CN109777861A - 错配耐受的环介导等温扩增方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种错配耐受的环介导等温扩增方法及应用。本发明的方法对于扩增反应的反应体系进行了优化，特别是DNA聚合酶的选用。本发明的方法可良好地应用于基于环介导等温扩增的检测，与传统方法相比，简便、快速、灵敏、准确，具有更高的检出率和更短的检测时间。

Description

错配耐受的环介导等温扩增方法及应用

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，更具体地说，本发明涉及用于检测多种病原体的错配耐受的环介导等温扩增(LAMP)检测方法及应用，本发明还涉及基于该方法设计的病原体检测试剂盒。

背景技术

传染病病原检测是新发突发传染病防控的关键，快速准确的诊断对于预防、治疗和控制尤其关键。特别是新发突发疫情发生时候，现场快速的床边诊断技术尤为关键。

点突变、缺失和插入突变所造成的基因理化特性改变甚微，进行相关的检测的准确性常常难以保证。现有技术中对单核苷酸突变位点的检测技术主要包括：单链构象多态性(Single-Strand Conformational Polymorphism，SSCP)技术、异源双链分析(hereroduplex analysis，HA)技术、变性高效液相色谱法(Denaturing High PerformanceLiquid Chromatography，DHPLC)、变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)、化学错配裂解法(chemical mismatch cleavage，CMC)、焦磷酸序列(Pyrosequencing)分析技术、质谱法(mass spectrometry)、DNA芯片(DNA chip)技术、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、等位基因特异性PCR(allele specific PCR，ASPCR)、分子信标(molecular beacons)技术等等。这些传统的检测方法大多操作复杂、费时繁琐且特异性、灵敏性及准确性有待提高。

当前，绝大部分的新发突发传染病由病毒引起。病毒检测有多种方法，包括病毒培养、电子显微镜观察、病毒抗原抗体检测。虽然病毒培养是检测的金标准，但是过程复杂，耗时数天。电子显微镜通过观察病毒的形态来进行科属判定，但是对技术人员要求高，且价格昂贵。病毒抗原抗体检测是检测病毒感染后产生的蛋白来鉴定病原体，还需要根据病人临床症状来判定。核酸检测是一种新型的检测方法，它通过PCR等手段检测病毒感染过程中所产生的核酸，不仅检测时间较早，且耗时较短。目前，实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)是较为常用的一种检测方法，分为染料法和探针法。核酸检测是当前最常用的病毒检测方法。然而，上述检测方法均需要在实验室开展，不能实现现场检测。

因此，本领域迫切需要开发简便、快速、灵敏、准确地检测高变异的病毒等病原体的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供简便、快速、灵敏、准确地检测高变异的病毒等病原体的环介导的恒温扩增(LAMP)方法。

在本发明的第一方面，提供一种错配耐受的环介导恒温扩增方法，其特征在于，所述方法包括：以待测核酸样品为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；其中DNA聚合酶应用高保真DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶的混合酶。

在一个优选例中，所述方法包括以下步骤：在一扩增体系中，以待测核酸样品为模板，以M种引物对进行扩增，当引物与模板存在错配时(特别是引物3’端)，高保真DNA聚合酶识别并切除引物3’端错配碱基；其中，M为≥1的正整数。

在另一优选例中，所述的M种引物对包括位点特异性引物对；包括：

第一引物对FIP和BIP：为内引物，用于构建LAMP反应的环结构；

第二引物对F3和B3：为外引物，用于置换内引物进而促进成环；

第三引物对FL和BL：为环引物，用于加速LAMP反应。

在另一优选例中，M为1～50的正整数，如为2、3、4、5、8、10、15、20、30、40。

在另一优选例中，所述的M种引物对中≥80％，≥90％或100％是位点特异性引物对。

在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，其选自下组：Q5DNA聚合酶、KOD plus neo DNA聚合酶、Supertaq DNA聚合酶、HiFiTaq DNA聚合酶、Blend Taq DNA聚合酶、Promstar HS DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KODFX DNA聚合酶或其组合。

在另一优选例中，所述的链置换DNA聚合酶是不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，其选自下组：大片段Bst DNA聚合酶、全长Bst DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶的量为0.002～0.026U每微升反应体积；较佳的为0.004～0.018U每微升反应体积；更佳的为0.006～0.016U每微升反应体积。

在另一优选例中，所述的链置换DNA聚合酶的量为0.08～0.48U每微升反应体积；较佳的为0.16～0.4U每微升反应体积；更佳的为0.24～0.32U每微升反应体积。

在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶与链置换DNA聚合酶的比例按照酶活性单位比例为1:10～1:160；较佳地1:15～1:80；更佳地1:20～1:60。

在另一优选例中，所述环介导等温扩增的反应温度为50～70℃；较佳的为58～68℃；更佳的为62～65℃。

在另一优选例中，所述环介导等温扩增的反应时间为10～120分钟；较佳的为30～90分钟；更佳的为45～60分钟。

在另一优选例中，所述环介导等温扩增的仪器包括选自下组的仪器：温控水浴锅，金属浴锅，PCR仪，荧光定量PCR仪，荧光恒温扩增仪。

在另一优选例中，通过荧光法、比色法或浊度法进行扩增产物的分析和检测；较佳地，加入双链DNA结合荧光染料或者酸碱及离子显色染料，从而实现结果的荧光实时检测，或紫外光下的荧光显色或常见光下的比色反应(颜色变化)。

在另一优选例中，所述的双链DNA结合荧光染料指游离染料不发生荧光信号，当结合到双链DNA中后，可以激发产生荧光信号的染料。

在另一优选例中，所述的酸碱显色染料指在酸碱pH发生改变的时候，染料颜色发生相应的改变，比如从酸性到中性到碱性，或者从碱性到中性到酸性，染料颜色发生改变。

在另一优选例中，所述双链DNA结合染料包括选自下组的染料：SYBR Green I，SYTO 9。

在另一优选例中，所述酸碱指示染料包括选自下组的染料：钙黄绿素，羟基萘酚蓝(HNB)，中性红，甲酚红，甲酚紫，苯酚红。

在另一优选例中，所述的待测样品是含有病原体核酸的样品，较佳地是含有高变异性病原体核酸的样品，所述的高变异性病原体如病毒。

在另一优选例中，所述的病原体为一种或多种病原体，所述多种病原体为1-100种，如10、20、30、50种。

在另一优选例中，所述的病原体包括同一种类病毒的不同病毒亚型或株。

在另一优选例中，所述的待测核酸样品包括但不限于来自：植物、动物、细胞或细胞培养物、组织、体液、食品、饲料、土壤、淡水、海水、地下水。

在另一优选例中，所述的对待测核酸样品进行序列检测的方法是非疾病诊断性的检测方法。

在另一优选例中，所述的环介导等温扩增的体系中包括：所述的特异性扩增引物、Mg²⁺、dNTPs、Tris-HCl、NH₄ ⁺、K⁺、Triton X-20。

在本发明的另一方面，提供一种用于错配耐受的环介导恒温扩增的检测试剂盒，所述试剂盒中包括：

用于进行环介导等温扩增的特异性扩增引物；较佳地，所述引物包括：

第一引物对FIP和BIP：为内引物，用于构建LAMP反应的环结构；

第二引物对F3和B3：为外引物，用于置换内引物进而促进成环；

第三引物对FL和BL：为环引物，用于加速LAMP反应；和

高保真DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶，且所述的高保真DNA聚合酶与链置换DNA聚合酶的比例是1:10～1:160；较佳地1:15～1:80；更佳地1:20～1:60。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：检测标准品；Mg²⁺溶液、dNTPs、Tris-HCl、NH₄ ⁺溶液、K⁺溶液、Triton X-20、荧光染料，或它们的混合液；和/或说明检测方法的使用说明书。

在本发明的另一方面，提供所述的检测试剂盒的用途，用于对待测核酸样品进行序列检测；较佳地，所述待测核酸样品为高变异性病原体，如病毒。在一些实施方式中，所述的用途是非疾病诊断性的检测用途。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了本发明的LAMP方法的检测原理的示意图。

图2a～b显示了恒温实时扩增方法检测基孔肯雅突变体时的效果。

图3显示了恒温实时扩增方法检测登革四种亚型毒株的结果。其中，1～4：本发明的LAMP方法下的登革1～4型毒株；5～8：传统LAMP方法下的登革1～4型毒株。

图4显示了恒温实时扩增方法检测登革病毒时的特异性结果。1：登革1型毒株；2、3、4、5、6分别为鼻病毒、博卡病毒、寨卡病毒、黄热病毒的核酸和水。

图5显示了恒温实时扩增方法检测登革病毒时的灵敏性结果。

图6显示了比色恒温扩增方法检测登革病毒四种亚型的结果。

图7显示了不同高保真酶检测登革病毒突变体的结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示一种新型的利用环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)检测病原体的方法，对于扩增反应的反应体系进行了优化，特别是DNA聚合酶的选用方面。本发明的方法可良好地应用于基于LAMP的检测，与传统方法相比，本发明方法特异性好、灵敏度高、重复性好、操作简单、方便快捷，可广泛用于传染病病原快速及床边检测等相关领域。

具体地，本发明人利用高保守性的LAMP引物和高保真DNA聚合酶的3’→5’外切酶校正功能以及特定的优化的条件，开发了一种操作简单快捷、灵敏性强、准确度高的检测方法。实验表明，本发明的方法可广泛用于诊断和非诊断性的病毒检测，并且该方法也可推广应用于检测各种不同的病原体，如细菌、病毒等，尤其是高变异性的病原体微生物。

如本文所用，所述的“待测样品”是易于或潜在发生病原体的寄生、附着或繁殖的样品；可以包括(但不限于)：细胞或细胞培养物、植物、动物(包括家畜)、组织、体液、食品、饲料、土壤、淡水、海水、地下水等。所述的“待测核酸样品”是来自于“待测样品”的核酸提取产物。

如本文所用，所述的“高保真DNA聚合酶”是具有3’→5’外切酶校读活性的DNA聚合酶。其包括但不限于：Q5DNA聚合酶、KOD plus neo DNA聚合酶、Supertaq DNA聚合酶、HiFiTaq DNA聚合酶、Blend Taq DNA聚合酶、Promstar HS DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KODFX DNA聚合酶或其组合。

如本文所用，所述的“链置换DNA聚合酶”为具有链置换功能的DNA聚合酶，不具有5’→3’的核酸外切酶活性。链置换DNA聚合酶在延伸新链的同时将下游旧链剥离。其包括但不限于：大片段Bst DNA聚合酶、全长Bst DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶、Bst 2.0 DNA聚合酶、或其组合。

本发明所基于的一个主要原理(参考图1)如下：同时利用具有链置换功能的DNA聚合酶和3’→5’外切酶校正功能的高保真DNA聚合酶，在链置换DNA聚合酶作用下驱动引物延伸，形成DNA产物；当引物3’端与模板存在错配的情况下，高保真DNA聚合酶切除引物3’端错配碱基，使链置换DNA聚合酶继续催化DNA合成；同时，由于LAMP的高特异性，只有在FIP中的F1c部分与模板互补的情况下，才能形成LAMP反应中的“双哑铃结构”，只有形成了“双哑铃结构”，扩增方能继续。所以，该方法在提高了检测灵敏度的同时，也保证了检测的特异性。

恒温扩增技术是一种实现现场核酸及时检测的最优解决方案之一。目前，有多种恒温扩增技术。LAMP是近年来发展的一种等温核酸扩增技术，仅需要简单的水浴锅或者加热器等设备，在恒温扩增环境条件下高效率地扩增目标DNA，对操作者分子生物学技术要求也不高。与PCR方法相比，LAMP不需要热循环仪(PCR仪)。由于LAMP反应扩增产物可通过肉眼观察或浊度计即可判定结果；因此LAMP也适合于现场检测或条件相对简陋的实验进行快速检测。而其缺点却是对于复杂体系的检测往往易于造成假阴性，特别是对于高变异性的病原体的检测，例如病毒，其区别于其他病原体(如细菌，真菌，支原体，衣原体等)的最大特点在于病毒的高变异性，经常导致核酸检测的失效或低效；并且，因病毒和细菌等微生物种类多，变异快，故易发生检测错误(如假阴性)。为了检测多种类的病毒或同一种类病毒的不同病毒亚型或株，常常需要分别进行测试，这就增加了检测难度，而且费时费力。

针对上述问题，本发明人在反复研究后发现，在LAMP反应体系中，将高保真DNA聚合酶与链置换DNA聚合酶以适当比例混合使用，大大提高检测的灵敏度及准确性。适量高保真DNA聚合酶的加入，使得当引物与模板出现错配时，其对LAMP引物进行3’→5’校对、修正引物、继续扩增；当引物与模板完全匹配时，反应也会正常进行。与人们的常规思路的不同的是，高保真DNA聚合酶的这种3’→5’校对活性并不会干扰LAMP反应。本发明的方法大大优化了扩增效果，显著提高了反应的特异性和灵敏度。

为了实现更为良好的技术效果，本发明人优化了高保真DNA聚合酶的添加量，其应用量相对高时会增加非特异性扩增的风险，而过低时则不能将错配有效地切除，影响扩增效率；因此经过反复比较后，本发明人选择所述的高保真DNA聚合酶与链置换DNA聚合酶的比例按照酶活性单位比例为1:10～1:160；较佳地1:15～1:80；更佳地1:20～1:60。

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。

可通过荧光法、比色法或浊度法等方法进行扩增产物的分析和检测；较佳地，加入双链DNA结合荧光染料或者酸碱及离子显色染料，从而实现结果的荧光实时检测，或紫外光下的荧光显色或常见光下的比色反应(颜色变化)。所述的双链DNA结合荧光染料指游离染料不发生荧光信号，当结合到双链DNA中后，可以激发产生荧光信号的染料。所述的酸碱显色染料指在酸碱pH发生改变的时候，染料颜色发生相应的改变，比如从酸性到中性到碱性，或者从碱性到中性到酸性，染料颜色发生改变。

在本发明的具体实施例中，提供了一种基于LAMP技术进行病毒检测的方法，包括步骤：

步骤1，根据野生型基因序列设计LAMP引物；

步骤2，用所述LAMP引物对待测样品进行等温扩增反应；

步骤3，通过实时荧光扩增曲线的阈循环数比较或电泳检测扩增产物，或进行显色观测。

本发明还涉及一种用于对待测核酸样品进行序列检测的试剂盒，所述试剂盒中含有用于进行LAMP反应的特异性扩增引物；以及高保真DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶，且所述的高保真DNA聚合酶与链置换DNA聚合酶的比例是1:10～1:160；较佳地1:15～1:80；更佳地1:20～1:60。

所述试剂盒中还可含有其它检测试剂，包括但不限于：检测标准品；Mg²⁺溶液、dNTPs、Tris-HCl、NH₄ ⁺溶液、K⁺溶液、Triton X-20、荧光染料，或它们的混合液。

此外，所述试剂盒中还可含有说明检测方法的使用说明书和/或标准操作程序，从而便于本领域技术人员进行操作。

本发明的主要优点在于：

本发明建立的LAMP快速检测方法及试剂盒具有特异性和稳定性，检测时间短，且费用成本低廉，操作简便，快速准确，而且所需的样品量很少，适用于各种实验条件的实验室或医院的检测。相较于传统的LAMP方法，本发明的优化的方法具有更高的检出率和更短的检测时间。

同时，本发明的技术方案解决了病毒高变异区域难以设计合适引物的问题，对于流行病的检测(特别是禽流感，HIV等)有非常大的便利性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、LAMP方法步骤

1、LAMP方法

LAMP反应缓冲液：在25μL体系中，包括1.5μL 100mM MgSO₄，3.5μL10mM dNTPs，2.5μL 10×Thermolpol RB。其中，10×Thermolpol RB获自NEB公司，为Bst 2.0DNA聚合酶缓冲液，由200mM Tris-HCl，100mM(NH4)₂SO₄，500mM KCl，20mM MgSO₄，1％Triton X-20组成，pH8.8(25℃)。

反应用酶：每次反应加入1μL 8U/μL的Bst 2.0聚合酶，0.5μL 15U/μL的热启动反转录酶(WarmStart RTx Reverse Transcriptase)，高保真DNA聚合酶。其中，高保真DNA聚合酶的加入种类以及加入量如表1所示。

反应引物加入量为：内引物1.6μM，外引物0.2μM，环引物0.8μM，模板为3μL，最终体系25μL。

表1

LAMP检测步骤为：

63℃，60s，1次循环；

63℃，60s，40次循环；

恒温实时扩增时：染料为SYTO 9，采集荧光的通道设定为SYBR Green I通道。循环反应后，采集荧光。

比色恒温扩增时：加入120μM的HNB指示剂。

2、传统LAMP方法

该传统的LAMP与本发明的LAMP方法相比较，区别在于反应体系中不加入高保真酶。传统LAMP检测步骤同前述。

实施例2、用本发明的恒温实时扩增方法检测基孔肯雅突变质粒

通过对基孔肯雅病毒(CHIKV)的野生型质粒(购自金唯智中国)进行突变，构建突变体CHIKV-Mu 1和CHIKV-Mu 2，分别将一个A碱基(第3097位)突变为T碱基和两个AA碱基(第3096～3097位)突变为TT碱基，如图2a所示。

LAMP引物为：

FIP：TATCGATGCGTGCTCCACCTCGCTGCAGAACCCACCGAA(SEQ ID NO:1)

BIP：CGGGCATCTGCAGTCACCAAAGCTCTTAGCCCAGCAAACG(SEQ ID NO:2)

F3：ACTCTCTGGTGACCCGTG(SEQ ID NO:3)

B3：GCTGTTTCGAGGATAGGGAC(SEQ ID NO:4)

FL：CCACTCCTTAATAGTTGCCTTGAAG(SEQ ID NO:5)

BL：TGACACGTTCCAAAACAAAGCCA(SEQ ID NO:6)

用本发明的LAMP方法(25μL体系中含有0.15U的Q5DNA聚合酶)和传统LAMP方法分别对野生型基孔肯雅质粒CHIKV-WT、突变体CHIKV-Mu1和突变体CHIKV-Mu 2在两个独立的体系中进行检测，模板浓度均为30000拷贝/反应。

扩增结果如图2b和表2所示。

表2

结果表明，本发明的方法对突变有更好的耐受，可以有效解决病毒突变造成的假阴性问题。

实施例3、用本发明的恒温实时扩增方法检测登革病毒四种毒株

选取四种登革病毒毒株DENV-1(16007)，DENV-2(16681)，DENV-3(16562)和DENV-4(1036)，每种毒株各取140ul细胞培养液进行核酸抽提。以抽提的毒株核酸10倍稀释液为RNA模板。

设计引物为：

FIP/123：AGGGGTCTCCTCTAACCRCTAGTCTTTCAAACCRTGGAAGC TGTACGC(SEQ ID NO:7)

FIP/4：AGGGGTCTCCTCTAACCRCTAGTCTTTTTTGCCACGGAAGCT GTACGC(SEQ ID NO:8)

BIP/123：ACAGCATATTGACGCTGGGARAGACGTTCTGTGCCTGGAA TGATGCTG(SEQ ID NO:9)

BIP4:ACAGCATATTGACGCTGGGARAGACGCTCTGTGCCTGGATTG ATGTTG(SEQ ID NO:10)

F3/134：CAAACCGTGCTGCCTGT(SEQ ID NO:11)

F3/2：TGAGTAAACTATGCAGCCTGT(SEQ ID NO:12)

B3/123：ACCTGTTGATTCAACAGCACC(SEQ ID NO:13)

B3/4：ACCTGTTGGATCAACAACACC(SEQ ID NO:14)

BL：CAGAGATCCTGCTGTCTC(SEQ ID NO:15)

本发明的方法中加入了高保真酶(25μL体系中含有0.15U的Q5DNA聚合酶)，与之相对的传统LAMP中没有添加高保真酶，比较两种方法下LAMP的扩增效果。

LAMP扩增曲线如图3所示。结果表明，加了高保真酶，提高了反应体系对突变的耐受程度，极大地促进了反应进行。相对于传统LAMP，在本发明的方法下，登革病毒的不同毒株都表现出了更佳的扩增效果。

实施例4、本发明的恒温实时扩增方法的特异性验证

选取登革病毒1型核酸10倍稀释液为阳性对照，鼻病毒、博卡病毒、寨卡病毒、黄热病毒的核酸和水为阴性对照。

引物同实施例3中的引物。

结果如图4所示，用本发明的方法检测(25μL体系中含有0.15U的Q5DNA聚合酶)登革病毒1型时，检测到了荧光信号，其余阴性对照都没有检测到荧光信号。

实施例5、本发明的恒温实时扩增方法的灵敏度测试

使用无RNase的H₂O分别对登革病毒进行梯度稀释。检测反应步骤如下：

63℃，60s，1次循环；

63℃，60s，40次循环，采集荧光；

采集荧光的通道设定为SYBR Green I，使用SYTO 9染料。

分别用本发明的方法(25μL体系中含有0.15U的Q5DNA聚合酶)以及传统的LAMP方法对毒株进行检测。

灵敏度结果如图5所示，出现的“对数曲线”表示不同亚型的登革病毒在该浓度下有扩增。表明本方法LAMP体系针对登革病毒1型最低可检测到3.36PFU/反应；登革病毒2型最低可检测到84PFU/反应；登革病毒3型最低可检测到0.168PFU/反应；登革病毒4型最低可检测到1.344PFU/反应。

实施例6、比色恒温扩增方法检测登革病毒四种毒株

四种病毒同实施例3，反应体系如实施例1(25μL体系中含有0.15U的Q5DNA聚合酶)，但是不采用恒温实时扩增方法，而是采用比色恒温扩增方法；不添加染料SYTO 9，而是在反应前，在体系中加入120μM的HNB指示剂。63℃反应40分钟后，观察颜色变化。如果反应体系颜色由紫色变成了蔚蓝色，则判定反应体系中含有登革病毒。

另一反应体系使用甲酚红作为指示剂，在反应前，向体系中加入50μM甲酚红指示剂。63℃反应40分钟后，如果反应体系由粉红变为黄色，则判定反应体系中含有登革病毒。

反应结果如图6所示，登革1～4型毒株都可以在两种体系下扩增，进而发生比色反应。本发明的方法能够在更低的待测样品浓度下实现灵敏的测定，准确性和灵敏度非常理想。

实施例7、高保真DNA聚合酶与链置换酶的不同比例对DENV-4突变株进行检测

DENV-4突变株：第10524位C突变为A碱基。

根据前述表1，不同浓度的Q5DNA聚合酶与链置换DNA聚合酶(Bst 2.0DNA聚合酶)的比例分别如表3。

表3

结果可见，在高保真酶:链置换酶比例为1:10～1:160时，扩增效率较为理想，尤其是在1:20～1:60时，也即在25μL的体系中酶单位为0.1～0.4U时。

实施例8、不同高保真DNA聚合酶对DENV-4突变株进行检测

通过向RT-LAMP体系中加入不同品牌的高保真酶(Supertaq、Q5、KOD plus neo、Pfu、HiFiTaq)，检测DENV-4突变株(第10524位C突变为A碱基)。反应体系基本同前，不同处仅在于高保真酶的种类变化，几种高保真酶的用量均为0.15U。

反应结果如图7所示，表明不同的高保真酶也都可以提高RT-LAMP对突变体的扩增能力，与不添加高保真酶组相比具有显著性的促进扩增效率的作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海巴斯德研究所

<120> 错配耐受的环介导等温扩增方法及应用

<130> 190296

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 1

tatcgatgcg tgctccacct cgctgcagaa cccaccgaa 39

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

cgggcatctg cagtcaccaa agctcttagc ccagcaaacg 40

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

actctctggt gacccgtg 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

gctgtttcga ggatagggac 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

ccactcctta atagttgcct tgaag 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

tgacacgttc caaaacaaag cca 23

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

aggggtctcc tctaaccrct agtctttcaa accrtggaag ctgtacgc 48

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

aggggtctcc tctaaccrct agtctttttt gccacggaag ctgtacgc 48

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

acagcatatt gacgctggga ragacgttct gtgcctggaa tgatgctg 48

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

acagcatatt gacgctggga ragacgctct gtgcctggat tgatgttg 48

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

caaaccgtgc tgcctgt 17

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

tgagtaaact atgcagcctg t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

acctgttgat tcaacagcac c 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

acctgttgga tcaacaacac c 21

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

cagagatcct gctgtctc 18

Claims (16)

1.一种错配耐受的环介导恒温扩增方法，其特征在于，所述方法包括：以待测核酸样品为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；其中DNA聚合酶应用高保真DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶的混合酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在一扩增体系中，以待测核酸样品为模板，以M种引物对进行扩增，当引物与模板存在错配时，高保真DNA聚合酶识别并切除引物3’端错配碱基；其中，M为≥1的正整数；

所述的M种引物对包括位点特异性引物对；包括：

第一引物对FIP和BIP：为内引物，用于构建LAMP反应的环结构；

第二引物对F3和B3：为外引物，用于置换内引物进而促进成环；

第三引物对FL和BL：为环引物，用于加速LAMP反应。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，所述的高保真DNA聚合酶选自下组：Q5DNA聚合酶、SupertaqDNA聚合酶、HiFiTaq DNA聚合酶、KOD plus neo DNA聚合酶、Blend Taq DNA聚合酶、Promstar HS DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD FX DNA聚合酶或其组合。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的链置换DNA聚合酶是不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，所述的链置换DNA聚合酶选自下组：大片段Bst DNA聚合酶、全长Bst DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、或其组合。

5.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶的量为0.002～0.026U每微升反应体积；较佳的为0.004～0.018U每微升反应体积；更佳的为0.006～0.016U每微升反应体积。

6.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述的链置换DNA聚合酶的量为0.08～0.48U每微升反应体积；较佳的为0.16～0.4U每微升反应体积；更佳的为0.24～0.32U每微升反应体积。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶与链置换DNA聚合酶的比例按照酶活性单位比例为1:10～1:160；较佳地1:15～1:80；更佳地1:20～1:60。

8.如权利要求1或2所述的方法，所述环介导等温扩增的反应温度为50～70℃；较佳的为58～68℃；更佳的为62～65℃；和/或

所述环介导等温扩增的反应时间为10～120分钟；较佳的为30～90分钟；更佳的为45～60分钟；和/或

所述环介导等温扩增的仪器包括选自下组的仪器：温控水浴锅，金属浴锅，PCR仪，荧光定量PCR仪，荧光恒温扩增仪。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过荧光法、比色法或浊度法进行扩增产物的分析和检测；较佳地，加入双链DNA结合荧光染料或者酸碱及离子显色染料，从而实现结果的荧光实时检测，或紫外光下的荧光显色或常见光下的比色反应。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述双链DNA结合染料包括选自下组的染料：SYBR Green I，SYTO 9；和/或

所述酸碱指示染料包括选自下组的染料：钙黄绿素，羟基萘酚蓝，中性红，甲酚红，甲酚紫，苯酚红。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是含有病原体核酸的样品，较佳地是含有高变异性病原体核酸的样品，所述的高变异性病原体如病毒。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增的体系中包括：所述的特异性扩增引物、Mg²⁺、dNTPs、Tris-HCl、NH₄ ⁺、K⁺、Triton X-20。

13.一种用于错配耐受的环介导恒温扩增的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：用于进行环介导等温扩增的特异性扩增引物；较佳地，所述引物包括：

第一引物对FIP和BIP：为内引物，用于构建LAMP反应的环结构；

第二引物对F3和B3：为外引物，用于置换内引物进而促进成环；

第三引物对FL和BL：为环引物，用于加速LAMP反应；和

高保真DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶，且所述的高保真DNA聚合酶与链置换DNA聚合酶的比例是1:10～1:160；较佳地1:15～1:80；更佳地1:20～1:60。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：

检测标准品；Mg²⁺溶液、dNTPs、Tris-HCl、NH₄ ⁺溶液、K⁺溶液、Triton X-20、荧光染料，或它们的混合液；和/或

说明检测方法的使用说明书。

15.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的链置换DNA聚合酶是不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，其选自下组：大片段Bst DNA聚合酶、全长Bst DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、或其组合；

所述的高保真DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，其选自下组：Q5DNA聚合酶、Supertaq DNA聚合酶、HiFiTaq DNA聚合酶、KOD plus neo DNA聚合酶、BlendTaq DNA聚合酶、Promstar HS DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD FX DNA聚合酶或其组合。

16.权利要求13～15任一所述的检测试剂盒的用途，用于对待测核酸样品进行序列检测；较佳地，所述待测核酸样品为高变异性病原体，如病毒。