CN109971878A - 检测橡胶树褐根病病菌的lamp引物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测橡胶树褐根病病菌的LAMP引物组合物及其应用。本发明的检测橡胶树褐根病病菌的LAMP引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。基于该LAMP引物组合物建立的橡胶树褐根病病菌可视化检测方法，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。本发明的LAMP引物组合物及其检测方法能在田间实现橡胶树褐根病病菌的快速、灵敏、准确检测和鉴定，为橡胶树褐根病的早期预警及防控提供可靠的技术手段和理论依据。

Description

检测橡胶树褐根病病菌的LAMP引物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及农作物病害检测鉴定技术和分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)的LAMP引物组合物、试剂盒和应用，可实现橡胶树褐根病的早期诊断、病菌的监测和鉴定。
背景技术
天然橡胶是全球重要的工业原料和战略物资，是国防工业和高端装备生产中不可替代的重要原料，在我国主要分布于云南、海南、广东、广西、福建、台湾等地区。我国天然橡胶的种植面积和产量均居世界第五位，也是全球最大的消费国和进口国。褐根病是橡胶生长中一种毁灭性的土传病害，在世界各植胶区严重以及普遍发生，是限制我国橡胶单产提高的重要生物因子。该病害主要通过根系接触传染，染病植株因根部腐朽生长衰弱、树叶变黄、枯萎脱落，从黄化到枯死通常仅需半月至三个月。对天然橡胶产业造成较大的经济损失。
由有害层孔菌[Phellinus noxius(Corner)Corner G.H.Cunn.]引起的橡胶树褐根病是天然橡胶生产中危害最为严重的根部病害，发生严重的林段发病率达10％以上，且死树率高。褐根病发生早期不易被发现，待其出现病症时，病菌危害已十分严重，防治十分困难。因此，建立快速、准确、灵敏、高效的检测技术，及时检测出树体中的病原菌并采取科学有效的防治措施，对控制橡胶树褐根病的传播蔓延具有重要作用。
目前对橡胶树褐根病菌的检测以病症识别及组织分离病原菌为主，但传统方法往往专业性强、耗时长、灵敏度低，难以达到快速诊断和检测的目的；利用分子生物学技术检测该病病原菌方法有常规PCR方法(梁艳琼等，2016)，虽然能够快速、准确检测出病原，但需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器设备和分子生物学专业的实验人员操作，不适宜在基层以及田间大规模应用，使田间病情无法及时、准确的检测及有效防控。
LAMP是一种在恒温条件下，快速、高效、特异的扩增靶序列的核酸扩增技术(Notomi et al.,2000)，该技术在短时间内可实现大量扩增，60℃～65℃恒温反应30min～60min内便能达到109～1010倍的扩增，在反应产物中添加荧光染料通过颜色变化来判断扩增结果，其特异性和灵敏性高，且不需要昂贵仪器设备，仅需在恒温水浴锅内即可完成，具有操作快速简便、特异性强、灵敏度高、检测成本低等特性。目前该技术已在植保等诸多领域得到广泛应用，极大提高了鉴定效率和准确率。迄今，还未见应用LAMP技术对橡胶树褐根病病原菌进行检测的报道，因此建立高效、快速的橡胶树褐根病菌LAMP检测技术可为橡胶树褐根病的发生和防治提供重要的技术手段。
发明内容
本发明的目的是克服传统诊断方法的繁琐、耗时长、准确度低和经验要求高以及PCR检测技术所需昂贵仪器设备、不便在田间直接检测等问题，提供一种橡胶树褐根病病菌LAMP检测引物以及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。
本发明另一目的在于提供上述快速检测方法在橡胶树褐根病的早期诊断、病菌的监测和鉴定中的应用。
本发明的第一方面提供了一种用于橡胶树褐根病病菌LAMP快速检测的引物组合物。
一种用于橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP快速检测的引物组合物，由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成，各引物核苷酸序列为：
F3：5’-TTTGAGTGTCATGTTAATCTCA-3’(序列表中序列1)；
B3：5’-TCAAAGTTAAGTGTTTGTCTCAT-3’(序列表中序列2)；
FIP：5’-CTAATGTATTCAAGAGAAGCCGACTCTAAAAAGTGTTGAT
ATTGGACTTG-3’(序列表中序列3)；
BIP：5’-CTGGGCTTTTGCTCGAGTAATTGGACGATTAGAAGC
AGACTCT-3’(序列表中序列4)。
本发明的第二个方面在于，提供一种可以快速检测橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)的LAMP检测试剂盒。
本发明提供的可以快速检测橡胶树褐根病病菌的LAMP试剂盒包含所述的引物组合物。即包含正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP。所述引物组的各引物可分别单独包装。
本发明的第三个方面是提供如第一个方面所述的引物组合物或本发明第二个方面所述的试剂盒在快速检测引起橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)的应用。
本发明的第四个方面是提供一种用于快速检测橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)的方法，该方法包括使用本发明第一个方面所述的引物组合物或本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物组进行扩增的步骤。其包括：
(1)提取待测样品DNA；
(2)以提取DNA为模板，利用第一个方面所述的LAMP引物组合物或本发明第二个方面所述的试剂盒进行LAMP扩增；
(3)LAMP扩增反应结束，按照以下任意三种方式观察结果：
1)通过肉眼直接观察反应液颜色是否为白色浑浊，有白色浑浊即为阳性，表明含有橡胶树褐根病病菌，否则为阴性，不含有橡胶树褐根病病菌；
2)取扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增结果。若电泳图谱有梯状条带为阳性，表明含有橡胶树褐根病病菌；否则为阴性；
3)向扩增产物中加入1uL荧光显色剂SYBR Green I，观察颜色变化。若LAMP扩增产物由橙色变为绿色为阳性，表明含有橡胶树褐根病病菌；颜色保持橙色不变，为阴性。
本发明中，将所述待测样品的基因组进行PCR扩增的条件不受特别限制。其中，步骤(2)所述LAMP扩增的反应体系为25μL，包括2.5μmol/L的F3和B3各2μL；20mmol/L的FIP和BIP各1.5μL；10mmol/L dNTPs 3.5μL；25mmol/L MgSO4 6μL；10mol/L甜菜碱2μL；10×Bst-DNA polymerase buffer 2.5μL；8U Bst3.0DNA polymerase 1μL；10～100ng/μL的DNA模板1μL；ddH2O 2μL。
步骤(2)所述LAMP扩增的反应条件可在60℃～65℃进行。
所述LAMP扩增的反应条件优选为：63℃保温60min。
所述的显色剂为SYBR Green I。
本发明提供了用于橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP检测的特异性引物组F3、B3、FIP、BIP及含有该引物组的LAMP试剂盒。本发明可快速准确地对橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)引起的多种林木病害进行分子鉴定和病害的早期诊断，对橡胶树褐根病的监测和防治具有重要意义。
本发明提供的利用本发明的引物组合物快速检测橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)的分子生物学方法，具有简便高效、特异性强、灵敏度高和检测结果易观察等特点，与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.简便快捷：本发明检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能完成，通过扩增产物的颜色变化就可判断结果，无需依赖热循环PCR仪以及凝胶成像仪等昂贵仪器设备；
2.效率高：本发明检测方法检测时间短，整个检测过程可在1.5h内完成，大幅缩短了检测时间，提高了检测效率。而普通PCR扩增时间较长，通常需要3h～4h才能完成。
3.特异性强：本发明检测方法针对靶基因的6个独立区域设计出对橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)具有特异扩增作用的4条LAMP引物。已经对不同地理来源的橡胶树褐根病菌、橡胶树红根病菌、橡胶树白根病菌、橡胶树紫根病菌、橡胶树炭疽病菌、芒果炭疽病菌、柱花草炭疽病菌、剑麻斑马纹病菌进行了LAMP检测，只有橡胶树褐根病病菌的DNA呈现阳性，说明本发明所设计的引物及检测方法用于检测橡胶树褐根病病菌准确可靠。
4.灵敏度高：本发明所建立的检测方法对橡胶树褐根病病菌DNA的最低检测限为1pg/μL，具有很高的灵敏度。
综上所述，本发明所建立的检测方法能快速、准确的检测出橡胶树褐根病病菌菌株，为科研和生产实践提供了一种特异性强、灵敏度高、可操作性强以及成本低廉的检测技术，该技术可应用于橡胶树褐根病病菌的早期快速检测以及病害监测预警和及时防治提供理论基础和技术指导，具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明LAMP引物组设计的具体位置图。
图2为本发明LAMP检测方法对橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)的反应温度优化结果：上图为可视化显色结果(SYBR Green I)；下图为2％琼脂糖凝胶电泳检测结果。上图可视化显色结果中2～8显示绿色荧光，1阴性对照不显示绿色荧光。下图中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道1为阴性对照，泳道2～泳道8的温度分别为57℃、58℃、59℃、60℃、63℃、64℃、65℃。
图3为本发明LAMP检测方法对橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)的特异性检测结果：上图为可视化显色结果(SYBR Green I)；下图为2％琼脂糖凝胶电泳检测结果。上图可视化显色结果中12～15显示绿色荧光，其它不显示绿色荧光。下图中泳道M为2000bpDNA Marker，泳道1为阴性对照，2～5为采自不同地区的橡胶树红根病菌，6为橡胶树炭疽病菌，7为芒果炭疽病菌，8为橡胶树紫根病菌，9为柱花草炭疽病菌，10为橡胶树白根病菌，11为剑麻斑马纹病菌，12～15为橡胶树褐根病菌。
图4为本发明LAMP检测方法对橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)的灵敏度检测结果：上图为可视化显色结果(SYBR Green I)；下图为2％琼脂糖凝胶电泳检测结果。上图可视化显色结果中2～7显示绿色荧光，其它不显示绿色荧光。下图中泳道M为2000bp DNAMarker，泳道1为阴性对照；泳道2～泳道11的橡胶树褐根病病菌的模板DNA浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL。
图5为本发明LAMP检测方法提供的以F3和B3引物进行的普通PCR灵敏度的检测结果。泳道M为2000bp DNA Marker，泳道1为阴性对照，泳道2～泳道11的橡胶树褐根病病菌的模板DNA浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/uL。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。
实施例1、橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP检测引物组合物的设计
根据本实验室获得的引起橡胶树褐根病的有害层孔菌(Phellinus noxius)菌株的ITS序列与NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)有害层孔菌ITS基因序列以及其他属或种同源性ITS序列做多重比对，获得有害层孔菌ITS序列多态性丰富(特异性)区域。利用在线软件primer explorer 4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)对多态性丰富或特异性区域进行引物设计，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)，如图1所示，其核苷酸序列分别为：
F3：5’-TTTGAGTGTCATGTTAATCTCA-3’(序列表中序列1)；
B3：5’-TCAAAGTTAAGTGTTTGTCTCAT-3’(序列表中序列2)；
FIP：5’-CTAATGTATTCAAGAGAAGCCGACTCTAAAAAGTGTTG
ATATTGGACTTG-3’(序列表中序列3)；
BIP：5’-CTGGGCTTTTGCTCGAGTAATTGGACGATTAGAAGCA
GACTCT-3’(序列表中序列4)。
实施例2、橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP可视化检测方法的建立
1.LAMP扩增体系的建立
利用实施例1制备所得引物组合物，以橡胶树褐根病病菌菌株DNA为模板进行LAMP扩增。LAMP反应体系25μL，包括2.5μmol/L的F3和B3各2μL；20mmol/L的FIP和BIP各1.5μL；10mmol/L dNTPs 3.5μL；25mmol/L MgSO4 6μL；10mol/L甜菜碱2μL；10×Bst-DNApolymerase buffer 2.5μL；8U Bst 3.0DNA polymerase 1μL；10～100ng/μL的DNA模板1μL；ddH2O 2μL。
将上述25μL LAMP反应体系迅速置于不同温度(57℃、58℃、59℃、60℃、63℃、64℃、65℃)下进行LAMP反应，反应1h后，置于85℃灭活8min，终止反应。
2.LAMP反应结果判定
通过3种方法可判断LAMP反应结果：(1)通过肉眼直接观察扩增反应液颜色是否有白色浑浊，如有白色浑浊则表明含有橡胶树褐根病病菌，反之，则说明不含有橡胶树褐根病病菌；(2)取扩增反应液用2％琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像仪下观察扩增结果，如观察到有连续梯状条带，说明所述待测样品含有橡胶树褐根病病菌，反之，则说明不含有橡胶树褐根病病菌；(3)向扩增产物中加入1uL荧光显色剂SYBR Green I，通过肉眼直接观察颜色变化，如果LAMP扩增反应液由橙色变为绿色，则说明待测样品含有橡胶树褐根病病菌，反之，反应液为橙色不变，则说明不含有橡胶树褐根病病菌。
结果如图2所示，LAMP扩增的反应条件可在60℃～65℃进行，最优的反应条件为63℃保温60min。图2中，上图为可视化显色结果(即添加荧光显色剂SYBR Green I)；下图为2％琼脂糖凝胶电泳检测结果。上图可视化显色结果中2～8显示绿色荧光，1阴性对照不显示绿色荧光。下图中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道1为阴性对照，泳道2～泳道8的温度分别为57℃、58℃、59℃、60℃、63℃、64℃、65℃。
实施例3、橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP反应特异性检测
本实验采用4株不同来源的橡胶树褐根病菌(Phellinus noxius)和供试的其它病原菌10株，其它病原菌包括：橡胶树红根病病菌(Ganoderma pesudoferreum)4株、橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、芒果炭疽病菌(Collectotrichungloeosporioides)、橡胶树紫根病菌(Helicobasidium compactum)、柱花草炭疽病菌(Collectotrichun gloeosporioides)、橡胶树白根病菌(Rigidoporus lignosus)和剑麻斑马纹病菌(Phytophora nicotianae)各1株用真菌DNA提取试验盒(Fungal DNA Kit，美国Omega公司)提取上述菌株的DNA作为模板，利用实施例1制备所得引物组和实施例2建立的反应体系，分别进行LAMP扩增。当模板中含橡胶树褐根病病菌的反应产物加入SYBR GreenI呈现绿色(图3)，用2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增产物均出现梯状条带；而其它10个阴性对照病原菌及空白对照则没有出现任何条带，扩增反应液均保持橙色(见图3)。试验结果验证本发明的LAMP检测方法具有很好的特异性。上述病原菌均通过现有的方法分离并进行了分子鉴定。
实施例4、橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP反应灵敏度检测
本实验用真菌DNA提取试验盒(Fungal DNA Kit，美国Omega公司)提取橡胶树褐根病菌的DNA作为模板，同时将其基因组DNA的浓度调为100ng/μL，按10倍梯度(10-1～10-7)稀释至10-7ng/μL分别作为模板，利用实施例1制备所得引物组和实施例2建立的反应体系，分别进行LAMP扩增。待LAMP反应结束后，在LAMP扩增反应液中加入1.0μL荧光染料显色剂SYBRGreen I，当模板浓度为1×10-3ng/μL时，显色结果观察到反应液颜色由橙色变为绿色(图4)；经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可见明显的梯状条带(图4)，与显色结果一致。由此表明LAMP检测的最低检测限度为1×10-3ng/μL即1pg/μL。
对比例、橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)的普通PCR灵敏度检测
利用本发明中正向外侧引物F3和反向外侧引物B3为引物，进行普通PCR扩增，检测其对橡胶树褐根病病菌的灵敏性。
本发明普通PCR扩增的反应体系为25μL，包括dNTPs 2μL，10×Ex Taq buffer2.5μL，引物F3、B3各1μL，ExTaq酶0.5μL，模板1μL，ddH2O补充至25μL。
PCR扩增的反应程序为：94℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃1min，扩增35个循环，72℃10min；12℃保存。
本试验PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，当橡胶树褐根病菌DNA浓度≥1ng时，利用引物对F3/B3可扩增获得特异性DNA条带，但当浓度小于1ng，则扩增无条带(图5)。试验表明，普通PCR可检测橡胶树褐根病病菌基因组DNA浓度需≥1ng。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。凡依本发明申请专利范围所做的均等变化和修改，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
<120> 检测橡胶树褐根病病菌的LAMP检测引物组合物及其应用
<130> WHOI190015
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tttgagtgtc atgttaatct ca 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tcaaagttaa gtgtttgtct cat 23
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ctaatgtatt caagagaagc cgactctaaa aagtgttgat attggacttg 50
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ctgggctttt gctcgagtaa ttggacgatt agaagcagac tct 43

Claims (10)

1.检测橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)的LAMP引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
2.一种检测橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)的试剂盒，包括权利要求1所述的LAMP引物组合物。
3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。
4.一种橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的橡胶树褐根病病菌LAMP引物组合物进行LAMP反应，LAMP反应体系为25μL，包括2.5μmol/L的序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA各2μL；20mmol/L的序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA各1.5μL；10mmol/L dNTPs 3.5μL；25mmol/L MgSO46μL；10mol/L甜菜碱2μL；10×Bst-DNA polymerase buffer 2.5μL；8U Bst 3.0 DNApolymerase 1μL；10～100ng/μL的DNA模板1μL；ddH2O 2μL。
5.根据权利要求4所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP反应条件为60℃～65℃温育60min，85℃灭活8min，终止反应。
6.一种橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取待检测样品DNA；
(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组合物或权利要求2或3所述试剂盒进行LAMP扩增；
(3)LAMP扩增产物结果观察，判定样品DNA中是否含有橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)，可通过3种方法进行判断：1)通过肉眼直接观察扩增产物颜色，是否有白色浑浊，若有白色浑浊则含有橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)，反之，则不含有；2)通过2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，是否产生梯形条带，若形成梯形条带则含有橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)，反之则不含有；3)加入荧光显色剂，观察扩增产物是否变为绿色，若变为绿色则含有橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)，若扩增产物保持橙色，则不含有。
7.根据权利要求6所述的LAMP快速检测方法，其特征在于，所述的荧光显色剂为SYBRGreen I。
8.根据权利要求7所述的LAMP快速检测方法，所述LAMP扩增按照权利要求4或5所述的LAMP检测方法进行。
9.权利要求1所述的LAMP引物组以及权利要求2或3所述的试剂盒在检测橡胶树褐根病中的应用。
10.根据权利要求8所示的应用，其特征在于：所述检测橡胶树褐根病为橡胶树褐根病的早期诊断、橡胶树褐根病病菌的鉴定或橡胶树褐根病病情监测。
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