CN114015799A - 一种麦根腐平脐蠕孢的lamp检测引物组、试剂盒及lamp检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种玉米根腐病病原菌麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测引物组、试剂盒及LAMP检测方法。该引物组包括1对外引物、1对内引物和1对环引物。利用本发明的引物组能够准确、快速的对麦根腐平脐蠕孢进行检测，特异性强。最短20min即可完成检测，检测下限能够达到10copies/μL DNA，大大提高了检测的效率，能够满足麦根腐平脐蠕孢的快速检测。

Description

一种麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测引物组、试剂盒及LAMP检测 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测引物组、试剂盒及LAMP检测方法。

背景技术

麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)是半活体营养型植物致病菌，可危害多种禾本科植物，是引起玉米根腐病的重要病原菌之一。麦根腐平脐蠕孢引起的玉米根腐病一般在3～6叶期即出现症状，表现为植株矮化，下部叶片黄化或枯死，根或茎基部组织上有水渍状或黑褐色病斑，或腐烂，或缢缩，严重影响植株地上部生长。发病轻的植株可逐渐恢复，但长势明显减弱，后期造成产量损失；重者死亡，造成缺苗断垄。

玉米根腐病是典型的土传性病害，其病原菌组成十分复杂，目前已知能够引起玉米根腐病的病原菌有40余种。玉米根腐病可由1种病原菌单独侵染或2种以上病原菌复合侵染引起发病，给病害的精准防控带来巨大挑战。因此，准确鉴定病原菌种类尤为重要。传统形态学鉴定技术对于人员的专业和经验要求较高，且大多情况下无法准确鉴定病原菌种类。随着PCR技术日臻成熟，基于PCR技术的快速分子诊断方法，被广泛应用于包括麦根腐平脐蠕孢在内的植物病原菌研究领域。较常规显微镜形态观察检测方法，PCR检测更为精准、高效和灵敏。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的等温扩增技术，因其操作简单快速、特异性、灵敏度高、成本低等特点，逐渐成为可以替代传统PCR的新的核酸扩增检测技术。它是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用BstDNA聚合酶的链置换活性在同一反应体系中恒温高效扩增，大量合成目的DNA的同时，产生副产物-白色焦磷酸镁沉淀。由于扩增反应依赖于靶DNA的6个独立的区域，因此特异性非常高，反应在等温条件下进行，则不需要PCR仪等昂贵设备，仅用水浴锅等能够维持稳定恒温的设备即可完成，检测成本大大降低，应用范围显著扩大，可以在田间进行实时监测。由于LAMP技术多方面的优点，近年来在病原物检测等方面应用广泛。专利CN111088394A以小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢(B.sorokiniana)的ITS为靶序列，建立了索氏平脐蠕孢寄主的LAMP检测技术，该反应体系在64℃水浴锅中反应60min，其检测的灵敏度为1pg，灵敏度较低，检测时间较长。

发明内容

本发明的目的是以参与黑色素合成途径的相关基因1,3,8-三羟基萘还原酶基因(3HNR)为靶标，提供一种麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测引物组，可快速检测麦根腐平脐蠕孢，灵敏度高，特异性强。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明的一个目的在于提供一种麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测引物组，所述引物组包括外引物对BSF3和BSB3、内引物对BSFIP和BSBIP、以及环引物对BSLF和BSLB，各引物对的序列如下：

BSF3：GAGGAGTTCGACCGTGTC；

BSB3：GCACCTGGTGAAAGTCTCA；

BSFIP：CATCTCCATGCGCTTGTACGCACCATCAACACTCGTGG；

BSBIP：ATCCTCATGGGATCCATCACCGTTTGAGCCAGAGTAGACAGC；

BSLF：TTGGCAACGAAGAACTGA；

BSLB：GTCAGGCAAAGGGTGT。

本发明的另外一个目的为提供一种检测麦根腐平脐蠕孢的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的上述引物组、RM反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和染料。

作为优选的，本发明的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括麦根腐平脐蠕孢基因组DNA或者含麦根腐平脐蠕孢3HNR基因的质粒DNA，所述阴性对照不含麦根腐平脐蠕孢基因组DNA或麦根腐平脐蠕孢3HNR基因。

优选的，本发明的试剂盒，包括2×RM反应缓冲液，100μM的外引物BSF3和BSB3，100μM的内引物BSFIP和BSBIP，100μM的环引物BSLF和BSLB，8000U/ml的Bst DNA聚合酶，TVR染料，麦根腐平脐蠕孢基因组DNA或者10¹～10⁵copies/μL含麦根腐平脐蠕孢3HNR基因的质粒DNA，阴性对照。

本发明还提供了上述LAMP检测引物组及试剂盒用于检测麦根腐平脐蠕孢中的应用。

本发明的另一个目的还在于提供一种检测麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测方法，该方法包括：提取待测样品的总DNA，用本发明的上述引物组在LAMP反应体系中进行扩增，通过反应体系的颜色变化判断麦根腐平脐蠕孢的有无。

优选的，本发明所述反应体系为：2×RM反应缓冲液12.5μL，100μM外引物BSF3和BSB3各0.1μL，100μM内引物BSFIP和BSBIP各0.4μL，100μM环引物BSLF和BSLB各0.2μL，8000U/ml Bst DNA聚合酶1μL，DNA模板1μL，TVR染料1μL，灭菌去离子水补足至25μL。

优选的，本发明所述扩增条件为：61℃～68℃反应20～40min，进一步优选所述扩增在66℃～68℃下扩增25～30min。

优选的，若反应体系呈现亮绿色为阳性反应，若反应体系呈无色为阴性反应。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)灵敏度高：本发明通过LAMP检测引物组对麦根腐平脐蠕孢进行LAMP扩增，检测下限能够达到10copies/μL DNA(相当于40ag/ul)，灵敏度大大提高。

(2)特异性强：本发明以麦根腐平脐蠕孢3HNR基因序列为靶标设计了一套LAMP特异引物，对麦根腐平脐蠕孢进行特异性识别，特异性强，能够快速准确完成麦根腐平脐蠕孢的检测。

(3)操作简便快捷：本发明提供的检测麦根腐平脐蠕孢的LAMP方法，克服了现有生物与化学检测方法样品处理繁琐，检测周期长、费时费力及需要PCR热循环仪等问题，该方法无需PCR反应中的退火、复性等温度的变化，最短20min即可完成检测，大大提高了检测的效率。

(4)成本低：本方法无需昂贵、精密的试验仪器设备，仅需要恒温水浴锅或保温杯即可完成检测，且实验过程中所用均为常规试剂，价格低廉。因此本方法实用性强，可满足麦根腐平脐蠕孢的快速检测。

附图说明

图1为本发明LAMP反应不同温度条件下的扩增曲线。

图2为本发明LAMP反应敏感性扩增曲线；

图3为本发明LAMP反应敏感性可视化检测；

图2-3中，a～g:10⁵,10⁴,10³,10²,10¹,10⁰,10^-1copies/μL模板DNA，h:阴性对照。

图4为本发明LAMP反应特异性扩增曲线；

图5为本发明LAMP反应特异性可视化检测；

图4-5中，a：麦根腐平脐蠕孢基因组DNA；b：含麦根腐平脐蠕孢3HNR基因的质粒DNA(10²copies/μL)；c～l：嘴突凸脐孢，链隔孢，弯孢菌，小柄凸脐蠕孢，拟轮枝镰孢，层出镰孢，禾谷镰孢，尖孢镰孢，玉米生平脐蠕孢，无菌水。

具体实施方式

本发明以麦根腐平脐蠕孢3HNR基因序列为靶标，进行LAMP特异引物设计。根据3HNR基因部分序列的6个区域设计了由2条外引物、2条内引物和2条环引物组成的引物组，各引物的序列分别如SEQ ID No.1～6所示。利用本发明的引物组能够准确、快速的对麦根腐平脐蠕孢进行检测，特异性强。

本发明利用上述引物组提供了一种检测麦根腐平脐蠕孢的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组、RM反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和染料。进一步还包括阳性对照和阴性对照。

本发明所述试剂盒中，RM反应缓冲液可以为本领域中的已知产品，优选包括40mMTris-HCl(pH 8.8)、20mM KCl、16mM MgSO₄、20mM(NH4)₂SO₄、0.2％Tween20、1.6M Betaine、2.8mM dNTPs(每种)。

本发明所述试剂盒中的染料可选择本领域中已知的LAMP核酸染料，包括但不限于TVR染料、FDR染料、HNB染料等。在本发明具体实施例中，优选采用TVR染料，根据反应前后颜色的变化判断麦根腐平脐蠕孢的有无。本领域技术人员可根据本领域的常规方式添加合适量的染料。

本发明中的阳性对照为包括麦根腐平脐蠕孢基因组DNA或者含麦根腐平脐蠕孢3HNR基因的质粒DNA。由于本发明检测麦根腐平脐蠕孢的灵敏度能够达到10copies/μLDNA，因此本发明的试剂盒中，麦根腐平脐蠕孢基因组DNA或者含麦根腐平脐蠕孢3HNR基因的质粒DNA大于10copies/μL均可以作为阳性对照。

本发明中的阴性对照不含麦根腐平脐蠕孢基因组DNA或麦根腐平脐蠕孢3HNR基因，在本发明实施例中，优选无菌水作为阴性对照。

作为一种实施方式，本发明的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测试剂盒优选为，包括2×RM反应缓冲液，100μM的外引物BSF3和BSB3，100μM的内引物BSFIP和BSBIP，100μM的环引物BSLF和BSLB，8000U/ml的Bst DNA聚合酶，TVR染料，10²copies/μL含麦根腐平脐蠕孢3HNR基因的质粒DNA，阴性对照。

利用本发明的上述LAMP引物组或LAMP试剂盒检测麦根腐平脐蠕孢具有灵敏度高，特异性好，检测时间短，方便快速的优点。

本发明提供了一种麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测方法，该方法包括，提取待测样品的总DNA，用本发明所述的引物组在LAMP反应体系中进行扩增，通过反应体系的颜色变化判断麦根腐平脐蠕孢的有无。

本发明对DNA的提取方法没有特殊限定，本领域中已知的DNA提取方法均可用于本发明中。在本发明实施例中，采用真菌基因组DNA快速提取试剂盒提取真菌DNA。

本发明中，所述反应体系优选为：2×RM反应缓冲液12.5μL，外引物BSF3和BSB3各0.1μL，内引物BSFIP和BSBIP各0.4μL，环引物BSLF和BSLB各0.2μL，Bst DNA聚合酶1μL，DNA模板1μL，TVR染料1μL，灭菌去离子水补足至25μL。

本发明中，所述LAMP扩增条件为：61℃～68℃反应20～40min，进一步优选为66～68℃下扩增25～30min，更优选的为66℃下扩增25min。

本发明根据染料的不同，通过反应体系的颜色变化判断麦根腐平脐蠕孢的有无。当反应体系中选用TVR染料时，反应体系呈现亮绿色为阳性反应，样品中有麦根腐平脐蠕孢；反应体系呈无色为阴性反应，样品中无麦根腐平脐蠕孢。当反应体系中选用FDR染料时，反应体系呈现绿色为阳性反应，样品中有麦根腐平脐蠕孢；反应体系呈橙色为阴性反应，样品中无麦根腐平脐蠕孢。当反应体系中选用HNB染料时，反应体系呈现天蓝色为阳性反应，样品中有麦根腐平脐蠕孢；反应体系呈紫色为阴性反应，样品中无麦根腐平脐蠕孢。

本发明对LAMP扩增所用的设备没有特别限定，只要是能提供恒温温度的设备都能用于本发明中。所述设备包括但不限于恒温水浴锅、金属浴或保温箱。在本发明具体实施例中，采用浊度仪提供LAMP反应的恒温条件。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

麦根腐平脐蠕孢DNA的提取：麦根腐平脐蠕孢接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基中(PDA：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g，蒸馏水1L，高温、高压灭菌20min)，28℃黑暗培养至少7d，收集菌丝体。采用真菌基因组DNA快速提取试剂盒(购自北京艾德莱生物科技有限公司)，按照使用说明书的操作方法提取麦根腐平脐蠕孢的基因组DNA，并将DNA保存在-20℃备用。

麦根腐平脐蠕孢3HNR基因扩增：以麦根腐平脐蠕孢基因组DNA为模板，采用引物Brn01和Brn02扩增麦根腐平脐蠕孢参与黑色素合成途径的相关基因1,3,8-三羟基萘还原酶基因3HNR。

Brn01：GCCAACATCGAGCAAACATGG；

Brn02：GCAAGCAGCACCGTCAATACCAAT。

PCR反应体系：2×EasyTaq PCR supermix 12.5μL，引物Brn01和Brn02(10μM)各0.5μL，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至25μL。

反应条件：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃1min，35个循环；72℃，10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

质粒构建：采用EasyPure Quick Gel Extraction kit回收扩增的3HNR基因片段，将其连接至pMD19-T克隆载体并转化至DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行菌液PCR验证，阳性克隆由上海生工生物工程股份有限公司完成测序。采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，-20℃保存备用。

实施例2

麦根腐平脐蠕孢LAMP引物设计

以获得的麦根腐平脐蠕孢3HNR基因序列为靶标，根据3HNR基因部分序列的6个区域设计了由2条外引物、2条内引物和2条环引物组成的引物组，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测引物组

实施例3

LAMP引物最佳反应温度筛选

检测麦根腐平脐蠕孢的LAMP扩增反应体系包括：2×RM反应缓冲液12.5μL，实施例2合成的100μM外引物BSF3和BSB3各0.1μL，100μM内引物BSFIP和BSBIP各0.4μL，100μM环引物BSLF和BSLB各0.2μL，8000U/ml Bst DNA聚合酶1μL，10²copies/μL实施例1制备的质粒DNA模板1μL，去离子水补足至25μL。

使用实时浊度仪对引物的最佳反应温度进行检测，预设温度为61～68℃，共8个处理。扩增反应条件为预设温度条件下孵育40min，然后在95℃孵育15min终止反应。通过分析浊度曲线，确定引物的最佳反应温度。

分析实时扩增浊度曲线(图1)，结果表明，在61℃～68℃条件下本发明引物组均能实现扩增。相较于61℃～65℃，实时扩增浊度曲线在66℃～68℃条件下起峰更早，浊度值更高，扩增效率更好。在66℃、67℃和68℃条件下实时扩增浊度曲线相近，考虑过高的温度会对Bst DNA聚合酶的活性造成更大影响，所以选择66℃为该引物组的最佳反应温度。

实施例4

LAMP反应的灵敏度检测

为检测LAMP反应的灵敏度，将实施例1中制备的含有3HNR基因的质粒DNA进行倍数稀释，分别以10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰、10^-1copies/μL的质粒作为模板DNA，同时以灭菌去离子水作为阴性对照的模板。

扩增体系为：2×RM反应缓冲液12.5μL，本发明实施例2合成的100μM外引物BSF3和BSB3各0.1μL，100μM内引物BSFIP和BSBIP各0.4μL，100μM环引物BSLF和BSLB各0.2μL，8000U/ml Bst DNA聚合酶1μL，DNA模板1μL，TVR染料1μL，最后用灭菌去离子水补足至25μL。

使用实时浊度仪采集扩增曲线，反应条件为66℃孵育40min，然后在95℃孵育15min终止反应。通过分析浊度曲线，同时采用可视颜色法直接观察反应液是否发生颜色变化，阳性反应呈亮绿色，而阴性呈无色，判断LAMP反应的最低检测浓度。

实时扩增浊度曲线表明，以10⁵～10¹copies/μL DNA为模板的反应均有扩增，而以10⁰和10^-1copies/μL DNA为模板的反应没有检测到扩增曲线(图2)。可视颜色法的结果显示，当模板DNA为10¹～10⁵copies/μL时，反应液呈现亮绿色的阳性反应，而以10⁰和10^{- 1}copies/μL DNA为模板的反应液呈无色的阴性反应(图3)，与实时浊度法的检测结果一致。由此可见，本发明针对麦根腐平脐蠕孢建立的LAMP检测技术的检测下限为10copies/μLDNA。

此外，根据实时浊度曲线显示，最低检测限浓度的模板仅需18min就有扩增反应，因此，在实际应用时推荐恒温扩增时间为20～30min，以25min为宜。

实施例5

LAMP反应的特异性检测

本实施例以从玉米根腐病样本上分离到的几种病原真菌的基因组DNA为模板进行扩增，同时以含有麦根腐平脐蠕孢3HNR基因的10²copies/μL质粒DNA为阳性对照，以无菌水为阴性对照，检测LAMP扩增反应的特异性。纯化、鉴定后的菌株信息见表2。

表2供试病原菌菌株

上述病原菌菌株基因组DNA的提取同实施例1，LAMP扩增反应的反应体系、条件及检测方法同实施例4。

实时扩增浊度曲线表明，以麦根腐平脐蠕孢基因组DNA和10²copies/μL质粒DNA为模板的反应均有扩增，而以玉米生平脐蠕孢、嘴突凸脐孢、链隔孢、弯孢菌、小柄凸脐蠕孢、拟轮枝镰孢、层出镰孢、禾谷镰孢和尖孢镰孢等菌株基因组DNA为模板的反应以及阴性对照均没有检测到扩增曲线(图4)。可视颜色法的结果显示，当模板为麦根腐平脐蠕孢基因组DNA和10²copies/μL质粒DNA时，反应液呈现亮绿色的阳性反应，而以其他菌株基因组DNA为模板的反应液以及阴性对照呈无色的阴性反应(图5)，与实时浊度法的检测结果一致。由此可见，本发明基于麦根腐平脐蠕孢3HNR基因建立的LAMP检测技术能够特异性检测麦根腐平脐蠕。

上述实施例为本发明最佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120> 一种麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测引物组、试剂盒及LAMP检测方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gaggagttcg accgtgtc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gcacctggtg aaagtctca 19

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

catctccatg cgcttgtacg ccaccatcaa cactcgtgg 39

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atcctcatgg gatccatcac cgtttgagcc agagtagaca gc 42

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ttggcaacga agaactga 18

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gtcaggcaaa gggtgt 16

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gccaacatcg agcaaacatg g 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gcaagcagca ccgtcaatac caat 24

Claims (10)

1.一种麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测引物组，其特征在于，所述引物组包括外引物对、内引物对和环引物对，所述外引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

2.一种检测麦根腐平脐蠕孢的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组、RM反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和染料。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括麦根腐平脐蠕孢基因组DNA或者含麦根腐平脐蠕孢3HNR基因的质粒DNA，所述阴性对照不含麦根腐平脐蠕孢基因组DNA或麦根腐平脐蠕孢3HNR基因。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，包括2×RM反应缓冲液，100μM的外引物BSF3和BSB3，100μM的内引物BSFIP和BSBIP，100μM的环引物BSLF和BSLB，8000U/ml的BstDNA聚合酶，TVR染料，麦根腐平脐蠕孢基因组DNA或者10¹～10⁵copies/μL的含麦根腐平脐蠕孢3HNR基因的质粒DNA，阴性对照。

5.权利要求1所述引物组或权利要求2～4任意一项所述的试剂盒在检测麦根腐平脐蠕孢中的应用。

6.一种麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测方法，其特征在于，提取待测样品的总DNA，用权利要求1所述的引物组在LAMP反应体系中进行扩增，通过反应体系的颜色变化判断麦根腐平脐蠕孢的有无。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应体系为：2×RM反应缓冲液12.5μL，外引物BSF3和BSB3各0.1μL，内引物BSFIP和BSBIP各0.4μL，环引物BSLF和BSLB各0.2μL，Bst DNA聚合酶1μL，DNA模板1μL，TVR染料1μL，灭菌去离子水补足至25μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增条件为：61℃～68℃反应20～40min。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增在66℃～68℃下扩增25～30min。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，若反应体系呈现亮绿色为阳性反应，若反应体系呈无色为阴性反应。

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