKGYGA)的序列，其中下划线的G为p.A342G。

本发明筛选的PAH致病突变体可以将苯丙酮尿症患者、携带者和正常人群区分开，可以作为诊断或辅助诊断苯丙酮尿症的生物标志物；还可以为苯丙酮尿症的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

本发明还提供了上述方案中所述的PAH致病突变体作为检测靶点在制备苯丙酮尿症诊断或辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。根据上述PAH致病突变体的基因突变位点上下游序列设计特异性扩增引物或者特异性检测探针，可以将苯丙酮尿症患者、携带者和正常人群区分开。

本发明还提供了上述方案中所述的PAH致病突变体作为治疗靶点在制备治疗苯丙酮尿症药物中的应用。

本发明提供了扩增上述PAH致病突变体的引物，所述引物包括引物对1和/或引物对2；所述引物对1包括PAH-1F和PAH-1R，所述引物对2包括PAH-2F和PAH-2R；

所述PAH-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：gagactttagttttagggta；

所述PAH-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：cggaggctgttttattc；

所述PAH-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：cgagtcccagaatccaaa；

所述PAH-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：caaatgctgtgagccaaa。

本发明提供的引物1可以特异性扩增含有c.485C>A位点的PAH基因或野生型PAH基因，引物2可以特异性扩增含有c.1025C>G位点的PAH基因或野生型PAH基因，从而可以特异性区分苯丙酮尿症患者、携带者和正常人群，可用于快速、有效地预测或诊断或辅助诊断苯丙酮尿症，可以提供优生优育和治疗干预指导。

本发明还提供了上述引物在制备苯丙酮尿症诊断或辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种苯丙酮尿症的诊断或辅助诊断试剂，所述试剂包括上述引物。

在本发明中，所述诊断或辅助诊断试剂优选还包括PCR扩增反应中的其他试剂，包括但不限于dNTPs，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶。本发明在具体实施过程中，可根据实际需要，常规选择其他试剂。

本发明还提供了一种苯丙酮尿症的诊断或辅助诊断试剂盒，所述诊断或辅助诊断试剂盒包括上述试剂和测序引物。

在本发明中，所述测序引物包括测序引物对1和/或测序引物对2；所述测序引物对1包括PAH-Seq1F和PAH-Seq1R，所述测序引物对2包括PAH-Seq1F和PAH-Seq1R；

所述PAH-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：taaccaagggaaggagacatg；

所述PAH-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：cagtgggtaattttgttttgtc；

所述PAH-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：ccctccagaaacaccct；

所述PAH-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：gagaatgagttcccaggttg。

本发明提供的测序引物1可以特异性对含有c.485C>A位点的PAH基因或野生型PAH基因进行测序，引物2可以特异性对含有c.1025C>G位点的PAH基因或野生型PAH基因进行测序。

在本发明中，所述诊断或辅助诊断试剂盒优选还包括c.485C>A位点阳性突变参考品DNA1和/或c.1025C>G位点阳性突变参考品DNA2；

所述DNA1的单链核苷酸序列优选如SEQ ID NO.9所示：

所述DNA2的单链核苷酸序列优选如SEQ ID NO.10所示：

其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。

本发明优选还提供了一种鉴定上述PAH致病突变体的基因型的方法，所述方法包括以下步骤：

以待测样品DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

将扩增产物进行测序，确定PAH致病突变体的基因型。

在本发明中，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括10×PCR缓冲液2μL、dNTPs 0.4μL、PAH-1F或PAH-2F 0.5μL、PAH-1R或PAH-2R 0.5μL、模板1μL、Taq酶0.2μL和余量的ddH₂O。

在本发明中，当所述PCR扩增的反应体系中的引物对为PAH-1F和PAH-1R时，所述PCR扩增的反应进程优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃反应7min；

当所述PCR扩增的反应体系中的引物对为PAH-2F和PAH-2R时，所述PCR扩增的反应进程优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃反应7min。

在本发明中，所述PCR缓冲液优选包括KCl500mmol/L、Tris-HCl100mmol/L和MgCl₂15mmol/L；所述Tris-HCl的pH值优选为8.3。

在本发明中，所述样本优选包括血液或羊水。

本发明优选可以根据PAH基因c.485C>A位点的基因型确定提供待测样本的个体与苯丙酮尿症的相关性；

当c.1025C>G位点的基因型为野生型(即没有发生c.1025C>G突变)，c.485C>A位点的基因型为野生型(即没有发生c.485C>A突变)时，提供待测样本的个体为正常个体；

当c.1025C>G位点的基因型为c.1025C>G杂合突变(一个基因发生c.1025C>G突变，其等位基因没有发生c.1025C>G突变)，c.485C>A位点的基因型为c.485C>A杂合突变(一个基因发生c.485C>A突变，其等位基因没有发生c.485C>A突变)，且两个发生突变的位点在两条染色体上，

或c.1025C>G位点的基因型为c.1025C>G纯合突变，c.485C>A位点的基因型为c.485C>A杂合突变，

或c.1025C>G位点的基因型为c.1025C>G纯合突变，c.485C>A位点的基因型为野生型，

或c.1025C>G位点的基因型为野生型，c.485C>A位点的基因型为c.485C>A纯合突变，

或c.1025C>G位点的基因型为c.1025C>G杂合突变，c.485C>A位点的基因型为c.485C>A纯合突变，

或c.1025C>G位点的基因型为c.1025C>G纯合突变，c.485C>A位点的基因型为c.485C>A纯合突变时，提供待测样本的个体为苯丙酮尿症患者；

当c.1025C>G位点的基因型为c.1025C>G杂合突变，c.485C>A位点的基因型为c.485C>A杂合突变，且两个发生突变的位点在同一条染色体上，

或当c.1025C>G位点的基因型为野生型，c.485C>A位点的基因型为c.485C>A杂合突变，

或c.1025C>G位点的基因型为c.1025C>G杂合突变，c.485C>A位点的基因型为野生型时，提供待测样本的个体为苯丙酮尿症携带者。

本发明共检测了21个苯丙酮尿症家系53位个体，共发现2个家系契合本发明上述的突变情况，具体见实施例1～3。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的PAH致病突变体及在制备苯丙酮尿症诊断试剂盒中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(第三版；New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

样本获取

1个苯丙酮尿症家系(简称1号)，家系部分成员的临床信息见表1。图1为苯丙酮尿症家系图谱。

1.诊断标准：

可参照《人类单基因遗传疾病》2010年版和《罕见病诊疗指南》2019年版。

苯丙酮尿症确诊标准：1)临床表现：头发黄，皮肤白，鼠尿味，精神运动发育落后。新生儿筛查时诊断的患儿可无临床表现。2)血Phe浓度>360μmoL/L及Phe/Tyr>2.0。3)尿喋呤谱正常，血DHPR活性正常。4)BH4负荷试验，多数经典PKU患者BH4负荷试验血Phe浓度下降不明显，部分患者BH4负荷试验血Phe可减低30％以上，为BH4反应型的PAH缺乏症。5)检测到PAH基因变异(纯合突变或复合杂合突变)。或PAH基因只检测到一个突变，但符合上面1，2，3，4项者可诊断。

表1苯丙酮尿症1号家系成员的临床信息

如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

1号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1外周血DNA和Ⅱ:2羊水DNA用于测序分析。

外显子测序

2.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备一览表

3.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminator V3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。

4.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	Tris	硼酸	EDTA(pH 8.0,0.5mol/L)	ddH₂O
					体积/重量	5.4g	750mg	2mL	90mL

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。

0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

试剂	NH₄Cl	KHCO₃	EDTA	加ddH₂O
					体积/重量	82.9g	10g	0.37g	至1000mL

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	2M Tris-HCl，pH8.2	4M NaCl	2mM EDTA
				体积/重量	0.5mL	10mL	0.4mL

5.实验步骤

签署知情同意书后，采集家系中Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1成员的外周血3～5mL和Ⅱ2羊水5～10mL作为研究样品。

5.1样本DNA提取

1)将外周血3～5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30min，直至溶液变透明。如为羊水样本直接进入下一步。

2)4℃，3000rpm离心10min，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL的蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000rpm离心10min。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积的酚/氯仿混合液(酚:氯仿＝1:1，v/v)混匀，室温3000rpm离心10min。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5min，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

5.2外显子测序

参考人类全外显子测序试剂盒(Agilent)说明书和分子克隆实验室手册操作指南。

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150～250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

5.3结果

最终得到具有致病意义的基因复合杂合突变PAH:NM_000277.3:exon5:c.485C>A:p.A162D(以下记为c.485C>A)和exon10:c.1025C>G:p.A342G(以下记为c.1025C>G)，分别来自患者的父源和母源的等位基因；其中c.485C>A的突变为错义突变，导致所编码的蛋白质第162位氨基酸残基由丙氨酸变为天冬氨酸；c.1025C>G的突变为错义突变，导致所编码的蛋白质第342位氨基酸由丙氨酸变为甘氨酸。在1号家系患者个体中c.485C>A和c.1025C>G位点的基因型是“c.485C>A杂合突变+c.1025C>G杂合突变”的复合杂合突变，在PAH家系携带者个体中两位点的基因型是“c.485C>A杂合突变”或“c.1025C>G杂合突变”的单个杂合突变。

实施例2

Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对c.485C>A和c.1025C>G位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系4名人员(先证者、先证者父亲、先证者母亲、胎儿)和100名家系外正常人进行c.485C>A和c.1025C>G位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1的方法提取正常人基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。

2.2针对突变位点c.485C>A和c.1025C>G分别设计15对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。

表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

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反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5min；

第二步：30个循环(95℃，30sec→Tm，30sec→72℃，60sec)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数)。

第三步：72℃，7min；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10～15min。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮目的条带，无其他条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果(结果见表6)，选择其中最优两对，其中SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2作为c.485C>A位点检测用引物；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4作为c.1025C>G位点检测用引物，原因在于：虽然表6中c.1025C>G位点的引物对1～3的验证和检测结果均一致，但相对于引物对1，引物2和3对设计优质测序引物则困难一些(片段较短或该片段区域的序列构成欠佳，选择优质测序引物的可能性更小)，引物对1(即SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物)更有利于后续更有利于设计和筛选巢式引物(测序引物)。

3、家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

根据实施例1中步骤5.1获取1号家系人员以及家系100名家系外人员的样本DNA，按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变位点PCR反应体系

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

针对c.485C>A位点：第一步：95℃，5min；第二步：30个循环(95℃，30s→48℃，30s→72℃，60s)；第三步：72℃，7min；第四步：4℃直至取样时。

针对c.1025C>G位点：第一步：95℃，5min；第二步：30个循环(95℃，30s→53℃，30s→72℃，60s)；第三步：72℃，7min；第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(ExoI)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

测序PCR循环条件：

第一步：96℃，1min；

第二步：33个循环(96℃，30sec→55℃，15sec→60℃，4min)；

第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc(Ph5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15min；

3)3000g，4℃离心30min；马上倒置96孔板，185g离心1min；

4)室温放置5min，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4min，迅速置冰上4min，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物。

针对c.485C>A位点的测序引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，针对c.1025C>G位点的测序引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

9、结果分析

Sanger测序结果见图2和图3。由图2和图3可知，1号家系中1名患者c.485C>A和c.1025C>G位点基因型是“c.485C>A杂合突变+c.1025C>G杂合突变”的复合杂合突变；1号家系中3名携带者该位点的基因型分别是“c.485C>A杂合突变”或“c.1025C>G杂合突变”的单杂合突变；100个无血缘关系的正常对照的c.485C>A和c.1025C>G位点基因型是“野生型”。图2测序图中箭头所指位置B层和C层显示家系中个体c.485C>A位点基因型是“c.485C>A杂合突变”，图2中A和D层显示家系中个体c.485C>A位点基因型是“野生型”。图3测序图中箭头所指位置A、C和D层显示家系中个体c.1025C>G位点基因型是“c.1025C>G杂合突变”，图3中B层显示家系中个体c.1025C>G位点基因型是“野生型”。

实施例3

苯丙酮尿症诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

1)扩增引物：如实施例2中的2.6所示，浓度和体积同表8；

2)缓冲液浓度和体积同表8；

3)Taq酶浓度和体积同表8；

4)dNTPs浓度和体积同表8；

5)c.485C>A和c.1025C>G阳性突变参考品DNA，c.485C>A阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如SEQ ID NO.9所示；c.1025C>G阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如SEQID NO.10所示。

6)测序引物：如SEQ ID NO.5～8所示。

2、使用方法：应用于2号家系，苯丙酮尿症2号家系成员的临床信息如表10所示。

表10苯丙酮尿症2号家系成员的临床信息

如图4所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

2号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:2外周血DNA用于该试剂盒检测。

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较；步骤2)～6)的具体过程参照实施例2中的步骤3～8。测序结果见图5和图6。

试剂盒检测结果显示，2号家系中先证者c.485C>A和c.1025C>G位点基因型是“c.485C>A杂合突变+c.1025C>G杂合突变”的复合杂合突变。图5测序图中箭头所指位置显示家系中先证者c.485C>A位点基因型是“c.485C>A杂合突变”杂合突变；图6测序图中箭头所指位置显示家系中先证者c.1025C>G位点基因型是“c.1025C>G杂合突变”；图5和图6检测结果确认先证者为苯丙酮尿症患者，先证者父母为苯丙酮尿症致病基因携带者。遗传咨询意见建议先证者尽早干预治疗，且患者父母以后生育后代有1/4的概率为苯丙酮尿症患者，1/2的概率为携带着，建议以后如生育二胎，建议来医院行胚胎植入前遗传学诊断或产前诊断。

综上所述，利用本发明提供的PAH致病突变体制备的诊断或辅助诊断试剂盒，可以助力苯丙酮尿症基因突变的筛查和诊断或辅助诊断，可以特异性区分苯丙酮尿症患者、携带者和正常人群。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种PAH致病突变体，其特征在于，所述PAH致病突变体为：在登录号为NM_000277.3所示的核苷酸序列的编码区中第485位碱基由C突变为A和第1025位碱基由C突变为G。

2.权利要求1所述PAH致病突变体作为检测靶点在制备苯丙酮尿症诊断或辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。

3.扩增权利要求1所述PAH致病突变体的引物，其特征在于，所述引物由引物对1、引物对2和测序引物组成；所述引物对1由PAH-1F和PAH-1R组成，所述引物对2由PAH-2F和PAH-2R组成；

所述PAH-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述PAH-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述PAH-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述PAH-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述测序引物由测序引物对1和测序引物对2组成；所述测序引物对1由PAH-Seq1F和PAH-Seq1R组成，所述测序引物对2由PAH-Seq2F和PAH-Seq2R组成；

所述PAH-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述PAH-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述PAH-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述PAH-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

4.权利要求3所述的引物在制备苯丙酮尿症诊断或辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。

5.一种苯丙酮尿症的诊断或辅助诊断试剂，其特征在于，所述诊断或辅助诊断试剂包括权利要求3所述的引物。

6.根据权利要求5所述的诊断或辅助诊断试剂，其特征在于，所述诊断或辅助诊断试剂还包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Taq聚合酶中的一种或多种。

7.一种苯丙酮尿症的诊断或辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断或辅助诊断试剂盒包括权利要求5或6所述的诊断或辅助诊断试剂。

8.根据权利要求7所述的诊断或辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断或辅助诊断试剂盒还包括阳性突变参考品DNA1和阳性突变参考品DNA2；所述阳性突变参考品DNA1的单链核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述阳性突变参考品DNA2的单链核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。