CN116004668B - 一种ATP7B基因致病突变体及其在制备Wilson病诊断试剂盒中的应用 - Google Patents
一种ATP7B基因致病突变体及其在制备Wilson病诊断试剂盒中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因诊断技术领域,特别是涉及一种ATP7B基因致病突变体及其在制备Wilson病诊断试剂盒中的应用。本发明通过外显子组测序技术首次发现了c.526_527insA和c.2305_2306insC位点复合杂合突变可以导致Wilson病,利用该复合杂合突变制备的诊断试剂或试剂盒,可以特异性区分Wilson病患者、携带者和正常人群,可用于快速、有效地预测或诊断Wilson病,可以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面,本发明提供的ATP7B基因致病致病突变体可以为Wilson病的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因诊断技术领域,特别是涉及一种ATP7B基因致病突变体及其在制备Wilson病诊断试剂盒中的应用。
背景技术
Wilson病又称肝豆状核变性(MIM 277900),是一种常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病,以铜代谢障碍引起的肝硬化、基底节损害为主的脑变性疾病为特点,以不同程度的肝细胞损害、脑退行性病变和角膜边缘有铜盐沉着环为临床特征。该病也是少数几种可治的神经遗传病之一,关键是早发现、早诊断、早治疗。
Wilson病致病基因ATP7B(MIM 606882)定位于染色体13q14.3,基因全长79.5kb,包含21个外显子和20个内含子,编码1466个氨基酸组成的铜转运P型ATP酶,参与铜的跨膜转运,ATP7B蛋白一方面转运铜至反高尔基体网络并与铜蓝蛋白前体结合、形成功能性的全铜蓝蛋白入血;另一方面转运铜至胆汁以便排泄。ATP7B蛋白主要在肝脏表达,当ATP7B基因突变导致ATP7B蛋白对铜的转运功能障碍时,铜在肝脏过量沉积,引起肝细胞线粒体氧化应激反应并对脂质、蛋白质、DNA和RNA等分子造成损伤,导致肝细胞损伤、肝脏脂肪变性;铜还可激活肝星状细胞,加速肝纤维化进程。当铜超过了肝脏储存容量,就会以游离铜的形式进入血液,并在脑部、肾脏、角膜、关节以及肠道等部位过量沉积,产生肝脏外的铜毒性,引起相应的临床表现。
人类基因数据库已公开了数百个ATP7B基因突变位点,其中绝大部分在Wilson病发病中具有明确致病作用。欧洲Wilson病患者人群中最常见的突变为p.His1069Gln,突变频率为13%~61%;亚洲人群的常见突变为p.Arg778Leu,突变频率为34%~38%。我国Wilson病患者有3个高频致病突变p.Arg778Leu、p.Pro992Leu和p.Thr935Met,占所有致病突变的50%~60%;相对常见的致病突变还有p.Ala874Val、p.Ile1148Thr、p.Gly943Asp、p.Gln511X、p.Arg919Gly、p.Asn1270Ser、p.Arg778Gln等。
基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础,基因诊断是确诊Wilson病的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。但目前并没有能特异性区分Wilson病患者、携带者和正常人群的诊断试剂盒的报道。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种ATP7B基因致病突变体及其在制备Wilson病诊断试剂盒中的应用。利用本发明提供的ATP7B基因致病突变体制备的诊断试剂盒,可以助力Wilson病基因突变的筛查和诊断,可以特异性区分Wilson病患者、携带者和正常人群。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
本发明提供了一种ATP7B基因致病致病突变体,所述ATP7B基因致病突变体为复合杂合突变,包括c.526_527insA和c.2305_2306insC;
所述c.526_527insA在登录号为NM_000053.4的2号外显子的第526位和527位间存在A插入突变;所述c.2305_2306insC在登录号为NM_000053.4的8号外显子的第2305位和2306位间存在C插入突变。
本发明还提供了扩增上述ATP7B基因致病突变体的引物组,所述引物组包括:引物对1和引物对2;所述引物对1包括ATP7B-1F和ATP7B-1R;所述引物对2包括ATP7B-2F和ATP7B-2R;
所述ATP7B-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述ATP7B-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述ATP7B-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
所述ATP7B-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了上述ATP7B基因致病突变体或上述的引物组在制备Wilson病诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种Wilson病的诊断试剂盒,所述诊断试剂盒包括上述的引物组。
优选的,所述诊断试剂盒还包括测序引物;所述测序引物包括:引物对3和引物对4;所述引物对3包括ATP7B-Seq1F和ATP7B-Seq1R;所述引物对4包括ATP7B-Seq2F和ATP7B-Seq2R;
所述ATP7B-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
所述ATP7B-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;
所述ATP7B-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;
所述ATP7B-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选的,所述诊断试剂盒还包括c.526_527insA位点阳性突变参考品DNA1和c.2305_2306insC位点阳性突变参考品DNA2;
所述DNA1的单链核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;
所述DNA2的单链核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了一种鉴定上述ATP7B基因致病突变体的基因型的方法,所述方法包括以下步骤:
以待测样品DNA为模板,利用上述引物组进行PCR扩增,得到扩增产物;
将扩增产物进行测序,确定ATP7B基因致病突变体的基因型。
优选的,所述PCR扩增的反应体系以20μL计,包括10×PCR缓冲液2μL、dNTPs 0.4μL、ATP7B-1F或ATP7B-2F 0.5μL、ATP7B-1R或ATP7B-2R 0.5μL、模板1μL、Taq酶0.2μL和余量的ddH2O。
优选的,当PCR扩增所用引物为所述引物组中的引物对1时,所述PCR扩增的反应进程包括:95℃预变性5min;95℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸60s,30个循环;72℃反应7min;
当PCR扩增所用引物为所述引物组中的引物对2时,所述PCR扩增的反应进程包括:95℃预变性5min;95℃变性30s,47℃退火30s,72℃延伸60s,30个循环;72℃反应7min。
优选的,所述待测样本包括羊水或血液。
有益效果:
本发明提供了一种ATP7B基因致病致病突变体,所述ATP7B基因致病突变体为复合杂合突变,包括c.526_527insA和c.2305_2306insC;所述c.526_527ins A在登录号为NM_000053.4的2号外显子的第526位和527位间存在A插入突变;所述c.2305_2306insC在登录号为NM_000053.4的8号外显子的第2305位和2306位间存在C插入突变。本发明通过外显子组测序技术首次发现了c.526_527insA(ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26)和c.2305_2306insC(ATP7B:NM_000053.4:exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24)位点复合杂合突变可以导致Wilson病,利用该复合杂合突变制备的诊断试剂或试剂盒,可以特异性区分Wilson病患者、携带者和正常人群,可用于快速、有效地预测或诊断Wilson病,可以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面,本发明为Wilson病的发病机制研究奠定了重要基础,为Wilson病患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面,本发明提供的ATP7B基因致病致病突变体可以为Wilson病的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为Wilson病1号家系遗传图谱;
图2为利用Sanger测序检测1号家系ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26位点基因型的结果图,其中,A层和C层:1号家系中突变者;B层:1号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置);
图3为利用Sanger测序检测1号家系ATP7B:NM_000053.4:exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点基因型的结果图,其中,B层和C层:1号家系中突变带者;A层:1号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置);
图4为Wilson病2号家系遗传图谱;
图5为利用试剂盒检测2号家系患者ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26和ATP7B:NM_000053.4:exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点基因型的结果图(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
具体实施方式
本发明提供了一种ATP7B基因致病致病突变体,所述ATP7B基因致病突变体为复合杂合突变,包括c.526_527insA和c.2305_2306insC;
所述c.526_527insA在登录号为NM_000053.4的2号外显子的第526位和527位间存在A插入突变;
所述c.2305_2306insC在登录号为NM_000053.4的8号外显子的第2305位和2306位间存在C插入突变。
本发明所述c.526_527insA和c.2305_2306insC为Wilson病致病基因复合杂合突变,分别来自父源和母源13号染色体上的等位基因,野生型ATP7B基因的cDNA序列参见Genbank登录号为NM_000053.4的序列;其中c.526_527insA为登录号为NM_000053.4的2号外显子上第526位和527位间存在A插入突变,导致所编码的蛋白质第176位氨基酸残基由缬氨酸变为谷氨酰胺,并导致后续移码突变,在26位氨基酸后成为终止密码子;c.2305_2306insC为登录号为NM_000053.4的8号外显子上第2305位和2306位间存在C插入突变,导致所编码的蛋白质第796位氨基酸由甲硫氨酸变为苏氨酸,并导致后续移码突变,在24位氨基酸后成为终止密码子。
本发明筛选的ATP7B基因致病致病突变体可以将Wilson病患者、携带者和正常人群区分开,可以作为诊断Wilson病的生物标志物,可以为Wilson病的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
本发明提供了扩增上述ATP7B基因致病突变体的引物组,所述引物组包括:引物对1和引物对2;
所述引物对1包括ATP7B-1F和ATP7B-1R;
所述引物对2包括ATP7B-2F和ATP7B-2R;
所述ATP7B-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示:tatgtgccatcggttgtg;
所述ATP7B-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示:ctttgggttagtgctttgt;
所述ATP7B-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示:tgtcgctcattgaactct;
所述ATP7B-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示:gaccttgaggaggatgta。
在本发明中,所述引物对1可以特异性扩增含有c.526_527insA突变位点的基因片段或对应的野生型基因片段;所述引物对2可以特异性扩增含有c.2305_2306insC突变位点的基因片段或对应的野生型基因片段。
本发明还提供了利用上述ATP7B基因致病突变体或上述引物组在制备Wilson病诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种Wilson病的诊断试剂盒,所述试剂盒包括上述引物组,优选还包括测序引物。
在本发明中,所述测序引物优选包括:对含有c.526_527insA的扩增片段进行测序的引物对3和对含有c.2305_2306insC的扩增片段进行测序的引物对4;
所述引物对3包括ATP7B-Seq1F和ATP7B-Seq1R;
所述引物对4包括ATP7B-Seq2F和ATP7B-Seq2R;
所述ATP7B-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示:ccagcattgcagaagga;
所述ATP7B-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示:gctttgtaaccgctcaa;
所述ATP7B-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示:gtcatcctggtggttgct;
所述ATP7B-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示:atggaggtttcctatttctt。
在本发明中,所述诊断试剂盒优选还包括c.526_527insA位点阳性突变参考品DNA1和c.2305_2306insC位点阳性突变参考品DNA2;
所述DNA1的单链核苷酸序列优选如SEQ ID NO.9所示:tatgtgccatcggttgtgtgcctgcaacaggtttgccatcaaattggggacatgggcttcgaggccagcattgcagaaggaaaggcagcctcctggccctcaaggtccttgcctgcccaggaggctgtggtcaagctccgggtggagggcatgacctgccagtcctgtgtcagctccattgaaggcaaggtccggaaactgcaaggagtagtgagagtcaaagatctcactcagcaaccaagaggccgtcatcacttatcagccttatctcattcagcccgaagacctcagggaccatgtaaatgacatgggatttgaagctgccatcaagagcaaagtggctcccttaagcctgggaccaattgatattgagcggttacaaagcactaacccaaag;
所述DNA2的单链核苷酸序列优选如SEQ ID NO.10所示:tgtcgctcattgaactctcctccctacttgctggcagccttcactgtccttgtctttcagctcctcggtgggtggtacttctacgttcaggcctacaaatctctgagacacaggtcagccaacatggacgtgctcatcgtcctggccacaagcattgcttatgtttattctctggtcatcctggtggttgctgtggctgagaaggcggagaggagccctgtgacattcttcgacacgccccccactgctctttgtgttcattgccctgggccggtggctggaacacttggcaaaggtaacagcagcttcaggttcagaaaagagctgctccttcagtaaacaaatctcacttcctctgaacaccatgtttagaattactaattatacacagcatagagacagacttaaagaaataggaaacctccatataattaaggtgctctagtcactaatctccaaattggtcactacttctgaaatcccagctaatctggttaattattaaaaccatcattcaggtgtattgtgtaaactaaagaaacctggccttcagggcagagcctacattgtctcttggtgcaaaactgaatatgtagttggtctagacatccatacatcctcctcaaggtc。
本发明还提供了一种鉴定上述ATP7B基因致病突变体的基因型的方法,所述方法包括以下步骤:
以待测样品DNA为模板,利用上述引物组进行PCR扩增,得到扩增产物;
将扩增产物进行测序,确定ATP7B基因致病突变体的基因型。
在本发明中,所述PCR扩增的反应体系以20μL计,优选包括10×PCR缓冲液2μL、dNTPs 0.4μL、ATP7B-1F或ATP7B-2F 0.5μL、ATP7B-1R或ATP7B-2R0.5μL、模板1μL、Taq酶0.2μL和余量的ddH2O。
在本发明中,当PCR扩增所用引物为上述引物对1时,即当所述反应体系中的引物为ATP7B-1F和ATP7B-1R时,所述PCR扩增的反应进程包括:95℃预变性5min;95℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸60s,30个循环;72℃反应7min;
当PCR扩增所用引物为上述引物对2时,即当所述反应体系中的引物为ATP7B-2F和ATP7B-2R时,所述PCR扩增的反应进程包括:95℃预变性5min;95℃变性30s,47℃退火30s,72℃延伸60s,30个循环;72℃反应7min。
在本发明中,所述PCR缓冲液优选包括KCl 500mmol/L、Tris-HCl100mmol/L和MgCl215mmol/L;所述Tris-HCl的pH值优选为8.3。
在本发明中,所述样本优选包括血液或羊水。
在本发明中,优选可以根据生物标志物的基因型确定提供待测样本的个体与Wilson病的相关性,具体为:将测序结果和上述方案中所述的DNA1和DNA2的序列进行比较分析,若和DNA1的序列相同则表示发生c.526_527insA突变,若和DNA2的序列相同则表示发生c.2305_2306insC突变;
当c.526_527insA位点的基因型为野生型(即没有发生c.526_527insA突变),c.2305_2306insC位点的基因型为野生型(即没有发生c.2305_2306insC突变)时,提供待测样本的个体为正常个体;
当c.526_527insA位点的基因型为c.526_527insA杂合突变(一个基因发生c.526_527insA突变,其等位基因没有发生c.526_527insA突变),c.2305_2306insC位点的基因型为c.2305_2306insC杂合突变(一个基因发生c.2305_2306insC突变,其等位基因没有发生c.2305_2306insC突变)时,提供待测样本的个体为Wilson病患者;
当c.526_527insA位点的基因型为野生型,c.2305_2306insC位点的基因型为c.2305_2306insC杂合突变,
或c.526_527insA位点的基因型为c.526_527insA杂合突变,c.2305_2306insC位点的基因型为野生型时,提供待测样本的个体为Wilson病携带者。
为了进一步说明本发明,下面结合附图和实施例对本发明提供的一种ATP7B基因致病突变体及其在制备Wilson病诊断试剂盒中的应用进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
样本获取
一个Wilson病家系(简称1号家系),该ATP7B家系部分成员的临床信息见表2。图1显示了ATP7B基因突变1号家系图谱,其中,表示男性携带者,/>表示女性携带者,■表示男性患者,/>表示先证者。
1.诊断标准:
可参照《Wilson病的诊断与治疗指南》2022版:
指南中对于Wilson病的诊断应用Leipzig评分系统,总分≥4分可确诊,3分为疑似诊断,≤2分则排除诊断(表1)。
表1 2001年莱比锡第8届Wilson病国际会议的诊断标准(Leipzig评分系统)
注:总分≥4分可确诊;总分3分为疑似诊断,需进一步检查;总分≤2分基本不考虑诊断;a:肝铜定量不可及时;ULN:正常值上限。
表2 Wilson病1号家系成员的临床信息
如图1所示,编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1外周血DNA用于测序。
外显子测序
2.仪器设备如表3所示。
表3仪器设备一览表
3.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。
4.试剂配方
5×TBE电泳液贮存液按照表4配制。
表4 5×TBE电泳液配方
试剂 | 体积/重量 | 试剂 | 体积/重量 |
Tris | 5.4g | EDTA(pH8.0,0.5mol/L) | 2mL |
硼酸 | 750mg | ddH2O | 90mL |
用ddH2O将最终体积调整为100mL。
0.5×TBE电泳液工作液,用ddH2O稀释10倍即可。
10×红细胞裂解液按照表5配制。
表5 10×红细胞裂解液配方
试剂 | 体积/重量 | 试剂 | 体积/重量 |
NH4Cl | 82.9g | EDTA | 0.37g |
KHCO3 | 10g | 加dH2O | 至1000mL |
高压灭菌,4℃保存。
1×细胞核裂解液按照表6配制。
表6 1×细胞核裂解液配方
5.实验步骤
签署知情同意书后,采集1号家系中Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1成员的外周血3~5mL作为研究样品。
5.1样本DNA提取
1)将外周血3~5mL装入15mL离心管中,加2~3倍体积的1×红细胞裂解液,混匀,冰上静置30分钟,直至溶液变透明。
2)4℃,3000rpm离心10分钟,小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液,混匀,再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20%SDS,摇匀,至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL的蛋白酶K,摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3)加等体积饱和酚,轻摇混匀,室温3000rpm离心10分钟。
4)小心移上清至另一离心管,加等体积的酚/氯仿混合液(酚:氯仿=1:1,v/v)混匀,室温3000rpm离心10分钟。
5)小心移上清,若上清不清亮透明,则用等体积氯仿再抽提一次。
6)将上清移入另一离心管中,加二倍体积无水乙醇,摇匀,见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出,70%乙醇洗二次,室温干燥5分钟,再将DNA溶于200μL 1×TE中,转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7)TE溶解的DNA,在4℃下可保存一年,如要求长期保存,则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
5.2外显子测序
1)取2μg DNA,机械打断,使片段大小在200bp左右,切胶回收150~250bp片段;
2)DNA片段做末端修复和3’末端加A;
3)连接测序接头,对连接产物进行纯化,再行PCR扩增,扩增产物纯化;
4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获,杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增,再行最终产物回收,取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析;
5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。
5.3结果
最终得到具有致病意义的基因复合杂合突变ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26和exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24,分别来自患者的父源和母源的等位基因;其中exon2:c.526_527insA的突变导致所编码的蛋白质第176位氨基酸残基由缬氨酸变为谷氨酰胺,并导致后续移码突变,在26位氨基酸后成为终止密码子;exon8:c.2305_2306insC的突变导致所编码的蛋白质第796位氨基酸由甲硫氨酸变为苏氨酸,并导致后续移码突变,在24位氨基酸后成为终止密码子。在家系患者个体中ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26和exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点的基因型是“C.526_527insA杂合突变+C.2305_2306insC杂合突变”的复合杂合突变,在ATP7B家系携带者个体中两位点的基因型是“C.526_527insA杂合突变”或“C.2305_2306insC杂合突变”的单个杂合突变。
实施例2
Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法,对ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26和exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系3名人员(先证者、先证者父亲、先证者母亲)和100名家系外正常人进行ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26和exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点基因型检测。
具体方法步骤如下:
1、DNA提取
按照实施例1的方法提基因组DNA。
2、候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3。
2.2针对突变位点c.526_527insA和c.2305_2306insC分别设计12对候选引物(见表7),并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。
表7各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
2.3候选引物PCR验证反应
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上;每对引物设置8个反应测试管(表8中序号1至8)。
表8引物检测PCR反应体系
/>
反应条件:将上述测试反应管放入PCR仪,执行以下反应程序:
第一步:95℃,5min;
第二步:30个循环(95℃,30sec→Tm,30sec→72℃,60sec);(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数)。
第三步:72℃,7min;
第四步:4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测,以评估引物反应的有效性、特异性:
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好,置于一水平台面上,在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中,加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液,摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热,沸腾后取出摇匀,再加热,直至凝胶完全熔解,取出室温冷却。
3)待凝胶冷却至50℃左右,倒入封好的凝胶成样器,使厚度在5mm左右。
4)凝胶凝固拆除胶带,将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5)加入电泳缓冲液,使液面高于胶面1~2mm,向上拔出梳子;用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后,加入各加样孔内,由于载样液中蔗糖比重较大,DNA沉入孔底。
6)盖上电泳槽,接通电源,调至适当电压,开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示,判断样品的大概位置,决定是否终止电泳。
7)切断电源,取出凝胶,放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10~15分钟。
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果,波长254nm,并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价:
1)如果7号管仅出现一条明亮目的条带,无其他条带,则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强;
2)如果7号管没有出现目的条带,则判断该对引物和反应体系无效;
3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带,并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带,则判断该对引物和反应体系有效性差;
4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带,并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带,则判断该对引物和反应体系特异性差;
5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带,并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带,则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表7验证测试后统计的结果(结果见表7),选择其中最优一对SE Q IDNO.1和SEQ ID NO.2作为ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26位点检测用引物;
选择其中最优一对SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4作为ATP7B:NM_000053.4:exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点检测用引物。
3、家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
根据实施例1中步骤5.1获取家系人员和100名家系外人员的样本DNA,按照表9中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表9突变位点PCR反应体系
反应条件:将反应体系放入PCR仪,执行以下反应程序:
针对针对ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26位点采用如下步骤:
第一步:95℃,5min;
第二步:30个循环(95℃,30sec→52℃,30sec→72℃,60sec);
第三步:72℃,7min;
第四步:4℃直至取样时。
针对ATP7B:NM_000053.4exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点采用如下步骤:
第一步:95℃,5min;
第二步:30个循环(95℃,30sec→47℃,30sec→72℃,60sec);
第三步:72℃,7min;
第四步:4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化:5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I),1μL碱性磷酸酶(AIP),37℃消化15min,85℃使酶失活15min。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表10。
表10 BigDye反应体系
试剂 | 用量 |
PCR产物纯化后DNA | 2.0μL |
3.2pmol/μL测序引物 | 1.0μL |
BigDye | 0.5μL |
5×BigDye测序缓冲液 | 2.0μL |
ddH2O | 4.5μL |
测序PCR循环条件:
第一步:96℃,1min;
第二步:33个循环(96℃,30sec→55℃,15sec→60℃,4min);
第三步:4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化:
1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0),加到管底,再加入1μL 3mol/LNaAc(Ph5.2);
2)加入70μL 70%酒精,震荡混匀4次,室温放置15min;
3)3000g,4℃离心30min;马上倒置96孔板,185g离心1min;
4)室温放置5min,让残余的酒精在室温挥发干,加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA,96℃变性4min,迅速置冰上4min,上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序,测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物。
针对ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26位点的测序引物序列如下所示:
5’-CCAGCATTGCAGAAGGA-3’(SEQ ID NO.5);
5’-GCTTTGTAACCGCTCAA-3’(SEQ ID NO.6);
针对ATP7B:NM_000053.4:exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点的测序引物序列如下所示:
5’-GTCATCCTGGTGGTTGCT-3’(SEQ ID NO.7);
5’-ATGGAGGTTTCCTATTTCTT-3’(SEQ ID NO.8)。
9、结果分析
测序结果见图2和图3,其中图2测序图中箭头所指位置A层和C层显示家系中个体ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26位点基因型是“C.526_527insA杂合突变”,图2中B层显示家系中个体ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26位点基因型是“野生型”。图3测序图中箭头所指位置B层和C层显示家系中个体ATP7B:NM_000053.4:exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点基因型是“C.2305_2306insC杂合突变”,图3中A层显示家系中个体ATP7B:NM_000053.4:exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点基因型是“野生型”。
Sanger测序结果显示,1号家系中1名患者ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26和exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点基因型是“C.526_527insA杂合突变+C.2305_2306insC杂合突变”的复合杂合突变;1号家系中2名携带者该位点的基因型分别是“C.526_527insA杂合突变”或“C.2305_2306insC杂合突变”的单杂合突变;100个无血缘关系的正常对照的ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26和exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tf s*24位点基因型是“野生型”。
实施例3
Wilson病诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成:
1)扩增引物:如实施例2中的2.6所示,浓度和体积同表9;
2)缓冲液浓度和体积同表9;
3)Taq酶浓度和体积同表9;
4)dNTPs浓度和体积同表9;
5)ATP7B:c.526_527insA和c.2305_2306insC阳性突变参考品DNA,该参考品为一段双链DNA,c.526_527insA阳性突变参考品单链的具体序列如SEQ ID NO.9所示;
c.2305_2306insC阳性突变参考品单链的具体序列如SEQ ID NO.10所示。
6)测序引物:如SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.8所示。
2、使用方法:应用于2号家系,Wilson病2号家系成员的临床信息如表11所示。
表11 Wilson病2号家系成员的临床信息
如图4所示,编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。其中,表示男性携带者,/>表示女性携带者,■表示男性患者,◇表示胎儿,/>表示先证者患者。
2号家系人员Ⅱ2羊水DNA用于该试剂盒检测。
1)基因组DNA提取:提取样本基因组DNA。
2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应;
3)对PCR扩增产物进行纯化;
4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应;
5)对BiyDye反应产物纯化;
6)对BiyDye反应产物测序,测序序列与正常序列相比较;步骤2)~6)的具体过程参照实施例2中的步骤3~8。测序结果见图5。
测序结果显示,2号家系中胎儿ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26和exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点基因型是“C.526_527insA杂合突变+C.2305_2306insC杂合突变”的复合杂合突变。图5测序图中箭头所指位置显示家系中胎儿ATP7B:NM_000053.4:exon2:c.526_527insA:p.V176Qfs*26位点基因型是“C.526_527insA杂合突变”杂合突变,ATP7B:NM_000053.4:exon8:c.2305_2306insC:p.M769Tfs*24位点基因型是“C.2305_2306insC杂合突变”;图5结果显示胎儿为Wilson病患者,遗传咨询意见为建议先证者母亲终止妊娠。
综上所述,利用本发明提供的ATP7B基因致病突变体制备的诊断试剂盒,可以助力Wilson病基因突变的筛查和诊断,可以特异性区分Wilson病患者、携带者和正常人群。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可以做各种改动和修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (3)
1.一种检测c.526_527insA突变体和c.2305_2306insC突变体的试剂盒,其特征在于,所述c.526_527insA突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,所述c.2305_2306insC突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示;
所述诊断试剂盒包括扩增c.526_527insA突变体和c.2305_2306insC突变体的引物组,所述引物组由引物对1和引物对2组成;所述引物对1能够特异性扩增含有c.526_527insA突变位点的基因片段或对应的野生型基因片段;所述引物对2能够特异性扩增含有c.2305_2306insC突变位点的基因片段或对应的野生型基因片段;
所述引物对1由ATP7B-1F和ATP7B-1R组成;
所述引物对2由ATP7B-2F和ATP7B-2R组成;
所述ATP7B-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述ATP7B-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述ATP7B-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
所述ATP7B-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括测序引物;所述测序引物由引物对3和引物对4组成;所述引物对3能够对含有c.526_527insA的扩增片段进行测序;所述引物对4能够对含有c.2305_2306insC的扩增片段进行测序;
所述引物对3由ATP7B-Seq1F和ATP7B-Seq1R组成;
所述引物对4由ATP7B-Seq2F和ATP7B-Seq2R组成;
所述ATP7B-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
所述ATP7B-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;
所述ATP7B-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;
所述ATP7B-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括c.526_527insA位点阳性突变参考品DNA1和c.2305_2306insC位点阳性突变参考品DNA2;
所述DNA1的单链核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;
所述DNA2的单链核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
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