CN114480683A - 恒温条件检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法与试剂盒 - Google Patents

恒温条件检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法与试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种于恒温条件下检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法与试剂盒。本发明提供一种引物组合，其包括用于特异性扩增KatG基因和InhA基因的内引物、外引物和环引物，以及分子信标探针。本发明还提供了相应的试剂盒和检测方法。本发明提供的检测方法可以在恒温条件下对待测样本进行结核分枝杆菌异烟肼耐药性的检测，具有检测速度快、灵敏度高、特异性强的优点。

Description

恒温条件检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法与试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种于恒温条件下检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法与试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)呈细长直或稍弯曲状，是引起人类结核感染的病原菌，其单一传染性病原体致死率高于艾滋病毒，是世界十大致死因素之一。据世界卫生组织2020年结核病报告显示，世界人口约有四分之一感染结核分枝杆菌。中国是全球结核病负担占比最高的三个国家之一，在结核病预防、筛查和治疗方面还需不断研究与创新。
异烟肼，又名4-吡啶甲酰肼、异烟酸肼，其对结核分枝杆菌有高度选择性、较强的抑制和杀灭作用，其生物膜穿透性好，由于疗效佳、毒性小、价廉、口服方便，故被列为首选抗结核药。由于异烟肼已有约五十年的使用历史，部分病人所感染的结核菌已经产生了耐药性。根据世卫组织的报告，2019年全球约有50万人患对利福平耐药的结核病，其中有78％的患者对利福平和异烟肼产生耐药。因此，对结核分枝杆菌异烟肼耐药性的检测非常必要。
目前，临床上常用表型药物敏感试验和PCR核酸检测法检测结核分枝杆菌的耐药性。其中，表型药物敏感试验必须使用培养后分离的菌株，一般需要 28～42天才能获得样品相关耐药性结果，操作繁琐且检测成本高，可能导致患者不能及时得到针对性的治疗，还增加了耐药结核病传播风险。而基于核酸检测的PCR荧光曲线技术具有较高的灵敏度和特异性，但存在假阳性率较高的缺点，样本中含有的抑制PCR反应的成分也会导致假阴性的出现。目前市场上用于结核病耐药检测的荧光PCR探针熔解曲线法，能够用于检测碱基插入、缺失、替代导致的基因突变，具有较高的灵敏度和特异性，但具有反应程序耗时长的缺陷。因此，本领域亟需更简洁、更灵敏的快速检测方法用于结核分枝杆菌异烟肼耐药的诊断。
近些年，在PCR基础上发展出了一种环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)，是由日本荣研株式会社的Notomi等人于2000 年开发出来的一种新型核酸扩增方法。它依赖于4条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列。这种链置换型的DNA聚合酶，使模板两端的引物结合处循环出现环状单链结构，保证引物顺利的与模板结合，进行链置换扩增反应。该技术更克服了需要反复热变性的PCR反应的特点，有效避免了升降温的过程当中耗时的缺点，实现了恒温条件下的连续快速扩增。
目前，本领域仍缺少有效的、同时针对多靶点的、利用环介导等温扩增技术来检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种于恒温条件下检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法与试剂盒，通过本发明提供的方法，在恒温条件下即可实现检测，无需变温扩增过程，而且具有检测速度快、灵敏度高、特异性强的优点。
相关研究表明，结核分枝杆菌耐异烟肼耐药与基因katG、inhA，ahpC的突变有关，其中，有54.9％的突变发生在katG基因第315位密码子上；有9.4％的突变发生在inhA启动子-17～-8区域及其1.2％的突变发生在inhA基因第94 位密码子，而inhA以启动子-15T突变最为常见；另外，有7.9％的突变发生在 ahpC基因启动子-46～4区域。但是，有研究表明，ahpC基因突变通常作为突变补偿伴随着katG基因第315位密码子突变出现。
根据本发明提供的检测方法，通过检测katG和inhA基因相关区域突变情况，从而得出异烟肼耐药性的信息。
为此，第一方面，本发明提供了一种用于检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的引物组合，所述引物组合包括引物组I和引物组II；
所述引物组I包括外引物KatG-F3、外引物KatG-B3、内引物KatG-FIP、内引物KatG-BIP、环引物KatG-LB；
所述外引物KatG-F3的核苷酸序列为ACGACGTCGAAACAGCGG(SEQ ID NO：1)，
所述外引物KatG-B3的核苷酸序列为CCCACTCGTAGCCGTACAGG(SEQ ID NO：2)，
所述内引物KatG-FIP的核苷酸序列为 AGCGGAGCAGCCTCGGGTTCGCACACTTTCGGTAAGACCCA(SEQ ID NO： 3)，
所述内引物KatG-BIP的核苷酸序列为 GCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGCTGTTGTCCCATTTCGTCG(SEQ ID NO：4)，
所述环引物KatG-LB的核苷酸序列为ATCACCAGCGGCATCGAGGTCG (SEQ ID NO：5)；
所述引物组II包括外引物InhA-F3、外引物InhA-B3、内引物InhA-FIP、内引物InhA-BIP、环引物InhA-LB；
所述外引物InhA-F3的核苷酸序列为TCGTAGGGCGTCAATACACC(SEQ ID NO：6)，
所述外引物InhA-B3的核苷酸序列为CTCCGGTAACCAGGACTGAA(SEQ ID NO：7)，
所述内引物InhA-FIP的核苷酸序列为 CTGGGGTTACGCTCGTGACGCCAGAAAGGGATCCGTCA(SEQ ID NO：8)，
所述内引物InhA-BIP的核苷酸序列为 ACTGAAGGGGCCAAACCCGGGTTTGGCCCCTTCAGT(SEQ ID NO：9)，
所述环引物InhA-LB的核苷酸序列为 GAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACT(SEQ ID NO：10)。
进一步，所述引物组合还包括分子信标探针katG-M和分子信标探针 inhA-M；
所述分子信标探针katG-M的核苷酸序列为 CGAGCCGACCTGGATGCCGCTGATGGCTCG(SEQ ID NO：11)，
所述分子信标探针inhA-M的核苷酸序列为 CAGCCAGTCACCGCCACAACCTATCGTCTCGCCGGCTG(SEQ ID NO：12)。
根据本发明提供的分子信标(Molecular beacon probe)探针，其具有灵敏度高、特异性强和只有与靶序列杂交才会发出荧光的优点，可用于异烟肼耐药突变样本的准确检测。本发明以katG和inhA基因作为检测靶点，并分别对这两个基因突变区域各设计合成一条分子信标探针，在恒温条件下进行PCR反应，利用探针熔解曲线法实现对突变基因的筛查，从而实现对结核分枝杆菌异烟肼耐药性的快速准确检测。
进一步，所述分子信标探针katG-M和所述分子信标探针inhA-M各自独立地含有选自下组的修饰：
所述分子信标探针的5’端修饰有荧光基团，选自FAM、HEX、ROX、 TAMRA、TexasRED、CY5、Cy3、TET、JOE、VIC中的一种或多种；所述分子信标探针的3’端修饰有淬灭基团，选自BHQ1、BHQ2、Dabcy1、TAMRA、 MGB、ECLIPSE中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述分子信标探针katG-M的5’端修饰有FAM，3’端修饰有BHQ1；所述分子信标探针inhA-M的5’端修饰有Texas RED，3’端修饰有BHQ2。
本发明的第二方面，提供所述引物组合在检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性中的应用，包括以待测样本的DNA为模板，利用所述引物组合进行等温扩增和熔解曲线检测。
本发明的第三方面，提供所述引物组合在制备检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的试剂中的应用。
本发明的第四方面，提供一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的试剂盒，包括本发明所述的引物组合。
进一步，所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶和含dNTPs的反应液。
所述Bst DNA聚合酶的工作浓度为6-9U/μL。
进一步，所述含dNTPs的反应液包括dNTPs、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、 MgSO4、Triton X-100。
进一步，所述dNTPs的浓度为3-5mM。
进一步，所述(NH4)2SO4的浓度为30-40mM，所述MgSO4的浓度为20-30 mM，所述KCl的浓度为30-40mM，所述Triton X-100的浓度为0.2％-0.5％，所述Tris-HCl的浓度为60-70mM；所述Tris-HCl的pH为8-8.8。
在一些实施方式中，所述含dNTPs的反应液通过将10mM dNTPs、10× ThermoPol反应缓冲液和100mM MgSO4水溶液按照体积比为7:5:3混合均匀配制得到。
进一步，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。
在一些实施方式中，所述阳性质控品含有野生型katG基因和野生型inhA 基因的核酸序列；例如，所述阳性质控品为野生型结核分枝杆菌，或者为含有野生型katG基因和野生型inhA基因的核酸序列的T载体克隆；所述阴性质控品为去离子水。
本发明的第五方面，提供一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法，包括以下步骤：
(1)从待测样本中提取DNA；
(2)以步骤(1)提取得到的DNA作为模板，利用本发明所述的引物组合进行等温扩增和熔解曲线检测。
所述检测方法用于非疾病诊断或治疗目的。
进一步，所述等温扩增的反应条件包括：于63℃反应40-50min。例如，当采用PCR仪进行等温扩增时，可采用以下条件：63℃反应30s；63℃反应15 s，63℃反应45s，45个循环。
进一步，所述熔解曲线检测的反应条件包括：95℃，1min，40℃，2min，升温过程40℃～85℃，升温速率0.1℃/s，进行荧光信号采集。
在一些实施方式中，可采用实时荧光定量PCR仪器进行所述等温扩增和熔解曲线检测。
根据本发明所述的检测方法，可通过对比待测样本和阳性质控品的熔解曲线，快速判断待测样本是否含有具有异烟肼耐药性的结核分枝杆菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明提供的探针组合中，引物对FIP/BIP和F3/B3，用以识别目标 DNA的不同区域，并引入环状引物LB加快反应速度，使用具有链置换功能的 DNA聚合酶启动合成；两条引物形成的茎环结构促进后续的循环扩增，这样循环往复，在DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，实现目标序列的大量扩增。
(2)本发明提供的探针组合中，两条分子信标探针基本覆盖了与异烟肼耐药性相关基因的突变位点，在同一个反应管中即能实现对异烟肼耐药性突变的检测。
(3)本发明提供的检测方法只需在恒温条件下即可实现检测，而现有技术中耐药性检测往往需要变温扩增的步骤。
(4)本发明提供的检测方法具有操作简便、检测时间短、特异性高、灵敏度高等优点，具有良好的应用前景。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1为根据本发明的检测方法FAM通道熔解曲线结果图；
其中，曲线1表示katG第315位密码子AGC突变为ACC的结核分枝杆菌，曲线2表示katG第315位密码子AGC突变为AAC的结核分枝杆菌，曲线3 表示野生型结核分枝杆菌，曲线4为阴性对照结果；
图2为根据本发明的检测方法Texas RED通道熔解曲线结果图；
其中，曲线1表示inhA启动子-15G位点突变为-15T的结核分枝杆菌，曲线2表示inhA启动子-8T位点突变为-8A的结核分枝杆菌，曲线3表示野生型结核分枝杆菌，曲线4为阴性对照结果；
图3为灵敏度实验的检测结果(FAM通道)；
其中，曲线1、2、3、4、5依次分别表示浓度为105CFU/mL、104CFU/mL、 103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL异烟肼耐药结核分枝杆菌的熔解曲线，曲线6为阴性对照结果；
图4为特异性实验的检测结果(FAM通道)；
其中，曲线1为异烟肼耐药结核分枝杆菌的熔解曲线，曲线2为阳性对照的结果，曲线3为其他非结核分枝杆菌的熔解曲线。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本文的实施例采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。本文的实施例所用到的试剂可通过常规商购途径获得。
实施例1提供引物、探针
本实施例提供用于检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的引物组合，包括引物组I、引物组II、分子信标探针katG-M和分子信标探针inhA-M。
引物组I用于特异性扩增katG基因核酸序列上的片段(扩增子长度为约 300bp)，包括外引物KatG-F3、外引物KatG-B3、内引物KatG-FIP、内引物 KatG-BIP、环引物KatG-LB；
引物组II用于特异性扩增inhA基因核酸序列上的片段(扩增子长度为约 300bp)，包括外引物InhA-F3、外引物InhA-B3、内引物InhA-FIP、内引物 InhA-BIP、环引物InhA-LB；
分子信标探针katG-M的5’端修饰有FAM，3’端修饰有BHQ1；所述分子信标探针inhA-M的5’端修饰有Texas RED，3’端修饰有BHQ2。这两条分子信标探针，基本覆盖了异烟肼耐药相关基因的突变位点。
上述引物、探针的序列见表1所示。
表1引物和探针序列
Figure BDA0003484277420000071
实施例2试剂盒
本实施例提供一试剂盒，其包括实施例1所述的引物组合、阴性质控品、阳性质控品、Bst DNA聚合酶和反应液。
所述阳性质控品为含有katG基因和inhA基因DNA片段的T载体克隆；所述阴性质控品为去离子水。反应液通过将10mM dNTPs、10×ThermoPol反应缓冲液和100mM MgSO4水溶液按照体积比为7:5:3混合均匀配制得到。
实施例3结核分枝杆菌异烟肼耐药性的检测
本实施例提供一种方法，用于检测待测样本中结核分枝杆菌是否具有异烟肼耐药性，包括以下步骤：
(1)取疑似含有结核分枝杆菌的痰液样品，通过热裂解法提取痰液样品中的DNA，将提取得到的DNA用作后续步骤中的待测模板；
(2)配制如下反应体系：外引物KatG-F3、外引物KatG-B3、外引物InhA-F3、外引物InhA-B3各1.0μmol/L，内引物KatG-FIP、内引物KatG-BIP、内引物 InhA-FIP、内引物InhA-BIP各2.0μmol/L，环引物KatG-LB、环引物InhA-LB 各2.0μmol/L，分子信标探针katG-M、分子信标探针inhA-M各0.5μmol/L，用实施例2所述的反应液配至22μL；Bst DNA聚合酶1μL(8U)，待测模板2μL。
同时，采用阳性质控品设置阳性对照，采用阴性质控品设置阴性对照。
(3)采用实时荧光定量PCR仪，对步骤(2)制备得到的反应体系进行 PCR扩增和熔解曲线检测，PCR扩增程序为：63℃反应30s；63℃反应15s， 63℃反应45s，45个循环；熔解曲线检测程序为：95℃，1min，40℃，2min，升温过程40℃～85℃，升温速率0.1℃/s，进行FAM和Texas RED两通道采集荧光。
(4)结果判读：根据熔解曲线检测结果，当待测样品无特异性信号时，判断待测样品中不含有结核分枝杆菌；当FAM和Texas RED两通道中，待测样品的Tm值与阳性对照的Tm值一致(误差不超过1℃)时，判断待测样本为野生型；当FAM和Texas RED任一通道中，待测样品的Tm值低于阳性对照的 Tm值2℃及以上时，判断待测样本含有对异烟肼耐药的结核分枝杆菌。
参考值：
根据本实施例的检测方法，提供如下参考值：反应体系中FAM通道阳性对照峰Tm值为73℃±1℃，Texas RED通道阳性对照峰Tm值为78℃±1℃。(± 1℃为考虑到因仪器差异可能造成的误差值)
检测结果：
按照本实施例提供的方法对katG基因第315位密码子由AGC突变为ACC 的结核分枝杆菌、katG基因第315位密码子由AGC突变为AAC的结核分枝杆菌进行检测，其结果如图1所示。图1为FAM通道的检测结果，其中，曲线1、 2、3依次分别为katG第315位密码子AGC突变为ACC的结核分枝杆菌、katG 第315位密码子AGC突变为AAC的结核分枝杆菌、野生型结核分枝杆菌的熔解曲线；曲线4为阴性对照结果。
依照本实施例提供的方法对inhA基因启动子-15G位点突变为-15T的结核分枝杆菌、inhA基因启动子-8T位点突变为-8A的结核分枝杆菌进行检测，其结果如图2所示。图2为Texas RED通道的检测结果，其中，曲线1、2、3依次分别为inhA启动子-15G位点突变为-15T的结核分枝杆菌、inhA启动子-8T 位点突变为-8A的结核分枝杆菌、野生型结核分枝杆菌的熔解曲线；曲线4为阴性对照结果。
实施例4灵敏度实验
取具有异烟肼耐药性的结核分枝杆菌菌液，通过10倍浓度梯度稀释法，用生理盐水将初始浓度为105CFU/mL的菌液稀释至104，103，102，101CFU/mL，作为待测样本；并设置阳性对照(含有katG和inhA基因耐药决定区域片段的载体)及阴性对照(去离子水)，按照实施例3中的反应体系构建的检测方法进行检测，以确定该体系的灵敏度。
检测结果如图3所示，图3为FAM通道的结果，其中曲线1、2、3、4、5 依次分别表示浓度为105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、 101CFU/mL异烟肼耐药结核分枝杆菌的熔解曲线，曲线6表示阴性对照结果。根据检测结果，当待测样本中结核分枝杆菌的浓度为102CFU/mL时，仍能够获得正确的检测结果，说明本发明提供的检测方法具有较高的灵敏度，可以满足实际应用的需求。
实施例5特异性实验
本实施例分别以异烟肼耐药结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、土地分枝杆菌、施氏分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、偶然分枝杆菌、草分枝杆菌、巴西诺卡氏、北京棒杆菌、肺炎球菌、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌作为待测样本，按照实施例3中的反应体系构建的检测方法进行检测；阴性对照为去离子水。
检测结果如图4所示，图4为FAM通道的结果，其中曲线1为异烟肼耐药结核分枝杆菌的熔解曲线，曲线2为阳性对照的结果，曲线3为其他非结核分枝杆菌的熔解曲线。根据检测结果，异烟肼耐药结核分枝杆菌出现正常熔解峰信号，其他15株非结核分枝杆菌和阴性对照均无非特异性信号，这表明本发明提供检测方法具有较高的特异性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 广州迪澳生物科技有限公司
<120> 恒温条件检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法与试剂盒
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctccggtaac caggactgaa 20
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctggggttac gctcgtgacg ccagaaaggg atccgtca 38
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
actgaagggg ccaaacccgg gtttggcccc ttcagt 36
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagacgatag gttgtcgggg tgact 25
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgagccgacc tggatgccgc tgatggctcg 30
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagccagtca ccgccacaac ctatcgtctc gccggctg 38

Claims (10)

1.一种用于检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括引物组I和引物组II；
所述引物组I包括外引物KatG-F3、外引物KatG-B3、内引物KatG-FIP、内引物KatG-BIP、环引物KatG-LB；
所述外引物KatG-F3的核苷酸序列为ACGACGTCGAAACAGCGG(SEQ ID NO：1)，
所述外引物KatG-B3的核苷酸序列为CCCACTCGTAGCCGTACAGG(SEQ ID NO：2)，
所述内引物KatG-FIP的核苷酸序列为AGCGGAGCAGCCTCGGGTTCGCACACTTTCGGTAAGACCCA(SEQ ID NO：3)，
所述内引物KatG-BIP的核苷酸序列为GCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGCTGTTGTCCCATTTCGTCG(SEQ ID NO：4)，
所述环引物KatG-LB的核苷酸序列为ATCACCAGCGGCATCGAGGTCG(SEQ ID NO：5)；
所述引物组II包括外引物InhA-F3、外引物InhA-B3、内引物InhA-FIP、内引物InhA-BIP、环引物InhA-LB；
所述外引物InhA-F3的核苷酸序列为TCGTAGGGCGTCAATACACC(SEQ ID NO：6)，
所述外引物InhA-B3的核苷酸序列为CTCCGGTAACCAGGACTGAA(SEQ ID NO：7)，
所述内引物InhA-FIP的核苷酸序列为CTGGGGTTACGCTCGTGACGCCAGAAAGGGATCCGTCA(SEQ ID NO：8)，
所述内引物InhA-BIP的核苷酸序列为ACTGAAGGGGCCAAACCCGGGTTTGGCCCCTTCAGT(SEQID NO：9)，
所述环引物InhA-LB的核苷酸序列为GAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACT(SEQ ID NO：10)。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，还包括分子信标探针katG-M和分子信标探针inhA-M；
所述分子信标探针katG-M的核苷酸序列为CGAGCCGACCTGGATGCCGCTGATGGCTCG(SEQ IDNO：11)，
所述分子信标探针inhA-M的核苷酸序列为CAGCCAGTCACCGCCACAACCTATCGTCTCGCCGGCTG(SEQ ID NO：12)。
3.如权利要求2所述的引物组合，其特征在于，所述分子信标探针katG-M和所述分子信标探针inhA-M各自独立地含有选自下组的修饰：
所述分子信标探针的5’端修饰有荧光基团，选自FAM、HEX、ROX、TAMRA、Texas RED、CY5、Cy3、TET、JOE、VIC中的一种或多种；所述分子信标探针的3’端修饰有淬灭基团，选自BHQ1、BHQ2、Dabcy1、TAMRA、MGB、ECLIPSE中的一种或多种。
4.权利要求1-3任一项所述引物组合在检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性中的应用，其特征在于，包括以待测样本的DNA为模板，利用所述引物组合进行等温扩增和熔解曲线检测。
5.权利要求1-3任一项所述引物组合在制备检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的试剂中的应用。
6.一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物组合、Bst DNA聚合酶和含dNTPs的反应液。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述含dNTPs的反应液包括dNTPs、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Triton X-100；
优选地，所述含dNTPs的反应液中，所述dNTPs的浓度为3-5mM；
优选地，所述含dNTPs的反应液中，所述(NH4)2SO4的浓度为30-40mM，所述MgSO4的浓度为20-30mM，所述KCl的浓度为30-40mM，所述Triton X-100的浓度为0.2％-0.5％，所述Tris-HCl的浓度为60-70mM；所述Tris-HCl的pH为8-8.8。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品；
优选地，所述阳性质控品为野生型结核分枝杆菌、或者含有野生型katG基因和野生型inhA基因的核酸序列的T载体克隆；所述阴性质控品为去离子水。
9.一种结核分枝杆菌异烟肼耐药性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待测样本中提取DNA；
(2)以步骤(1)提取得到的DNA作为模板，利用权利要求1-3任一项所述的引物组合或权利要求6-8任一项所述的试剂盒进行等温扩增和熔解曲线检测。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述等温扩增的反应条件包括：于63℃反应40-50min；
所述熔解曲线检测的反应条件包括：95℃，1min，40℃，2min，升温过程40℃～85℃，升温速率0.1℃/s，进行荧光信号采集。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011087465A (ja) * 2009-10-20 2011-05-06 Nipro Corp 結核菌の薬剤耐性度を判定するための方法および試験片
CN102712944A (zh) * 2009-11-05 2012-10-03 贝克顿·迪金森公司 用于均质、实时检测lamp产物的序列特异性方法
US20130095489A1 (en) * 2010-05-04 2013-04-18 Centers For Disease Control And Prevention Process for detection of multidrug resistant tuberculosis using real-time pcr and high resolution melt analysis
CN110791577A (zh) * 2019-10-25 2020-02-14 中山大学达安基因股份有限公司 一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变基因的试剂盒及方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011087465A (ja) * 2009-10-20 2011-05-06 Nipro Corp 結核菌の薬剤耐性度を判定するための方法および試験片
CN102712944A (zh) * 2009-11-05 2012-10-03 贝克顿·迪金森公司 用于均质、实时检测lamp产物的序列特异性方法
US20130095489A1 (en) * 2010-05-04 2013-04-18 Centers For Disease Control And Prevention Process for detection of multidrug resistant tuberculosis using real-time pcr and high resolution melt analysis
CN110791577A (zh) * 2019-10-25 2020-02-14 中山大学达安基因股份有限公司 一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变基因的试剂盒及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEI-FENG LEE 等: "Study on the LAMP-PCRhybridizationethermal melteELISA method for molecular detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates", BIOMARKERS AND GENOMIC MEDICINE, vol. 6, pages 126 - 132 *
张汇征 等: "荧光ＰＣＲ熔解曲线法在检测临床标本 结核分枝杆菌及其耐药性中的应用", 中国实验诊断学, vol. 25, no. 3, pages 354 - 356 *

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