CN108315473A - 一种用于水稻稻曲病病菌lamp快速检测的引物组合物及其应用 - Google Patents

一种用于水稻稻曲病病菌lamp快速检测的引物组合物及其应用 Download PDF

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杨雪
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Abstract

本发明公开了一种用于水稻稻曲病病菌LAMP快速检测的引物组合物及其应用。本发明的引物组合物，由以下引物组成：F3、B3、BIP、FIP及Loop F和Loop B。利用该引物组合物进行水稻稻曲病病菌的LAMP快速检测，特异性强、灵敏度高，因此，本发明所述的引物组合物可在检测和/或鉴定水稻稻曲病病菌中应用，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为稻曲病的早期预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态社会和经济效益都具有现实而深远的意义。

Description

一种用于水稻稻曲病病菌LAMP快速检测的引物组合物及其 应用
技术领域
本发明涉及农作物病害检测鉴定技术和分子生物学技术领域，具体涉及一种用于水稻稻曲病病菌LAMP快速检测的引物组合物及其应用。
背景技术
稻曲病(Ustilaginoidea virens)是一种世界性的水稻穗部病害，又称伪黑穗病、绿黑穗病、谷花病、青粉病，俗称“丰产果”。该病只发生于穗部，为害部分谷粒。受稻曲病菌为害的水稻表现为谷粒内形成菌丝块渐膨大，内外颖裂开，露出淡黄色块状物，即孢子座，后包于内外颖两侧，呈黑绿色，初外包一层薄膜，后破裂，散生墨绿色粉末，即病菌的厚垣孢子，有的两侧生黑色扁平菌核，风吹雨打易脱落。河北、长江流域及南方各省稻区时有发生。在我国多个省份均有发生，严重影响我国水稻生产和粮食安全。为了阻止稻曲病传播范围的不断扩大，对其进行快速、准确的检测鉴定尤为重要。
近年来随着分子生物学相关技术的发展，基于PCR的方法已经成功用于检测水稻稻曲病病菌，尽管以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷，但由于检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统仪等昂贵的专业仪器设备，同时需要操作人员具有一定的分子生物学专业技能，并且只能在实验室条件下完成，需要较长的时间，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。
环介导等温扩增技术(Loop‐mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等开发的一种恒温扩增方法，该方法针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种具有链式置换活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)，在恒温条件下(60℃左右)保温30‐90分钟，即可完成扩增反应。由于该反应过程中产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过颜色变化来判断，因此不需要专业的仪器设备，在普通水浴锅中或者其他稳定热源即可完成，具有简单、快速、高效、经济等特征。凭借快速灵敏的优越性，LAMP技术已在多种花卉、植物、农作物常见病虫害的快速检测中得到了应用，极大的提高了针对植物病虫害的鉴定效率和准确率，为进一步采取适宜的防控措施控制其危害提供了便利，但目前在水稻稻曲病病菌的检测中尚无相关报道。
发明内容
本发明提供了一种用于水稻稻曲病病菌LAMP快速检测的引物组合物。
本发明还提供该引物组合物的应用。
本发明进一步提供一种水稻稻曲病病菌LAMP快速检测方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种用于水稻稻曲病病菌LAMP快速检测的引物组合物，其特征在于，由一对外引物F3、B3、一对内引物FIP、BIP和一对环引物Loop F、Loop B组成，所述的F3、B3、FIP、BIP、Loop F和Loop B的引物序列分别如下所示：
F3：5'-GCTCCTGGGATTCTTTGGTG-3'；
B3：5'-GCTCGATCGGGACAACCA-3'；
FIP：5'-TTGTCGCGTTGCAAGGACACGGGCATTCGACTCGGAACAG-3'；
BIP：5'-TTCACTGACATGTGCGCTGACCCGGTTTCGTGGAACGGATT-3'；
Loop F：5'-CGATTACCGTGCGTGTTGGA-3’
Loop B：5'-TCCGCAGTTGAAAATATGG-3'。
所述的LAMP引物组合物在制备水稻稻曲病病菌检测试剂中的应用。
所述的LAMP引物组合物在检测和/或鉴定水稻稻曲病病菌中的应用。
一种用于检测水稻稻曲病病菌的试剂，包含本发明所述的引物组合物。
一种水稻稻曲病病菌LAMP快速检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待检样品DNA；
(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组合物进行LAMP扩增；
(3)LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：
1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，观察颜色变化；
2)取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，观察扩增结果；
如果LAMP扩增产物显示黄绿色，电泳图谱为梯状条带，表明含有稻曲病菌菌株；如果扩增产物为橙红色，电泳图谱无扩增条带，表明不含有稻曲病菌菌株。
其中，步骤(2)所述LAMP扩增的反应体系优选为25μL，由下列浓度体积的组分组成：
用无菌双蒸水补充扩增体系体积到25μL。
步骤(2)所述LAMP扩增的反应条件优选为：65℃保温60min。
所述的显色剂为SYBR Green I。
LAMP反应体系优化
1.1 Bst DNA聚合酶的优化为了节省检测成本，保证该检测方法的稳定性和可靠性，实验对Bst DNA聚合酶的用量进行了优化。根据Bst DNA聚合酶的浓度，从4U-8U进行了梯度优化，确定了LAMP反应最适Bst DNA聚合酶单位为8U。
1.2 Mg2+浓度的优化Mg2+浓度的高低，会影响到反应的扩增效率，实验在25μL反应体系中加入MgCl2(25mM)从0.8μL到4μL，以0.8μL递增，以确定最佳Mg2+浓度为2.0μL。
1.3引物浓度的优化此步骤的目的是确定获得最适的引物浓度。引物浓度过高，会增大检测成本；当引物浓度过低时，扩增效率也会受到影响。实验在25μL反应体系中分别将外引物对F3/B3及内引物对FIP/BIP按不同的配比加入，从1:4、1:6及1:8的配比中，确定了最佳引物浓度配比为1:8。
1.4为了得到最适的反应温度和时间，保证该检测方法的高效性，实验对反应参数中的反应温度(60-65℃)及时间(45-90min)进行了优化，最终确定最适的反应温度和时间分别为65℃和60min。
本发明提供的快速检测稻曲病菌的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：
1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程；
2、检测高效性：该检测方法所用检测时间不到1小时，而PCR扩增时间较长，一般需要几个小时，这样大大缩短了检测时间，提高了检测效率；
3、特异性强：该方法通过3对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；
4、本发明是国内外首次利用LAMP技术对稻曲病菌进行检测，这种方法快速简便，对病害的准确诊断、及时了解病原发展动态、指导科学用药，以及降低成本和减少环境污染具有重要的现实意义；
5、所采集的22份水稻种子的LAMP检测结果与传统分离鉴定及分子生物学鉴定结果完全吻合。
综上所述，本发明具有比现有普通PCR技术检测稻曲病菌的方法具有更高的特异性、灵敏度和可操作性。该技术可应用于对稻种的检验检疫及田间植物上水稻稻曲病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。
附图说明
图1为LAMP扩增产物显色图来验证特异性
图中1和2反应管呈阳性反应，显黄绿色，3-20反应管呈阴性反应，显橙红色，其中1-2分别为稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)(strain1)、稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)(strain2)；3-19分别为链格孢菌(Alternaria alternata)、枇杷褐斑病菌(Ascochyta eriobotryae)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorkiniana)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、壳座月孢菌(Coniella granati)、葡萄白腐病菌(Coniothyrium diplodiella)、色二孢(Diplodia sp.)、水稻恶苗病菌(Fusariumfujikuroi)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)、炭疽病菌(Glomerella acutata)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、黑孢霉菌(Nigrospora sphaerica)、茶拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis theae)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)的DNA，N为无菌双蒸水(阴性对照)；
图2为LAMP检测稻曲病菌的灵敏度(模板进行梯度稀释)
A.LAMP扩增产物电泳图
图中M：2000bp Marker；1-9表示在25μL的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg稻曲病菌DNA为模板，进行LAMP等温扩增反应，分别取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，得到的相应的电泳图谱，其中1-8泳道的图谱为梯状条带，呈阳性反应，表示有扩增；9泳道的图谱为无扩增条带，呈阴性反应，表示没有扩增，电泳结果表明LAMP反应的灵敏度达到1pg，N为无菌双蒸水(阴性对照)；由图可以看出，LAMP反应的灵敏度达到1pg。
B.PCR扩增产物电泳图
图中M：2000bp Marker；1-9表示在25μL的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg的稻曲病菌DNA为模板，进行PCR扩增反应，分别取扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳中电泳，得到的相应的电泳图谱，其中1-5泳道的图谱为有扩增条带，呈阳性反应，表示有扩增；6-9泳道的图谱为无扩增条带，呈阴性反应，表示没有扩增，N为无菌双蒸水(阴性对照)；由图可以看出PCR反应的灵敏度只能达到1ng。
图3为LAMP检测技术用于水稻种子样品检测
图中1为稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)阳性对照(黄绿色)；2为无菌双蒸水阴性对照(橙红色)；3-24分别为22个不同的水稻种子样品，图中3、5、6、10、13、15、16、17、18、19、21、23、24显黄绿色，表示水稻种子样品中含有稻曲病菌；图中4、7、8、9、11、12、14、20、22显橙红色，表示水稻种子样品中不含有稻曲病菌。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1 LAMP引物的设计
从GenBank中下载稻曲病菌的UvG-β1基因(登录号：GU014921.1)基因序列进行比对，选择特异性高的一段基因序列，采用PrimerExplorerV4软件设计LAMP检测引物，包括2条外引物(F3和B3)、2条内引物(FIP和BIP)和两条环引物(Loop F和Loop B)，引物序列分别为：
F3：5'-GCTCCTGGGATTCTTTGGTG-3’；
B3：5'-GCTCGATCGGGACAACCA-3’；
FIP：5'-TTGTCGCGTTGCAAGGACACGGGCATTCGACTCGGAACAG-3’；
BIP：5'-TTCACTGACATGTGCGCTGACCCGGTTTCGTGGAACGGATT-3’；
Loop F：5'-CGATTACCGTGCGTGTTGGA-3’；
Loop B：5'-TCCGCAGTTGAAAATATGG-3'。
所有引物合成量均为1OD，用ddH2O溶解后分装，其中F3和B3的终浓度为10μM，FIP和BIP的终浓度为40μM，Loop F和Loop B的终浓度为20μM，4℃保存备用。
实施例2 LAMP扩增体系的建立
LAMP扩增的反应体系设为25μL，由下列浓度体积的组分组成：
用无菌双蒸水补充扩增体系体积到25μL。
LAMP扩增的反应条件为：65℃保温60min。
其中的显色剂为SYBR Green I。
实施例3 LAMP反应特异性试验
本实验采用稻曲病菌和17种其他常见农作物病原菌为供试材料(见表1)，用CTAB法提取稻曲病菌及其他常见农作物病原菌基因组DNA作为模板，参照实施例2优化的反应体系，分别进行LAMP扩增，结果显示，当模板为稻曲病菌时，反应产物颜色为黄绿色；当模板为其他17种常见农作物病原菌时，反应产物颜色为橙红色(图1)。本实验可以很好的证明本发明的LAMP反应对于稻曲病菌具有优异的特异性。
表1本实施例中用于筛选引物特异性的菌株
菌株 数目 用LAMP引物扩增结果
Ustilaginoideavirens 2 +
Alternariaalternate 1 －
Ascochytaeriobotryae 1 －
Bipolarissorkiniana 1 －
Botryosphaeriadothidea 1 －
Coniellagranati 1 －
Coniothyriumdiplodiella 1 －
Diplodiasp. 1 －
Fusariumfujikuroi 1 －
Fusariumoxysporum 1 －
Gaeumannomycesgraminis 1 －
Glomerelaacutata 1 －
Monilniafructicola 1 －
Nigrosporasphaerica 1 －
Pestalotiopsistheae 1 －
Fusariumgraminearum 1 －
Pyriculariagrisea 1 －
Sclerotiniasclerotiorum 1 －
上表中：+表示LAMP引物扩增产物有颜色变化；－表示扩增产物无颜色变化。
实施例4 LAMP反应灵敏度试验
为了检测LAMP反应的灵敏度，本实验首先用CTAB法提取稻曲病菌的基因组DNA，利用实施例2建立的LAMP反应扩增体系，在25μL的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg的稻曲病菌DNA为模板，进行LAMP等温扩增反应，反应结束后，分别取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，得到的相应的电泳图谱，其中1-8泳道的图谱为梯状条带，呈阳性反应，表示有扩增；9-11泳道的图谱为无扩增条带，呈阴性反应，表示没有扩增，电泳结果表明LAMP反应的灵敏度达到1pg(图2A)。以同样的梯度浓度进行常规的PCR扩增，结果表明普通PCR检测下限仅为1ng(图2B)。
实施例5LAMP技术在检测稻种样品中的应用
首先用CTAB法提取22份水稻种子的DNA，在利用实施例2建立的LAMP反应扩增体系，在25μL的反应体系中分别以22份水稻种子的DNA为模板，进行LAMP等温扩增反应；反应结束后，分别加入荧光染料，观察颜色变化，结果见图3，图中1为稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)阳性对照，呈现黄绿色；2为无菌双蒸水阴性对照，呈橙红色；3-24分别为22个不同的水稻种子样品，图中3、5、6、10、13、15、16、17、18、19、21、23、24显黄绿色，表示水稻种子样品中含有稻曲病菌；图中4、7、8、9、11、12、14、20、22显橙红色，表示水稻种子样品中不含有稻曲病菌。
序列表
<110> 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所
<120> 一种用于水稻稻曲病病菌LAMP快速检测的引物组合物及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Ustilaginoidea virens)
<400> 1
gctcctggga ttctttggtg 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Ustilaginoidea virens)
<400> 2
gctcgatcgg gacaacca 18
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Ustilaginoidea virens)
<400> 3
ttgtcgcgtt gcaaggacac gggcattcga ctcggaacag 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Ustilaginoidea virens)
<400> 4
ttcactgaca tgtgcgctga cccggtttcg tggaacggat t 41
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Ustilaginoidea virens)
<400> 5
cgattaccgt gcgtgttgga 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Ustilaginoidea virens)
<400> 6
tccgcagttg aaaatatgg 19

Claims (8)

1.一种用于水稻稻曲病病菌LAMP快速检测的引物组合物，其特征在于，由一对外引物F3、B3、一对内引物FIP、BIP和一对环引物Loop F、Loop B组成，所述的F3、B3、FIP、BIP、LoopF和Loop B的核苷酸序列分别如下所示：
F3：5'-GCTCCTGGGATTCTTTGGTG-3'；
B3：5'-GCTCGATCGGGACAACCA-3'；
FIP：5'-TTGTCGCGTTGCAAGGACACGGGCATTCGACTCGGAACAG-3'；
BIP：5'-TTCACTGACATGTGCGCTGACCCGGTTTCGTGGAACGGATT-3'；
Loop F：5'-CGATTACCGTGCGTGTTGGA-3’
Loop B：5'-TCCGCAGTTGAAAATATGG-3'。
2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在制备水稻稻曲病病菌检测试剂中的应用。
3.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测和/或鉴定水稻稻曲病病菌中的应用。
4.一种用于检测水稻稻曲病病菌的试剂，其特征在于包含权利要求1所述的引物组合物。
5.一种水稻稻曲病病菌LAMP快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取待检样品DNA；
(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组合物进行LAMP扩增；
(3)LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：
1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，观察颜色变化；
2)取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，观察扩增结果；
如果LAMP扩增产物显示黄绿色，电泳图谱为梯状条带，表明含有稻曲病菌菌株；如果扩增产物为橙红色，电泳图谱无扩增条带，表明不含有稻曲病菌菌株。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增的反应体系为25μL，由下列浓度体积的组分组成：
用无菌双蒸水补充扩增体系体积到25μL。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增的反应条件为：65℃保温60min。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述的显色剂为SYBR Green I。
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