CN115404273B

CN115404273B - 导致进行性家族性肝内胆汁淤积症ⅰ型的atp8b1基因突变体、蛋白和应用

Info

Publication number: CN115404273B
Application number: CN202210765658.6A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 薛斌; 李婵艺
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-06-30
Also published as: CN115404273A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的ATP8B1基因突变体、蛋白和应用。所述ATP8B1基因突变体包括复合杂合突变，所述复合杂合突变包括c.2113G>A和exon24‑28del。上述复合杂合突变为尚未公开的突变位点，与进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型具有密切关系，可作为进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型筛查的候选位点，进而将其应用到制备进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型诊断或筛查试剂盒中，快速有效地预测或诊断进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型，为进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型患者的治疗提供全新的理论依据。

Description

导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的ATP8B1基因突变体、蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的ATP8B1基因突变体、蛋白和应用。

背景技术

进行性家族性肝内胆汁淤积症(progressive familial intrahepaticcholestasis，PFIC)是一种常染色体隐性遗传性疾病。因基因突变导致胆汁排泌障碍，发生肝内胆汁淤积，最终可发展为肝衰竭。根据其致病基因不同，该疾病分为3型，包括PFIC-Ⅰ型、PFIC-Ⅱ型和PFIC-Ⅲ型。

PFIC-Ⅰ型又称Byler氏病，由ATP8B1基因突变引起，ATP8B1位于常染色体18q21.31，基因全长15.7kb，包含28个外显子和27个内含子，编码1146个氨基酸，组成P型ATP酶-FIC1蛋白。 FIC1蛋白位于肝细胞胆小管膜和胆管细胞顶端膜等处；作为一种氨基磷脂易位酶，FIC1蛋白负责把磷脂酰丝氨酸从生物膜外层转移到内层，从而维持膜两侧脂质分布的不对称性，维持毛细胆管膜双分子层内膜高浓度的氨基磷脂，其功能异常可间接干扰胆管胆汁酸分泌。

黄疸和皮肤瘙痒是PFIC典型的临床表现，通常在1岁之前发病，平均发病年龄是3月龄。其他有身材矮小、青春期发育落后等发育迟缓表现，胆囊结石，脂肪吸收障碍所致的脂肪泻，肝脾肿大以及脂溶性维生素缺乏所致佝偻病、骨龄延迟、干眼症、凝血障碍和神经肌肉病变等症状。患儿亦可以出现视觉及听力异常，出现烦躁、嗜睡及注意力不集中等改变。晚期可出现门静脉高压症和肝脏肿瘤等。三种PFIC临床表现各有其特点，水样腹泻是PFIC-Ⅰ型常见肝外表现，此外有胰腺炎和听力减退等表现。

基因突变是导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型发生发展的重要遗传基础，ATP8B1基因突变呈世界性分布，不同种族、甚至不同患者之间其突变类型也不相同，目前已报道的突变类型超过几十种。在我国低谷氨酰转肽酶进行性胆汁淤积患者中也已检测到ATP8B1基因突变，突变类型大多与西方人群不同，其中P209T/IVS6+5G>T连锁突变是我国PFIC-1患者中的热点突变类型。

因基因诊断是确诊进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的金标准，临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的ATP8B1基因突变体、蛋白和应用。本发明发现了新的ATP8B1基因突变体，可作为进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的筛查的候选筛查位点，制备分子遗传学及诊断试剂盒。

本发明提供了一种ATP8B1基因突变体，所述ATP8B1基因突变体为复合杂合突变，所述复合杂合突变包括c.2113G>A和exon24-28del。

本发明还提供了上述技术方案所述的ATP8B1基因突变体编码的蛋白，所述蛋白上包括 p.A705T的突变。

本发明还提供了用于检测上述技术方案所述的ATP8B1基因突变体或蛋白的试剂在下述Ⅰ～Ⅲ 至少一种中的应用；

Ⅰ：制备进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型分子遗传学检测试剂盒；

Ⅱ：制备进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型产前诊断试剂盒；

Ⅲ：制备辅助防治进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的试剂盒。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述的ATP8B1基因突变体或蛋白的试剂，所述试剂包括抗体、探针、引物对和质谱检测试剂中的至少一种。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述的ATP8B1基因突变体的引物组，所述引物组包括检测c.2113G>A的引物对A和检测exon24-28del的引物对B～F；

所述引物组A的上游引物ATP8B1-19F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物ATP8B1-19R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述引物组B的上游引物ATP8B1-24F的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，下游引物 ATP8B1-24R的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；

所述引物组C的上游引物ATP8B1-25F的核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示，下游引物 ATP8B1-25R的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；

所述引物组D的上游引物ATP8B1-26F的核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示，下游引物 ATP8B1-26R的核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示；

所述引物组E的上游引物ATP8B1-27F的核苷酸序列如SEQ ID NO.93所示，下游引物 ATP8B1-27R的核苷酸序列如SEQ ID NO.94所示；

所述引物组F的上游引物ATP8B1-28F的核苷酸序列如SEQ ID NO.113所示，下游引物 ATP8B1-28R的核苷酸序列如SEQ ID NO.114所示。

本发明还提供了一种用于检测进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的试剂盒，包括上述技术方案所述的试剂或引物组。

优选的，所述试剂盒包括分子遗传学诊断试剂盒、产前基因诊断试剂盒或辅助防治家族性高胆固醇血症试剂盒。

优选的，所述试剂盒中还包括测序引物和PCR扩增所需要的试剂。

优选的，所述PCR扩增所需要的试剂包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种。

本发明还提供了上述技术方案所述的试剂、引物组或试剂盒在下述Ⅰ～Ⅲ至少一种中的应用；

有益效果：

本发明提供了一种ATP8B1基因突变体，所述ATP8B1基因突变体包括复合杂合突变，所述复合杂合突变包括c.2113G>A和exon24-28del。上述复合杂合突变为尚未公开的突变位点，与进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型具有密切关系，可作为进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型筛查的候选位点，进而将其应用到制备进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型诊断或筛查试剂盒中，快速有效地预测或诊断进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型，为进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型患者的治疗提供全新的理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型家系遗传图谱，其中，

表示男性携带者，

表示女性携带者，●表示女性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者；

图2为显示利用Sanger测序检测ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点基因型的结果图，其中，A：家系中正常个体；B、C和D：家系中c.2113G>A杂合子突变(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图3为利用定量PCR检测ATP8B1:NM_005603.4:exon24-28del位点基因型的结果图，其中，家系中父亲和女儿的24号和28号外显子拷贝数判定为“1”，缺失了1个拷贝，即为杂合子突变；家系中母亲和胎儿的24号和28号外显子拷贝数判定为“2”，基因位点拷贝没有缺失，即为正常个体；

图4为利用定量PCR检测ATP8B1:NM_005603.4:exon24-28del位点基因型的结果图，其中，家系中父亲和女儿的25号、26号和27号外显子拷贝数判定为“1”，缺失了1个拷贝，即为杂合子；家系中母亲和胎儿的25号、26号和27号外显子拷贝数判定为“2”，基因位点拷贝没有缺失，即为正常个体；

图5为STR单体型分析结果，利用毛细管电泳或测序技术检测 ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T和exon24-28del位点附近8个STR(rs72944199、rs597741、rs613434、rs76282601、rs652140、rs1380653、ATA23G05、D18S1152)，其中父亲携带ATP8B1:NM_005603.4:exon24-28del位点突变杂合子与单体型“C/G/C/C/A/C/196/263”连锁，母亲携带ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点突变杂合子与单体型是 “T/A/T/T/G/G/196/262”连锁，女儿同时遗传了父亲和母亲携带突变的单体型，胎儿则只遗传了母亲携带突变的单体型；

图6为rs72944199检测结果，其中，父亲的基因型是“C/T”，母亲的基因型是“T/T”，女儿的基因型是“C/T”，胎儿的基因型是“T/T”；

图7为rs597741检测结果，其中，父亲的基因型是“G/A”，母亲的基因型是“A/A”，女儿的基因型是“G/A”，胎儿的基因型是“A/A”；

图8为rs613434检测结果，其中，父亲的基因型是“T/C”，母亲的基因型是“T/T”，女儿的基因型是“T/C”，胎儿的基因型是“T/T”；

图9为rs76282601检测结果，其中，父亲的基因型是“C/T”，母亲的基因型是“T/T”，女儿的基因型是“C/T”，胎儿的基因型是“T/T”；

图10为rs652140检测结果，其中，父亲的基因型是“G/A”，母亲的基因型是“G/G”，女儿的基因型是“G/A”，胎儿的基因型是“G/G”；

图11为rs1380653检测结果，其中，父亲的基因型是“G/C”，母亲的基因型是“G/G”，女儿的基因型是“G/C”，胎儿的基因型是“G/G”；

图12为ATA23G05检测结果，其中，父亲的基因型是“193/196”，母亲的基因型是“196/196”，女儿的基因型是“196/196”，胎儿的基因型是“193/196”；

图13为D18S1152检测结果，其中，父亲的基因型是“263/275”，母亲的基因型是“262/265”，女儿的基因型是“263/265”，胎儿的基因型是“265/275”；

图14显示进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型家系遗传图谱，其中，

表示男性携带者，/>

表示女性携带者，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者；

图15为利用试剂盒检测ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点基因型的结果图，其中，B：家系中正常个体；A和C：家系中c.2113G>A杂合突变(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图16为利用试剂盒检测ATP8B1:NM_005603.4:exon24-28del位点基因型的结果图，其中，家系中先证者母亲的24号-28号外显子拷贝数判定为“1”，缺失了1个拷贝，即为杂合突变；家系中父亲和胎儿的24号-28号外显子拷贝数判定为“2”，基因位点拷贝没有缺失，即为野生型。

具体实施方式

本发明针对自行收集的一例家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型家系(包括先证者、先证者父母和未出生的弟弟或妹妹)通过全外显子测序、家系分析联合Sanger测序和定量PCR的验证的方法对上述家系进行致病变异检测和验证。在ATP8B1基因上确定了1个新的复合杂合突变，即位于第19号外显子上第2113位核苷酸上的c.2113G>A和位于第24～28号外显子上的缺失突变。本发明首次发现了ATP8B1基因上的包括c.2113G>A突变和exon24-28del突变的复合杂合突变，并确认了此复合杂合突变与家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的密切联系，可用于家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的分子遗传学研究，家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型相关疾病的诊断，可有效区分家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型患者、携带者和正常人群，此复合杂合突变可以作为诊断进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的生物标志物或药物靶点。

本发明所述野生型ATP8B1基因的cDNA序列参见Genbank登录号为NM_005603.4，本发明所述c.2113G>A突变指野生型ATP8B1基因的第19号外显子的第2113位核苷酸由G突变为A，来源于父源18号染色体；所述exon24-28del突变指野生型ATP8B1基因的第24～28号外显子缺失，来源于母源18号染色体；二者形成本发明中的ATP8B1基因突变体。

本发明还提供了上述技术方案所述的ATP8B1基因突变体编码的蛋白，所述蛋白上包括 p.A705T的突变。本发明所述蛋白是野生型ATP8B1基因cDNA编码的蛋白第705位丙氨酸突变为苏氨酸，即所述蛋白具有p.A705T的突变，所述突变是由于c.2113G>A错义突变而引起的。

本发明还提供了用于检测上述技术方案所述的ATP8B1基因突变体或蛋白的试剂的应用：制备进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型分子遗传学检测试剂盒；制备进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型产前诊断试剂盒或制备辅助防治进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的试剂盒。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述的ATP8B1基因突变体或蛋白的试剂，所述试剂包括抗体、探针、引物组和质谱检测试剂中的至少一种，更优选为引物组。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述的ATP8B1基因突变体的引物组，所述引物组包括检测c.2113G>A的引物对A和检测exon24-28del的引物对B～F；所述引物组A的上游引物 ATP8B1-19F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物ATP8B1-19R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物组B的上游引物ATP8B1-24F的核苷酸序列如SEQ IDNO.33所示，下游引物 ATP8B1-24R的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；所述引物组C的上游引物ATP8B1-25F的核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示，下游引物ATP8B1-25R的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；所述引物组D的上游引物ATP8B1-26F的核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示，下游引物ATP8B1-26R的核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示；所述引物组E的上游引物ATP8B1-27F的核苷酸序列如SEQ ID NO.93所示，下游引物ATP8B1-27R的核苷酸序列如SEQID NO.94所示；所述引物组F的上游引物ATP8B1-28F的核苷酸序列如SEQ ID NO.113所示，下游引物ATP8B1-28R的核苷酸序列如SEQ ID NO.114所示。

本发明还提供了一种用于检测进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的试剂盒，包括上述技术方案所述的试剂或引物组。本发明所述试剂盒优选包括分子遗传学诊断试剂盒、产前基因诊断试剂盒或辅助防治家族性高胆固醇血症试剂盒。本发明所述试剂盒中优选还包括测序引物和PCR扩增所需要的试剂。本发明所述PCR扩增所需要的试剂优选包括但不限于dNTP，PCR缓冲液，镁离子和 Tap聚合酶。本发明在具体实施过程中，可根据实际需要，常规选择其他试剂。本发明对所述PCR 扩增所需要的试剂没有特殊限定，采用本领域中常规PCR扩增试剂即可。本发明所述测序引物优选为巢式引物，所述巢式引物优选包括两组引物，第一组引物优选为扩增引物，所述扩增引物优选与上述ATP8B1基因突变体的引物组保持一致；第二组引物优选为依据第一组引物的扩增产物进行设计得到的引物。

本发明还提供了上述技术方案所述的试剂、引物组或试剂盒在下述Ⅰ～Ⅲ至少一种中的应用； Ⅰ：制备进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型分子遗传学检测试剂盒；Ⅱ：制备进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型产前诊断试剂盒；Ⅲ：制备辅助防治进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的试剂盒。

本发明还提供了一种诊断进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的方法，包括检测ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点的基因型和exon24-28del位点的拷贝数，如果ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点的基因型和exon24-28del位点的拷贝数是 “G/A”和“1”，则判断存在复合杂合突变，则诊断受试个体为进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型患者；如果ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点的基因型和exon24-28del位点的拷贝数是“G/A”和“2”，则判断存在单个杂合突变，则诊断受试个体为携带者；如果 ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点的基因型和exon24-28del位点的拷贝数是 “G/G”和“1”，同样判断存在单个杂合突变，并诊断受试个体为携带者；如果 ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点的基因型和exon24-28del位点的拷贝数是 “G/G”和“2”，则判断为野生型，则诊断受试个体为正常。本发明对所述基因型和拷贝数的测定方法没有特殊限定，采用本领域中常规测定方法即可。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。

文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。

文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患胎的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。

在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，

术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增ATP8B1基因是指，在PCR反应中引物只扩增ATP8B1基因，而不扩增其他基因。

实施例1样本获取

发明人发现了一个进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型家系(简称1号家系)，该1号家系部分成员的临床信息见表1。图1显示了ATP8B1基因突变1号家系图谱，其中，

表示男性携带者，/>

表示女性携带者，●表示女性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者。

1.诊断标准：

可参照《罕见病诊疗指南》2019年版：

主要表现：进行性加重的黄疸；胆汁淤积所致的高直接胆红素血症具有反复发作性。突出的、特征性的瘙痒因为胆盐在体内的蓄积所致，与黄疸的程度相一致，可以不严重也可随着黄疸程度改变消长。瘙痒可以使患儿非常痛苦，而且对治疗反应不佳。喂养困难，脂肪吸收障碍所致的脂肪泻，体重增长和发育缓慢，95％以上患儿身材矮小。粪便恶臭而色淡。

继发表现：包括脂溶性维生素缺乏症：维生素D和钙离子吸收受损造成的佝偻病，骨龄延迟；脂溶性维生素A吸收障碍导致的干眼症及其他视觉问题；维生素K吸收障碍所致的凝血酶原时间延长；维生素E吸收障碍所致的神经肌肉病变，此外亦可并发肝肿瘤，胰腺功能不全，胆囊结石，肝纤维化门脉高压症(包括腹水，静脉曲张破裂出血)，心血管疾病等。大多数患者有肝大，如果有明显脾大时，说明进展的肝纤维化或肝硬化；约1/3患者合并有胆结石；部分患者有长期哮喘样疾病；反复流鼻血而不伴血小板减少和凝血性疾病，其原因可能是由于循环中的高浓度胆盐所致。此病患者不伴有黄色瘤。

体征：(1)巩膜、皮肤黄染；(2)皮肤抓伤；(3)肝大、脾大；(4)身高体重增长缓慢；(5)鼻衄、牙龈出血或皮肤黏膜的出血点、甚或危及生命的大出血；(6)步态不稳；(7)视觉听力异常；(8)精神状态改变：烦躁、嗜睡、注意力不集中；(9)青春期延迟性发育落后。

实验室检查：(1)血清胆红素水平上升，直接或结合胆红素水平上升。(2)血清总胆汁酸的浓度上升10～20倍。(3)胆汁中胆酸浓度下降，特别是脱氧胆酸浓度降低。(4)用分光镜对血清和尿的胆汁酸定性分析被用来排除先天性胆汁酸合成障碍。(5)血清总胆固醇水平在一个正常范围之内，高密度脂蛋白水平正常或者是稍低。(6)血清碱性磷酸酶水平有所上升。(7)血清5- 核苷酸酶的水平升高。(8)在低γ-GGT型PFIC中血清γ-GGT水平在正常范围内或者相对低一些；当受到微粒体诱导剂的影响时患者的γ-GGT水平也许会高于100IU/L。而在高γ-GGT型PFIC中GGT 一般会升高3～10倍。(9)尿胆红素阳性，尿胆原阴性。(10)粪便中脂肪含量有所上升。

影像学研究：对于PFIC的诊断尚缺乏特异性的影像学检查手段。B超、CT等判断有无肝内外胆管扩张，核素扫描可以查看有多少胆汁从肝内排出。

表1进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型1号家系成员的临床信息

先证者(女儿)腹部彩超示肝回声增粗，胆囊稍小，肝脏硬度值：12.2Kpa，甲胎蛋白12.22ng/mL，肝功能示：总胆固醇5.7μmol/L，甘油三酯3.67mmol/L，肌酐41μmol/L，GGT35U/L，碱性磷酸酶657U/L，总胆汁酸434.5μmol/L，总胆红素229.6μmol/L，直接胆红素192.2μmol/L。

如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

家系人员Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1外周血DNA用于检测，Ⅱ2羊水DNA用于检测。

实施例2外显子测序

1、仪器设备如表2所示。

表2仪器设备一览表

2、试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDye Ter分钟ator V3.1 (Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。

3、试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	体积/重量
		Tris	5.4g
硼酸	750mg
		EDTA(pH 8.0，0.5mol/L)	2mL
ddH₂O	90mL

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

试剂	体积/重量
		NH₄Cl	82.9g
KHCO₃	10.0g
		EDTA	0.37g
加dH₂O	至1000mL

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	体积/重量
		2M Tris-HCl,pH8.2	0.5mL
4M NaCl	10.0mL
		2mM EDTA	0.4mL

4.实验步骤

签署知情同意书后，采集家系中Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1成员的外周血3～5mL以及Ⅱ2成员羊水5～10mL 作为研究样品。

4.1样本DNA提取

1)如为肝素抗凝外周血样本，则将外周血3-5mL装入15mL离心管中，加2-3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。如为羊水样本则直接进入下一步。

2)4℃，3000转/分离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃ 保存。

4.2外显子测序

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

4.3结果

最终得到具有致病意义的基因复合杂合突变ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T 和exon24-28del；其中exon19:c.2113G>A的突变可能导致所编码的蛋白质第705位氨基酸残基由丙氨酸变为苏氨酸，exon24-28del的突变可导致所编码的蛋白质功能异常。在家系患者个体中 ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T和exon24-28del位点的基因型是“c.2113G>A”+ “exon24-28del”复合杂合突变，在ATP8B1家系携带者个体中两位点的基因型是“A/T； exon24-28/exon24-28”或“A/A；exon24-28del/exon24-28”单个杂合突变，在ATP8B1家系正常个体中两位点的基因型是“G/G；exon24-28/exon24-28”。

实施例3Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对 ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点进行验证。分别对实施例1中的4名家系人员和100名家系外正常人进行ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例2的方法提基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，引物序列由上海生工生物技术公司合成。

2.2针对c.2113G>A位点分别设计15对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。

表6 c.2113G>A位点候选引物基本情况和验证实验结果一览表

/>

注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况，并避免发夹结构、二聚体等异常情况。

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7 中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

/>

反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃预变性5分钟；

第二步：30个循环(95℃变性30秒→Tm退火30秒→72℃延伸60秒)；(根据表6-1和6-2 中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。

第三步：72℃延伸7分钟；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA 大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10-15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中1号)作为突变家系检测用引物，引物序列如下所示：

针对ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点的引物序列如下所示：

ATP8B1-19F：5’-TGGTTTACGGTTTATGTC-3’(SEQ ID NO.1)，

ATP8B1-19R：5’-TGAAAAGTCTGAGGAGGT-3’(SEQ ID NO.2)。

3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变位点PCR反应体系

试剂	体积
		10×PCR缓冲液	2.0μL
10mmol/L dNTPs	0.4μL
		100ng/μL ATP8B1-19F	0.5μL
100ng/μLATP8B1-19R	0.5μL
		100ng/μL抽提DNA	1.0μL
5u/μL Taq酶	0.2μL
		ddH₂O	15.4μL

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃预变性5分钟；第二步：30个循环(95℃变性30秒→50℃退火30秒→72℃延伸 60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

测序PCR循环条件：

第一步：96℃，1分钟；第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(Ph5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；

3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；

4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物(优选引物)扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，针ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点的测序引物序列如下所示： 5’-AGCAGCAACCAGGATGTA-3’(SEQ ID NO.31)，5’-CTCCAGTAAGCACCCAGA-3’(SEQ ID NO.32)。

9、结果分析

Sanger测序结果显示，家系中1名患者ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点基因型是“G/A”；家系中1名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点基因型是“G/G”。图2测序图中箭头所指位置显示B层、C层和D层显示家系个体ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点基因型是“G/A”杂合突变，图2中A层显示家系中个体ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点基因型是“G/G”野生型。100个无血缘关系的正常对照结果图与图2中的A图相似，因图片内容相似且繁多，不再重复提供。

实施例4荧光定量PCR验证

对于外显子组测序结果进一步利用定量PCR法，对ATP8B1:NM_005603.4:exon24-28del位点进行验证。分别对实施例1中的4名家系人员和100名家系外正常人进行ATP8B1:NM_005603.4:exon24-28del位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取：按照实施例1的方法提基因组DNA；

2、引物设计：引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，引物序列由上海生工生物技术公司合成，并完成荧光集团标记。

2.2针对exon24、25、26、27、28、23位点分别设计10对候选引物(见表10-1～10-6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。

表10-1 exon24候选引物基本情况和验证实验结果一览表

/>

表10-2 exon25候选引物基本情况和验证实验结果一览表

/>

表10-3 exon26候选引物基本情况和验证实验结果一览表

/>

表10-4 exon27候选引物基本情况和验证实验结果一览表

/>

表10-5 exon28候选引物基本情况和验证实验结果一览表

/>

/>

表10-6 exon23候选引物基本情况和验证实验结果一览表

/>

注：引物设计原则同实施例3，其PCR扩增产物长度为50-150bp；

2.3候选引物PCR验证和测试参考实施例3。

2.4根据表10-1～10-6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对作为突变家系检测用引物，引物序列如下所示：针对ATP8B1:NM_005603.4exon24del位点的引物序列的上下游引物(ATP8B1-24 F/R)分别如下SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示；针对ATP8B1:NM_005603.4exon25del位点的引物序列的上下游引物(ATP8B1-25F/R)分别如下SEQ IDNO.53和SEQ ID NO.54所示；针对 ATP8B1:NM_005603.4exon26del位点的上下游引物(ATP8B1-26F/R)分别如下SEQ ID NO.73和S EQ ID NO.74所示；针对ATP8B1:NM_005603.4exon27del位点的上下游引物(ATP8B1-27F/R)分别如下SEQ ID NO.93和SEQ IDNO.94所示；针对ATP8B1:NM_005603.4exon28del位点的上下游引物(ATP8B1-28F/R)分别如下SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.114所示；针对ATP8B1:NM_005603.4exon23对照组(control)位点的引物序列的上下游引物(ATP8B1-23F/R)如SEQ ID NO.13 3和SEQ IDNO.134所示。

3、荧光定量PCR

按照11中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表11荧光定量PCR反应体系

试剂	体积
		SYRB@Realtime PCR Master mix	12.5μL
100ng/μL ATP8B1-24F/25F/26F/27F/28F/23F/内参引物F*	0.5μL
		100ng/μL ATP8B1-24R/25R/26R/27R/28R/23R/内参引物R*	0.5μL
100ng/μL抽提DNA	1.0μL
		ddH₂O	10.5μL

*GAPDH内参引物F的序列为：5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAG-3’(SEQ ID NO.153)；*GAPDH 内参引物R的序列为：5’-GTCAAAGGTGGAGGAGTG-3’(SEQ ID NO.154)

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

对于exon24del位点、exon25del位点、exon26del位点、exon27del位点、exon28del位点和exon23 的反应程序均为：第一步：94℃，1分钟；第二步：40个循环(94℃，30秒→50℃，30秒→72℃， 30秒)；第三步：72℃，5分钟；

第四步：4℃直至取样时，每次循环，检测一次荧光信号，绘制扩增曲线。

4、计算Ct值和DNA相对定量。

基于△△Ct法计算exon24-28的拷贝数。

阈值循环数(Threshold cycle)即Ct值，荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数。荧光PCR仪软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。DNA模板的 Ct值与该DNA模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始DNA模板量浓度越高，Ct值越小；起始DNA模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。

一般情况下每个循环数增加的产物的量应该是按指数增加，用数学共识来表达即是(1+e)^Ct， e就是扩增系数，或者是扩增的效率。一般情况下扩增效率设为1，也就是每个循环增加一倍。即： PCR扩增产物量＝起始DNA模板量×(1+e)^Ct；由于这里把e默认为1；则，PCR扩增产物量＝起始DNA模板量×2^Ct；则，起始DNA模板量＝PCR扩增产物量/(2^Ct)；即，起始DNA模板量＝PCR扩增产物量×2^(-Ct)。当PCR扩增产物量达到同一水平时对应的Ct值不同，其原因在于起始DNA模板量不同；而当样本和内参基因的PCR扩增产物量相同时，如果要算出它们对应起始模板量的比值差，就需要进行除法计算；由，待检基因DNA模板量＝PCR扩增产物量×2^(-Ct 待检)；内参基因DNA模板量＝PCR扩增产物量×2^(-Ct内参)；则，R＝待检基因DNA模板量/ 内参基因DNA模板量＝PCR扩增产物量×2^(-Ct待检)/PCR扩增产物量×2^(-Ct内参)；则，R＝2^ ((-Ct待检)-(-Ct内参))＝2^(-△Ct)。对上面推导得到的所有样本组的2^(-△Ct)，均除以control组的2^(-△Ct)，即可得到2^(-△△Ct)。本实施例需要检测exon24、25、26、27、 28的是否缺失(拷贝数)，以没有缺失的exon23作为control组，以exon24、25、26、27、28为实验组。选择GAPDH基因作为内参基因，进行qPCR实验，然后根据△△Ct计算exon24、25、26、 27、28的拷贝数。

5、结果分析。

荧光定量PCR结果显示，家系中患者ATP8B1:NM_005603.4:exon24-28del位点拷贝数是“1”；家系中正常个体100个无血缘关系的正常对照的ATP8B1:NM_005603.4:exon24-28del位点的拷贝数是“2”。图3显示ATP8B1:NM_005603.4:exon24-28del位点基因型的结果图。其中，家系中父亲和女儿的24号和28号外显子拷贝数判定为“1”，表明24号和28号外显子只有1个拷贝，缺失了1个拷贝，即为杂合突变；家系中母亲和胎儿的24号和28号外显子拷贝数判定为“2”，表明 24号和28号外显子只有完整的2个拷贝，不存在缺失，即为正常个体。图4显示 ATP8B1:NM_005603.4:exon24-28del位点基因型的结果图。其中，家系中父亲和女儿的25号、26 号和27号外显子拷贝数判定为“1”，表明25号、26号和27号外显子只有1个拷贝，缺失了1 个拷贝，即为杂合突变；家系中母亲和胎儿的25号、26号和27号外显子拷贝数判定为“2”，表明25号、26号和27号外显子只有完整的2个拷贝，不存在缺失，即为正常个体。

实施例5 STR连锁分析

基因组DNA中存在一类串联重复序列，其串联重复单位(核心序列)数目在人群中存在较大差异，具有高度多态性，称为可变串联重复序列(VN-TR)。其中重复单位长度为2bp～6bp的重复序列称为微卫星序列，也叫短串联重复序列(short tandem repeat,STR)。绝大多数STR位于非编码区，极少数在编码区域。基因组中STR约有一半具有遗传多态性，为亲子鉴定提供了高信息基因座的丰富来源。

连锁分析原理：不同个体中，STR核心序列的重复次数不同。根据子代的两条DNA一条来自父方，一条来自母方，其子代某一特定DNA分子上STR核心序列重复次数必定与父母相同。我们使用ATP8B1基因及其基因组位置附近的8个STR位点(rs72944199、rs597741、rs613434、 rs76282601、rs652140、rs1380653、ATA23G05、D18S1152)对家系成员和胎儿分别进行PCR，对于某个特定的STR位点，根据PCR的结果来判断胚胎遗传了母亲/父亲的其中STR，然后综合分析所有8个STR位点，来确定其18号染色体的来源。

本实施例对家系人员Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1和Ⅱ2进行STR连锁分析。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例2的方法提基因组DNA。

2、PCR反应

引物序列由上海生工生物技术公司合成，并完成荧光集团标记。

配制下述PCR反应体系。

表12 STR引物序列表

由于引物带荧光，因此整个反应过程需要避光。

表13 PCR体系组成表

试剂	体积
		Ex-Taq premix	10μL
A引物(100ng/μL)-F	0.3μL
		B引物(100ng/μL)-R	0.3μL
DNA模板(30ng/μL)	1μL
		ddH₂O至终体积	20.0μL

为实现上述PCR反应体系，先配置引物混合物，组成如下表。

表14 STR引物混合比列表

将A和B组混合引物充分混匀后，再加入100μL Ex-Taq premix、10μLddH2O，再次混匀后分装出10份19μL体系溶液，每管分别加入家系人员1μLDNA样本，并设置对照管，即完成表12 的PCR体系。

PCR扩增条件：第一步：95℃预变性4分钟；第二步：10个循环(95℃变性30s→60℃退火 30s→72℃延伸35s)；第三步：25个循环(95℃变性30s、52℃退火30s，72℃延伸35s：第四步： 72℃充分延伸30s，4℃保存。

4、扩增产物毛细管电泳分离STR片段，设备检测并数据化

经测序仪分析荧光信号，并形成数据。

5、结果分析

使用GeneMarker软件进行分析。

图3-图9STR连锁分析结果显示，8个STR(rs72944199、rs597741、rs613434、rs76282601、 rs652140、rs1380653、ATA23G05、D18S1152)在先证者父亲(Ⅰ1)和母亲(Ⅰ)的染色体中连锁存在4种单体型，分别是：单体型A：“C/G/C/C/A/C/196/263”；单体型B：“T/A/T/T/G/G/193/275”；单体型C：“T/A/T/T/G/G/196/265”；单体型D：“T/A/T/T/G/G/196/262”。

其中单体型A与ATP8B1:NM_005603.4:exon24018del突变连锁。

其中单体型D与ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T突变连锁。

先证者(Ⅱ1)是单体型A和D；

先证者(Ⅱ1)具有单体型A和D，可判断其具有 ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T和exon24-28de复合杂合突变，即为患者。

胎儿(Ⅱ2)具有单体型B和D，可判断其只具有 ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T单个杂合突变，即为携带者。出生后随访情况表明，该个体未见相关表型。

实施例6进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型诊断试剂盒

1、试剂盒组成：

1)扩增引物：如实施例3和实施例4所示；2)缓冲液(具体为：10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris.HCl(pH8.3)，15mmol/L MgCl₂)；3)Taq酶；4)dNTPs；5)ATP8B1:c.2113G>A 和exon24-28del阳性突变参考品DNA，该参考品为一段双链DNA，c.2113G>A的阳性参考品具体序列如SEQ ID NO.171所示，exon24-28del的阳性参考品具体序列如SEQ ID NO.172所示；6)测序引物：如实施例3步骤8所示。

2、使用方法：

应用于2号家系检测。

表15进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型2号家系成员的临床信息

家系图谱如图14所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

家系人员Ⅰ1、Ⅰ2外周血DNA用于检测，Ⅱ2羊水DNA用于试剂盒检测。

针对ATP8B1:c.2113G>A

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA；2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液 (具体为：10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris.HCl(pH8.3)，15mmol/LMgCl₂)、 dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；3)对PCR扩增产物进行纯化；4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；5)对BiyDye反应产物纯化；6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

针对ATP8B1:exon24-28del

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA；2)先采用上述荧光PCR扩增引物、样本基因组DNA等配置扩增体系；3)进行荧光PCR扩增反应，检测荧光信号，绘制扩增曲线；

4)计算△△Ct值和DNA相对定量。

利用试剂盒检测结果显示胎儿ATP8B1:NM_005603.4:exon19:c.2113G>A:p.A705T位点基因型的结果同其父亲，为c.2113G>A杂合突变(见图15)；胎儿ATP8B1:NM_005603.4:exon24-28del 位点外显子拷贝数判定为“2”，基因位点拷贝没有缺失，即为野生型(见图16)。综合检测结果考虑胎儿为携带者，遗传咨询建议先证者继续妊娠；出生后随访结果表明，该个体没有家族性肝内胆汁淤积症表型。

由以上实施例可以得出，本发明发现了新的ATP8B1复合杂合突变体，且确认了新突变体与家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的发病密切相关，所述致病突变体可用于家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 湖南家辉生物技术有限公司

<120> 导致进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的ATP8B1基因突变体、蛋白和应用

<160> 172

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggtttacgg tttatgtc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaaaagtct gaggaggt 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtagggttta gataagtgga 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaaaagtct gaggaggt 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actggtttac ggtttatg 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtagggttta gataagtgga 20

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tgtcagtata aagccacaa 19

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cacgttgtag agggtgat 18

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ccagtattca agccacat 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgctttggt ttctgtg 17

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tacccgtcgt tgccatt 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

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<210> 110

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tggccagatg gtcattgaca gga 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

tccttgggtt ggactatt 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tcctcagcct cctaaagt 18

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 18

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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actccttggg ttggacta 18

<210> 120

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 120

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttaaacaata gcagagccaa ga 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cctcctcagc ctcctaaa 18

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tccagaagca tcgcaagc 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gatgaggtcc gcgtagcc 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaactccttg ggttggac 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 126

ggattacaga cctgagcc 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaacaatagc agagccaaga 20

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atctcccctc ctcagcct 18

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<211> 18

<212> DNA

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<400> 129

gctcggccta cgccttct 18

<210> 130

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 130

ggtgccatcc gccacgat 18

<210> 131

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 131

tgaaggcgga ggagcagt 18

<210> 132

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 132

tgcgcccgga ggagatgag 19

<210> 133

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 133

ttccatcaat gtctgtctt 19

<210> 134

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 134

tgtccactta ttccaacg 18

<210> 135

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 135

ctgatgtttt gcctcaca 18

<210> 136

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 136

tgtccactta ttccaacg 18

<210> 137

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 137

ccccatagct gcccacat 18

<210> 138

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 138

tcggaactga gcaaagga 18

<210> 139

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 139

cggtttatga tccacagt 18

<210> 140

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 140

tgagcaaagg aatagtcac 19

<210> 141

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 141

tttctccctc tgccccata 19

<210> 142

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 142

gcaaaggaat agtcactcga 20

<210> 143

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 143

tgttttgcct cacaatcg 18

<210> 144

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 144

tgtccactta ttccaacg 18

<210> 145

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 145

gttttctccc tctgccccat a 21

<210> 146

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 146

gcaaaggaat agtcactcga 20

<210> 147

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 147

tattgttcca tcaatgtct 19

<210> 148

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 148

tgtccactta ttccaacg 18

<210> 149

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 149

acataaggat gtgcaagtt 19

<210> 150

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 150

agtagccatt gaagaagg 18

<210> 151

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 151

ttggaataag tggacaag 18

<210> 152

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 152

ccatcggcca tgcaccag 18

<210> 153

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 153

aagaaggtgg tgaagcag 18

<210> 154

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 154

gtcaaaggtg gaggagtg 18

<210> 155

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 155

ataataaagg ctcagataag 20

<210> 156

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 156

gattgctact cctgtagtc 19

<210> 157

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 157

ggctccagca ttgtgaga 18

<210> 158

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 158

attcagcgcc cattctta 18

<210> 159

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 159

ctctgtttcc aggacgtc 18

<210> 160

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 160

tgcttaggaa tcatttgg 18

<210> 161

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 161

gttcatttat ggtttcaga 19

<210> 162

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 162

ttggataatg ataaaggtc 19

<210> 163

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 163

gctttcaaga aatatcgg 18

<210> 164

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 164

ttgcaagtgt aaatgacct 19

<210> 165

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 165

ttacagtgac ctccaaagcc 20

<210> 166

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 166

ccattaccct cctctaccag 20

<210> 167

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 167

agctggagag ggatagcatt 20

<210> 168

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 168

tgcattgcat gaaagtagga 20

<210> 169

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 169

gtttggagac agggcg 16

<210> 170

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 170

ttatagttca ggctcttgtg tattt 25

<210> 171

<211> 523

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 171

tggtttacgg tttatgtcag tataaagcca caaatacaca agaaaagtgt atttttaaca 60

tccttgattt tgtacttgca tttttgtctt ggtaaattaa atagttcatc ctttagggaa 120

aaagttttta ggtgtgttgg tttgcagtaa ttgtgaaaca tggcagcctt ccctgttaac 180

actggccatt ggccccagga gagcagcaac caggatgtat aattagccct tctttttaca 240

ggttggcaac ctgtaattac agaaaacttt tggtttgttt gctaattcct tttttttttt 300

tttttaatat acattctagc tcctgggagc tacaactatt gaagacaagc tacaggatgg 360

agttccagaa accatttcaa aacttgcaaa agctgacatt aagatctggg tgcttactgg 420

agacaaaaag ggtaattcat tgtgcaggga agcatatctg ttaattcaca aatatttata 480

gctgccgttt cctttgccca agatgacctc ctcagacttt tca 523

<210> 172

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 172

ttccatcaat gtctgtcttt gttttttgtt tgctatggaa ccatttttat caactgatgt 60

tttgcctcac aatcggttta tgatccacag tgttttctcc ctctgcccca tagctgccca 120

cattggcgtt ggaataagtg gac 143

Claims

1.用于检测ATP8B1基因突变体或ATP8B1基因突变体编码的蛋白的试剂在下述Ⅰ～Ⅲ至少一种中的应用；

Ⅲ：制备辅助防治进行性家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ型的试剂盒；

所述ATP8B1基因突变体为复合杂合突变，所述复合杂合突变包括c.2113G>A和exon24-28del；所述ATP8B1基因突变体对应的野生型ATP8B1基因的cDNA序列参见Genbank登录号NM_005603.4。