CN115927358B

CN115927358B - 一种导致进行性家族性肝内胆汁淤积症ⅱ型的abcb11突变基因、蛋白、试剂及其应用

Info

Publication number: CN115927358B
Application number: CN202211535104.3A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 罗娇娇; 刘鑫林; 何博
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2024-04-30
Anticipated expiration: 2042-12-02
Also published as: CN115927358A

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的ABCB11突变基因、蛋白、试剂及其应用。本发明首次发现包括c.567G>A突变和c.626T>G突变的ABCB11突变基因或其编码的突变体蛋白可以导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型，且与进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的发病密切相关，通过检测生物样本中是否携带所述ABCB11突变基因可以有效地检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导为治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型提供可能的药物靶点。

Description

一种导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的ABCB11突变基因、蛋白、试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的ABCB11突变基因、蛋白、试剂及其应用。

背景技术

进行性家族性肝内胆汁淤积症(progressive familialintrahepaticcholestasis，PFIC)是一组常染色体隐性遗传性疾病。因基因突变导致胆汁排泌障碍，发生肝内胆汁淤积，最终可发展为肝衰竭。根据其致病基因不同，该疾病分为3型，包括PFIC-1型(MIM 211600)、PFIC-2型(MIM 601847)和PFIC-3型。

PFIC-1型由ATP8B1基因突变引起，PFIC-2型由ABCB11基因(MIM 603201)突变引起，PFIC-2型由ABCB4基因(MIM 603201)突变引起。PFIC-1和PFIC-2型发病率1/100000-1/50000，发病与性别无关。文献报道10％-15％儿童胆汁淤积性疾病归因于PFIC，10％-15％儿童肝移植归因于PFIC。

黄疸和皮肤瘙痒是PFIC典型临床表现，通常在1岁之前发病，平均发病年龄是3月龄。其他有身材矮小、青春期发育落后等发育迟缓表现，胆囊结石，脂肪吸收障碍所致的脂肪泻，肝脾肿大以及脂溶性维生素缺乏所致佝偻病、骨龄延迟、干眼症、凝血障碍和神经肌肉病变等症状。患儿亦可以出现视觉及听力异常，出现烦躁、嗜睡及注意力不集中等改变。晚期可出现门静脉高压症和肝脏肿瘤等。三型PFIC临床表现各有其特点，水样腹泻是PFIC-1型常见肝外表现，此外有胰腺炎和听力减退等表现。PFIC-2型患者的最初表现和进展可能更加严重，出生头几个月即有持续性黄疸出现，1年内就可能进展为肝功能衰竭。肝脏的结构因小叶和肝门纤维化以及炎症改变而更加复杂有更高的转氨酶和甲胎蛋白水平较易出现胆结石新生儿肝炎及肝癌发生率高。

体征：巩膜皮肤黄染；皮肤抓伤；肝大脾大；身高体重增长缓慢；鼻衄、牙龈出血或皮肤黏膜的出血点甚或危及生命的大出血；步态不稳；视觉听力异常；精神状态改变：烦躁嗜睡注意力不集中；青春期延迟性发育落后。

实验室检查：PFIC三型表现为血结合胆红素、碱性磷酸酶及胆酸等不同程度增高，血胆固醇多正常。而PFIC-1型和PFIC-2型实验室检查血清谷氨酰转肽酶活性和胆固醇值基本正常，胆汁酸明显升高。

影像学检查：MRCP或腹部超声等观察肝内外胆管，PFIC一般无肝内外胆管改变。

基因检测应用：DNA测序检测ATP8B1、ABCB11、ABCB4基因外显子，必要时可采用RT-PCR和测序检测非编码序列和内含子的突变以及剪接错误，或者进行全基因测序。其中ABCB11基因(MIM 603201)定位于染色体2q31.1，包括28个外显子和27个内含子，基因长110.5kb，编码1321个氨基酸的胆盐排泄泵BSEP蛋白，该蛋白是人类主要的胆汁酸转运蛋白，在将胆汁酸由肝细胞运输到胆小管的过程中起着至关重要的作用，基因突变可导致胆汁酸盐排泄能力地削弱，造成胆汁酸堆积及肝细胞的损伤。目前已知的有十多种不同的错义突变于蛋白的表达水平与转运活性密切相关。

因此，基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的ABCB11突变基因、蛋白、试剂及其应用，本发明发现了新的ABCB11复合杂合突变，可以作为进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的筛查和诊断位点，将患者、携带者和正常人群区分开，指导患者的精准治疗以及患者和携带者的优生优育。

本发明提供了一种导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的ABCB11突变基因，所述ABCB11突变基因与野生型ABCB11基因相比包括复合杂合突变，所述复合杂合突变包括c.567G>A突变和c.626T>G突变。

本发明还提供了上述技术方案所述的ABCB11突变基因编码的突变体蛋白，所述突变体蛋白与所述野生型ABCB11基因编码的蛋白相比，包括p.W189*和p.I209S。

本发明还提供了用于检测上述技术方案所述的ABCB11突变基因或所述的突变体蛋白的试剂在制备试剂盒中的应用；

所述试剂盒包括用于诊断和/或筛查进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的试剂盒。

优选的，所述试剂包括引物、探针、抗体和质谱检测试剂中的至少一种。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述的ABCB11突变基因的引物组，所述引物组包括检测所述c.567G>A突变的引物对ABCB11-1和检测所述c.626T>G突变的引物对ABCB11-2；

所述引物对ABCB11-1的上游引物ABCB11-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物对ABCB11的下游引物ABCB11-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述引物对ABCB11-2的上游引物ABCB11-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物对ABCB11-2R的下游引物MFSD8-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种用于诊断和/或筛查进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的试剂，所述试剂包括上述技术方案所述的引物组。

优选的，所述试剂还包括测序引物和扩增所需要的试剂。

优选的，所述测序引物包括所述c.626T>G突变的测序引物ABCB11-Seq1和所述c.626T>G突变的测序引物ABCB11-Seq2；

所述测序引物ABCB11-Seq1的上游引物ABCB11-Seq1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述测序引物ABCB11-Seq1的下游引物ABCB11-Seq1R的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；

所述测序引物ABCB11-Seq2的上游引物ABCB11-Seq2F的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述测序引物ABCB11-Seq2的下游引物ABCB11-Seq2R的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的试剂在制备诊断和/或筛查进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的试剂盒中的应用。

优选的，所述诊断包括产前诊断、孕前诊断和常规辅助诊断；

所述筛查包括产前筛查、孕前筛查和常规辅助筛查。

有益效果：

本发明提供了一种导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的ABCB11突变基因，所述ABCB11突变基因与野生型ABCB11基因相比包括复合杂合突变，所述复合杂合突变包括c.567G>A突变和c.626T>G突变。本发明所述复合杂合突变为首次发现的复合杂合突变，所述c.567G>A突变指野生型ABCB11基因的第7号外显子的第567位碱基由G突变为A，所述c.567G>A突变为无义突变，使野生型ABCB11基因编码蛋白的第189位氨基酸由色氨酸(W)突变为终止密码子(*)，即p.W189*突变。本发明所述c.626T>G突变指野生型ABCB11基因的第8号外显子的第626位碱基由T突变为G，所述c.626T>G突变为错义突变，使野生型ABCB11基因编码的蛋白的第209位氨基酸由异亮氨酸(I)发生丝氨酸(S)，即p.I209S突变。本发明所述p.W189*突变和p.I209S突变形成所述突变体蛋白。本发明首次发现ABCB11突变基因或其编码的突变体蛋白可以导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型，且与进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的发病密切相关，通过检测生物样本中是否携带所述ABCB11突变基因可以有效地检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导为治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型提供可能的药物靶点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1显示进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型1号家系遗传图谱；

图2显示利用Sanger测序检测ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*位点基因型的结果图，其中1号家系先证者、先证者父亲、胎儿为“c.567G>A杂合突变”，先证者母亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图3显示利用Sanger测序检测ABCB11:NM_003742.4:exon8:c.626T>G:p.I209S位点基因型的结果图，其中1号家系先证者、先证者母亲、胎儿为“c.626T>G杂合突变”，先证者父亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图4显示进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型2号家系遗传图谱；

图5显示利用试剂盒检测2号家系ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*位点基因型的结果图，其中2号家系先证者、先证者母亲为“c.567G>A杂合突变”，先证者父亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图6显示利用试剂盒检测2号家系ABCB11:NM_003742.4:exon8:c.626T>G:p.I209S位点基因型的结果图，其中2号家系先证者、先证者父亲为“c.626T>G杂合突变”，先证者母亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

在图1和图4中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，■表示男性患者，◆表示胎儿患者，↗表示先证者。

具体实施方式

本发明针对自行收集的一例进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型家系(其中1号家系包括先证者、先证者父亲、母亲和孕周为19⁺¹周的胎儿)通过全外显子测序、家系分析联合Sanger测序验证的方法对此家系进行致病变异检测和验证。在ABCB11基因确定了新的复合杂合突变，包括c.567G>A突变和c.626T>G突变。可以导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的发生。本发明首次发现了ABCB11基因上复合杂合突变，并确认了复合杂合突变与进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的密切关系，可用于进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的分子遗传学研究和进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型相关疾病的诊断。

本发明所述野生型ABCB11基因的cDNA序列参见Genbank登录号为NM_003742.4。本发明所述c.567G>A突变指野生型ABCB11基因的第7号外显子的第567位碱基由G突变为A，所述c.567G>A突变包含有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，具体为5’-GGGTGATTTGA-3’。本发明所述c.567G>A突变为无义突变，可以导致所编码的蛋白质的第189位氨基酸由色氨酸(W)突变为终止密码子(*)，即p.W189*突变；所述p.W189*突变包含如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，即RMEIG*。本发明所述c.626T>G突变指野生型ABCB11基因的第8号外显子的第626位碱基由T突变为G，所述c.626T>G突变包含如SEQ ID NO.11所示的序列，具体为5’-AAAAGCAATG-3’。本发明所述c.626T>G突变为错义突变，可以导致所编码的蛋白质的第209位氨基酸由异亮氨酸(I)发生丝氨酸(S)，即p.I209S突变，所述p.I209S突变包含如SEQ IDNO.12所示的氨基酸序列，即INKSNDA。通过检测受试者是否携带有上述复合杂合突变，能够筛查或诊断进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型。另一方面，本发明为进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的发病机制研究奠定了重要基础，为进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型提供可能的药物靶点。

本发明还提供了上述技术方案所述的ABCB11突变基因编码的突变体蛋白，所述突变体蛋白与所述野生型ABCB11基因编码的蛋白相比，包括p.W189*和p.I209S。本发明所述突变体蛋白由包括所述c.567G>A突变和c.626T>G突变的ABCB11突变基因编码所得。

本发明还提供了用于检测上述技术方案所述的ABCB11突变基因或所述的突变体蛋白的试剂在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒包括用于诊断和/或筛查进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的试剂盒。本发明所述诊断优选包括孕前、产前和常规辅助诊断中的一种或多种；所述筛查优选包括孕前、产前和常规辅助筛查中的一种或多种。本发明通过检测生物样本中是否含有所述ABCB11突变基因，可以有效检测生物样本是否患有进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型，或是否易患进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型。本发明通过检测所述突变体蛋白在生物样本中是否表达，可以有效确证生物样本中是否患有进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型，或是否易患进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型。

本发明所述试剂优选包括引物、探针、抗体和质谱检测试剂中的至少一种，进一步优选包括引物和探针，更优选为引物。

本发明所述SEQ ID NO.1～4所示的氨基酸序列优选如下：SEQ ID NO.1：5’-ACCCAAATCTCAGGCTAC-3’；SEQ ID NO.2：5’-TTCAGGGGACCTCAAAAT-3’；SEQ ID NO.3：5’-ATAACATCCCAAGGTGC-3’；SEQ ID NO.4：5’-TTGGCTGTTTATGAAGG-3’。

本发明还提供了一种用于诊断和/或筛查进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的试剂，所述试剂包括上述技术方案所述的引物组。本发明所述试剂优选还包括测序引物和扩增所需要的试剂。本发明所述测序引物优选包括所述c.626T>G突变的测序引物ABCB11-Seq1和所述c.626T>G突变的测序引物ABCB11-Seq2；所述测序引物ABCB11-Seq1的上游引物ABCB11-Seq1F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示，具体为：5’-TAGTTCCCAAGAAGAGGC-3’；所述测序引物ABCB11-Seq1的下游引物ABCB11-Seq1R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示，具体为5’-CAAGGGTTTTATTATCCA-3’；所述测序引物ABCB11-Seq2的上游引物ABCB11-Seq2F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.7所示，具体为：5’-TAATGCTATCCAAGGGTG-3’；所述测序引物ABCB11-Seq2的下游引物ABCB11-Seq2R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.8所示，具体为5’-CCAATGGTGGCTGCTCC-3’。

本发明所述PCR扩增所需要的试剂优选包括但不限于dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶。本发明所述PCR缓冲液优选为10×PCR缓冲液，具体包括500mmol/LKCl，100mmol/L Tris-Cl(pH 8.3)和15mmol/LMgCl₂。本发明所述试剂中优选还包括DNA测序用试剂。本发明对所述DNA测序用试剂的类型没有特殊限定，采用本领域中常规DNA测序用试剂即可。本发明所述试剂中的测序引物能够对扩增所述ABCB11突变基因的引物组的扩增产物进行测序，从而判断ABCB11基因上是否存在c.567G>A突变和c.626T>G突变，快速精准诊断进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型。

本发明还提供了上述技术方案所述的试剂在制备诊断和/或筛查进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的试剂盒中的应用。本发明所述诊断包括产前诊断、孕前诊断和常规辅助诊断；所述筛查优选包括产前筛查、孕前筛查和常规辅助筛查。

本发明还提供了一种检测进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的方法，包括如下步骤：采用所述ABCB11突变基因的引物组对待测样本DNA进行扩增，将扩增得到的产物进行测序和比对，结果判定。

本发明对待测样本DNA的获取方法没有特殊限定，采用本领域中常规DNA提取方法即可。本发明所述致病基因突变体的引物对优选与上述技术方案相同，不再进行赘述。本发明对扩增、测序和比对的步骤和具体过程没有特殊限定，采用本领域中常规方式即可。本发明所述待测样本DNA的来源优选为血液或羊水。本发明所述结果判定优选包括：如果发现ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*和exon8:c.626T>G:p.I209S位点的基因型是“c.567G>A杂合子和c.626T>G杂合子”，则判断ABCB11基因存在复合杂合突变，个体为患者；若位点存在c.567G>A纯合突变+c.626T>G野生型或c.567G>A野生型+c.626T>G纯合突变或c.567G>A纯合突变+c.626T>G纯合突变或c.567G>A纯合突变+c.626T>G杂合突变或c.567G>A杂合突变+c.626T>G纯合突变，则判断ABCB11基因存在复合杂合突变，个体为患者；若位点存在单个杂合突变“c.567G>A杂合突变”或“c.626T>G杂合突变”，则个体为携带者；若位点的没有突变，则判断ABCB11基因为野生型，个体是正常人。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(第三版；Molecular CloningA LABORATORYMANUAL 1SECONDEDITION；New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1样本获取

发明人发现了1个进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型家系(简称1号家系)，该家系部分成员的临床信息见表1。图1家系图谱，其中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，■表示男性患者，◆表示胎儿患者，↗表示先证者。

1.诊断标准：

可参照《人类单基因遗传疾病》2010版和《罕见病诊疗指南》2019版：

主要表现：进行性加重的黄疸；胆汁淤积所致的高直接胆红素血症具有反复发作性。突出的、特征性的瘙痒因为胆盐在体内的蓄积所致，与黄疸的程度相一致，可以不严重也可随着黄疸程度改变消长。瘙痒可以使患儿非常痛苦，而且对治疗反应不佳。喂养困难，脂肪吸收障碍所致的脂肪泻，体重增长和发育缓慢，95％以上患儿身材矮小。粪便恶臭而色淡。

继发表现：包括脂溶性维生素缺乏症：维生素D和钙离子吸收受损造成的佝偻病，骨龄延迟；脂溶性维生素A吸收障碍导致的干眼症及其他视觉问题；维生素K吸收障碍所致的凝血酶原时间延长；维生素E吸收障碍所致的神经肌肉病变，此外亦可并发肝肿瘤，胰腺功能不全，胆囊结石，肝纤维化门脉高压症(包括腹水，静脉曲张破裂出血)，心血管疾病等。大多数患者有肝大，如果有明显脾大时，说明进展的肝纤维化或肝硬化；约1/3患者合并有胆结石；部分患者有长期哮喘样疾病；反复流鼻血而不伴血小板减少和凝血性疾病，其原因可能是由于循环中的高浓度胆盐所致。此病患者不伴有黄色瘤。

体征：(1)巩膜、皮肤黄染；(2)皮肤抓伤；(3)肝大、脾大；(4)身高体重增长缓慢；(5)鼻衄、牙龈出血或皮肤黏膜的出血点、甚或危及生命的大出血；(6)步态不稳；(7)视觉听力异常；(8)精神状态改变：烦躁、嗜睡、注意力不集中；(9)青春期延迟性发育落后。

实验室检查：(1)血清胆红素水平上升，直接或结合胆红素水平上升。(2)血清总胆汁酸的浓度上升10～20倍。(3)胆汁中胆酸浓度下降，特别是脱氧胆酸浓度降低。(4)用分光镜对血清和尿的胆汁酸定性分析被用来排除先天性胆汁酸合成障碍。(5)血清总胆固醇水平在一个正常范围之内，高密度脂蛋白水平正常或者是稍低。(6)血清碱性磷酸酶水平有所上升。(7)血清5-核苷酸酶的水平升高。(8)在低γ-GGT型PFIC中血清γ-GGT水平在正常范围内或者相对低一些；当受到微粒体诱导剂的影响时患者的γ-GGT水平也许会高于100IU/L。而在高γ-GGT型PFIC中GGT一般会升高3～10倍。(9)尿胆红素阳性，尿胆原阴性。(10)粪便中脂肪含量有所上升。

影像学研究：对于PFIC的诊断尚缺乏特异性的影像学检查手段。B超、CT等判断有无肝内外胆管扩张，核素扫描可以查看有多少胆汁从肝内排出。

表1进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型1号家系成员的临床信息

如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

1号家系人员Ⅰ：1(先证者父亲)、Ⅰ：2(先证者母亲)、Ⅱ：1(先证者)外周血DNA和Ⅱ：2(胎儿)羊水DNA用于测序分析。

实施例2外显子测序

1.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备一览表

2.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。

3.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	体积/重量
		Tris	5.4g
硼酸	750.0mg
		EDTA(pH8.0，0.5mol/L)	2.0mL
ddH₂O	90.0mL

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。

0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

试剂	体积/重量
		NH4Cl	82.9g
KHCO₃	10.0g
		EDTA	0.37g
加dH₂O	至1000mL

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	体积/重量
		2MTris-HCl，pH8.2	0.5mL
4MNaCl	10mL
		2mMEDTA	0.4mL

4.实验步骤

签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ：1(先证者父亲)、Ⅰ：2(先证者母亲)、Ⅱ：1(先证者)等成员的外周血3～5mL和Ⅱ：2(胎儿)羊水5-10mL。

4.1样本DNA提取

1)对于肝素抗凝外周血样本，则将外周血3-5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明；2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜；3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟；4)小心移上清至另一离心管，加酚和氯仿混合液混匀，酚：氯仿的体积比是1:1，室温3000转/分钟离心10分钟；5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次；6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值；7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

4.2外显子测序

参考人类全外显子测序试剂盒(Agilent)说明书和分子克隆实验室手册(第三版；Molecular CloningALABORATORYMANUAL 1SECOND EDITION；New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress，2014)操作指南。

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

4.3结果

最终得到1个具有致病意义的基因复合杂合突变ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*和exon8:c.626T>G:p.I209S；c.567G>A突变为第567位碱基由G突变为A，造成了无义突变，导致第189位氨基酸由色氨酸(W)突变为终止密码子(*)；c.626T>G突变是第626位碱基由T突变为G，导致发生错义突变，第209位氨基酸发生由异亮氨酸(I)突变为色氨酸(S)。在1号家系患者(先证者)ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*和exon8:c.626T>G:p.I209S位点的基因型是“c.567G>A杂合子+c.626T>G杂合子”复合杂合突变；在1号家系携带者该位点的基因型为“c.567G>A”杂合突变或“c.626T>G”杂合突变。

实施例3Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*和exon8:c.626T>G:p.I209S位点进行验证。分别对实施例1中的1号系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ1(先证者)、Ⅱ2(胎儿)等4名人员和100名家系外正常人进行ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*和exon8:c.626T>G:p.I209S位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取：按照实施例2的方法提基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geno me，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。

2.2针对c.567G>A、c.626T>G位点分别设计16和15对候选引物(见表6和表7)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况

表6c.567G>A各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

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表7c.626T>G各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

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注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。

2.3候选引物PCR验证反应

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表9中序号1至8)。

表8引物检测PCR反应体系

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反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5min；第二步：30个循环(95℃，30sec→Tm，30sec→72℃，60sec)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)；第三步：72℃，7min；第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10～15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表8验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中SEQ ID NO.1和SEQID NO.2和表7中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)作为突变家系检测用引物。

针对ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*位点的PCR引物序列如下所示：5’-ACCCAAATCTCAGGCTAC-3’(SEQ ID NO.1)，5’-TTCAGGGGACCTCAAAAT-3’(SEQ IDNO.2)；

针对ABCB11:NM_003742.4:exon8:c.626T>G:p.I209S位点的引物序列如下所示：5’-ATAACATCCCAAGGTGC-3’(SEQ ID NO.3)，5’-TTGGCTGTTTATGAAGG-3’(SEQ ID NO.4)。

3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表9中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表9突变位点PCR反应体系

试剂	体积
		10×PCR缓冲液	2.0μL
10mmol/L dNTPs	0.4μL
		100ng/μL ABCB11-1F(或ABCB11-2F)	0.5μL
100ng/μL ABCB11-1R(或ABCB11-2R)	0.5μL
		100ng/μL外周血抽提DNA	1.0μL
5u/μL Taq酶	0.2μL
		ddH₂O	15.4μL

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：对于ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*位点反应程序如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→51℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃直至取样时。

对于ABCB11:NM_003742.4:exon8:c.626T>G:p.I209S位点反应程序如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→47℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表10。

表10 BigDye反应体系

试剂	用量
		PCR产物纯化后DNA	2.0μL
3.2pmol/μL测序引物	1.0μL
		BigDye	0.5μL
5×BigDye测序缓冲液	2.0μL
		ddH₂O	4.5μL

测序PCR循环条件：第一步：96℃，1分钟；第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc(pH5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；

3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；

4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物。

针对ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*位点的测序引物序列如下所示：5’-TAG TTCCCAAGAAGAGGC-3’(SEQ ID NO.5)，5’-CAAGGGTTTTATTATCCA-3’(SEQ IDNO.6)；针对ABCB11:NM_003742.4:exon8:c.626T>G:p.I209S位点的测序引物序列如下所示：5’-TAATGCTA TCCAAGGGTG-3’(SEQ ID NO.7)，5’-CCAATGGTGGCTGCTCC-3’(SEQ IDNO.8)。

9、结果分析

图2的Sanger测序结果显示，1号家系3名人员ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*位点基因型是“c.567G>A杂合子”。图2测序图中箭头所指位置显示A、C和D层ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*位点基因型是“c.567G>A杂合子”突变；图2测序图中箭头所指位置显示B层个体基因型为野生型。

图3的Sanger测序结果显示，1号家系3名成员ABCB11:NM_003742.4:exon8:c.626T>G:p.I209S位点基因型是“c.567G>A杂合子”。图3测序图中箭头所指位置显示B、C和D层个体ABCB11:NM_003742.4:exon8:c.626T>G:p.I209S位点基因型是“c.626T>G杂合子”突变；图3测序图中箭头所指位置显示A层个体基因型为野生型。

综合上述检测结果，先证者ABCB11基因型为c.567G>A、c.626T>G复合杂合突变。

实施例4进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

1)扩增引物：如实施例3中表6中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2和表7中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列，2)缓冲液：500μL的10×PCR缓冲液，具体组分为：500mmol/LKCl，100mmol/LTris-Cl(pH8.3)，15mmol/LMgCl₂，3)Taq酶(20U)，4)dNTPs(四种dNTP各4mM)，5)ABCB11:c.567G>A、c.626T>G阳性突变参考品DNA该参考品为一段双链DNA，c.567G>A阳性突变参考品DNA具体序列如下所示：ACCCAAATCTCAGGCTACCCTGCTGAAGGTTCTGTTTACCTCCACTTTTAGCAGCAGATGACAGAGCTCACATCTTAGTTCCCAAGAAGAGGCATTTTCTGAATTACTTTCCCCCTTTTCTCAACTGTTGTATTGAAAGTACTTTCTTCTGAAAAAAGAAATTAACAAATATTTCAAACATTGCAATGCTAAACATTCCTTTGTCCATTTCCAGATATGCTTTTGGGTCATTGCCGCAGCTCGTCAGATACAGAAAATGAGAAAATTTTACTTTAGGAGAATAATGAGAATGGAAATAGGGTGATTTGACTGCAATTCAGTGGGGGAGCTGAATACAAGATTCTCTGAGTAAGTAGCTGGTAAAACAGTATTTTAGTGTGTGATTTTTGGATAATAAAACCCTTGTTTCTAAATTAAATAAAAATTTAAAAATATTTTCAGTTTTCCTATGTTTCATCTCTTAAATTGGGCTTTCATATGTGGCATGGCTTTTTCATAAGTAATACACTGTCAAATATGGACATTAAAAATTGAAACCCAAGGTACTGCAATTTGGTGTGTAGACCTTAATTAAAATATTAGAAAGGAAATATTATAGAAGACAGTTAAAAAGGTTATTTAGCTGTCCAGGTGTAACTGGATTTAAATCCAGTTTACACCTAGTTTAGGTCATTAACAGCCACCCAGGAATTCTAAATGAGAGGAATTAGAATTGGTCGAACCCTATTGAACTGAATTTTGAGGTCCCCTGAA(SEQ ID NO.71)

c.626T>G阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示：

ATAACATCCCAAGGTGCAGCAAATTTTCCAAGATCTGAGAGGCTGTTAATGCTATCCAAGGGT

GATAGGGATAGAGAGATGGGAATGTTTAAAAGGGAAAGACTGAGACTTTCAGCAAGATATTTG

AATGATCAAATTCAGTTTTAGTGACCAAAATCTTTCTGGTTTCTAGTGATATTAATAAAAGCAAT

GATGCCATAGCTGACCAAATGGCCCTTTTCATTCAGCGCATGACCTCGACCATCTGTGGTTTCC

TGTTGGGATTTTTCAGGGGTTGGAAACTGACCTTGGTTATTATTTCTGTCAGCCCTCTCATTGG

GATTGGAGCAGCCACCATTGGTCTGGTAAGAATGTCTTTTTGCATCTCTCCATGGGAAGACATTTGCCTTCATAAACAGCCAA(SEQ ID NO.72)

6)测序引物：如实施例3所示中的SEQ ID NO.5～8所示。

2、使用方法：

应用于2号家系患者检测(见表11)。

表11进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型2号家系成员的临床信息

如图4所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

2号家系人员Ⅰ：1(父亲)、Ⅰ：2(母亲)和Ⅱ：1(先证者)外周血DNA用于试剂盒检测。

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

图5的试剂盒检测结果显示，2号家系母亲和先证者ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*位点基因型是“c.567G>A杂合子”。图5测序图中箭头所指位置显示B和C层ABCB11:NM_003742.4:exon7:c.567G>A:p.W189*位点基因型是“c.567G>A杂合子”突变；图5测序图中箭头所指位置显示A层个体基因型为野生型。图6的试剂盒检测结果显示，2号家系父亲和先证者ABCB11:NM_003742.4:exon8:c.626T>G:p.I209S位点基因型是“c.626T>G杂合子”。图6测序图中箭头所指位置显示A和C层ABCB11:NM_003742.4:exon8:c.626T>G:p.I209S位点基因型是“c.626T>G杂合子”突变；图6测序图中箭头所指位置显示B层个体基因型为野生型。检测结果确认先证者为进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型患者，其母亲和父亲为突变基因携带者；遗传咨询意见为该夫妻再生育进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型患者的几率是1/4，生育携带者后代的几率是1/2，生育完成正常个体的几率是1/4，建议夫妻计划再生育时行胚胎植入前遗传学诊断以及妊娠后来医院行产前诊断。

由以上实施例可以得出：本发明确认了新的ABCB11基因上的复合突变体，即包括c.567G>A突变和c.626T突变，且确认了新突变体与进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的发病密切相关，所述基因突变体可用于进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的ABCB11突变基因，其特征在于，所述ABCB11突变基因为Genbank登录号为NM_003742.4的核苷酸序列编码区的第567位碱基由G突变为A，和第626位碱基由T突变为G。

2.一种用于诊断和/或筛查进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1所述的ABCB11突变基因的检测引物和测序引物；所述检测引物包括检测第567位突变的引物对ABCB11-1和检测第626位突变的引物对ABCB11-2；

所述引物对ABCB11-2的上游引物ABCB11-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物对ABCB11-2的下游引物ABCB11-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述测序引物包括检测第567位突变的测序引物ABCB11-Seq1和检测第626位突变的测序引物ABCB11-Seq2；

所述测序引物ABCB11-Seq1的上游引物ABCB11-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述测序引物ABCB11-Seq1的下游引物ABCB11-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述测序引物ABCB11-Seq2的上游引物ABCB11-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述测序引物ABCB11-Seq2的下游引物ABCB11-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.权利要求2所述的试剂在制备诊断和/或筛查进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅱ型的试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断为常规辅助诊断；所述筛查为常规辅助筛查。