JP2017523772A - 液滴ソートによるヌクレオチド配列排除富化(needls) - Google Patents
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Abstract
Description
a)1つまたは複数の標的DNA分子および一般的なDNA増幅用の試薬を含む混合DNA分子の液体サンプル設けること(401);
b)前記液体サンプルから混合DNA分子をそれぞれ含有する複数の液滴を形成すること(403);
c)複数の液滴における混合DNA分子を一般的な増幅にかけること、ここで、各液滴は、1つの液滴あたり平均で0.5未満、好ましくは0.25未満、あるいは更により好ましくは0.1未満の前記1つ又は複数の標的DNA分子を含有する(404);
d)少なくとも1つの前記標的DNAを含有する液滴を特異的に検出すること(405);並びに、
e)少なくとも1つの前記標的DNA分子を含有する液滴を選択すること(406)、ここで工程(a)における混合DNA分子のサンプルにおける標的DNA分子の頻度に対し、標的DNA分子の頻度が、0.1×(標的DNAを有さない液滴数)×(標的DNAを有する液滴数)-1から10×(標的DNAを有さない液滴数)×(標的DNAを有する液滴数)-1の間に増加される。
a)混合DNA分子のサンプルを含有する液滴の生成;
b)等温インキュベーション;
c)前記液滴と前記1つまたは複数の標的DNA分子を検出するための試薬との合体;並びに、
d)少なくとも1つの標的DNA分子を含む液滴の特異的検出および物理的選択。
NEEDLS方法に必須の工程について更に下記に説明する。
a)1つまたは複数の特異的な標的DNA分子及び一般的なDNA増幅用の試薬を含むDNAサンプルを設けること(401)
NEEDLSを実施するために、標的DNA分子を含むことがわかっている混合DNA分子のサンプル(つまりDNA分子の混合集団)を選択する。PCR検出、ハイブリダイゼーションプローブによるDNA検出、又は同様の方法といった所望の方法でDNA分子をスクリーニングし検出するために、標的DNA分子内に位置する少なくとも10(または15)ヌクレオチドの1つ又は複数の固有の塩基配列を選択する。標的DNA分子は、各配列が、所定の遺伝子マーカー、例えば、感染性因子の診断用の第1遺伝子マーカー配列と、抗生物質耐性遺伝子の診断用の第2遺伝子マーカー、に対応する1つ以上の固有の塩基配列を含んでもよい。典型的には、混合DNA分子のサンプルにおける標的DNA分子の頻度は10-2未満、例えば、10-3〜10-9(標的配列の塩基対をサンプル中の全DNAの塩基対で除算した値として算出)である。増幅の前に、混合DNA分子の液体サンプルを所望の連続希釈数で連続希釈し、次の液滴形成工程で生成し処理される各液滴が混合DNA分子を含むが平均で0.5未満、好ましくは0.25未満、より好ましくは0.1未満の特異的な標的DNA分子を含むようになるまで行う。つまり、混合DNA分子の液体サンプルがそれぞれ混合DNA分子を含む100滴の液滴に分離される場合、これらの液滴うち平均で50滴未満、好ましくは25滴未満、より好ましくは10滴未満に標的DNA分子が存在するということである。本明細書では、液滴中の標的DNA分子の有無を、本明細書で例示する標的DNA分子の特異的検出のために使用する方法を用いたときに検出可能な標的DNA分子の存在または不在として定義する。この希釈は、標的の富化を確実にするために行う。つまり、標的を含有する液滴の平均数が低い場合、液滴内の非標的分子に対する標的の頻度が高い。混合DNAサンプルにおける標的DNA分子の頻度及び存在量は、PCR、リアルタイムPCR、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ、又は標的配列のRNAまたはタンパク質産物を検出するアッセイにより決定してもよい。
希釈したサンプル混合DNA分子および一般的なDNA増幅に必要な試薬を含む液滴は、液滴を生成し標的DNA配列を閉じたコンパートメント内に単離する任意の方法により生成される。液滴生成のための適切な方法としては、能動的な方法、例えば、音響エネルギーにより液滴を吐出する方法、誘電泳動(DEP)、誘電体上のエレクトロウェッティング法(EWOD)、並びに受動的な方法、例えば、T字路フロー集束法などの受動方法が含まれる[1]。液滴に加え、マイクロ流体チップ内の反応チャンバなど他の微小量のコンパートメントでも一般的な増幅が起こり得る。
各サンプルにおけるDNAの存在量を増やすため全DNAを増幅する任意の方法により各液滴におけるDNAを増幅する。適切な増幅方法として、縮重オリゴヌクレオチドプライム化PCR(DOP−PCR)、多置換増幅(MDA)[4]、ランダムプライム化PCR又は類似の方法が挙げられる。
工程c)における全DNAの一般的な増幅に続き、所望の検出技術を用いて、標的DNA分子の存在について液滴をスクリーニングする。標的DNA分子を含有することが示された少なくとも1つまたは複数のスクリーニングされた液滴では、標的DNA分子の頻度は、工程(a)での混合DNA分子のサンプルにおける頻度に比べて高くなる。頻度の増加は、典型的には0.1×(標的を含まない液滴数)×(標的を含む液滴数)-1〜10×(標的を含まない液滴数)×(標的を含む液滴数)-1である。あるいは、頻度の増加は、0.1×(標的を含まない液滴数)×(DNAを含む液滴合計数)-1〜10×(標的を含まない液滴数)×(DNAを含む液滴合計数)-1であると算出される。標的を含む液滴数は典型的に1つの標的配列あたり2〜100である。全液滴数は少なくとも1,000であるが、典型的には10,000を超える。
工程d)における標的DNAの検出に基づいて、液滴は少なくとも2つの異なる流れにソートされる。工程d)において複数の特異的な標的が検出される場合、液滴は3、4、5又はそれ以上の流れにソートされてもよい。標的DNAが検出された液滴を含有する流れの中では、液滴内の非標的DNAに対する標的DNAの存在量が、工程a)における混合DNA分子のサンプルよりも富化される。
f)標的DNAの特異的検出のために生成されたDNAを不活性化、分解、又は除去すること、
NEEDLSの更なるラウンド又は検出産物の存在が更なる工程を妨害するような他の用途において富化された標的DNAを使用する場合、検出工程c)において、デオキシリボヌクレオチド(dNTPs)の1つの代わりにdUTPを用いて、DNAを増幅することができる。ここで、産物は任意選択的に、分解、不活性化又は除去され得る。この不活性化は、UNG又はUDGとしても知られるウラシルDNAグリコシラーゼといった酵素を用いて行ってもよい。
(e)で得られた富化された標的DNAを含む液滴を用いて、新たな工程(a)で標的DNAをさらに富化してもよい。
(d)で得られた富化された標的DNAを含有する液滴を用いて、標的DNAを、MDA等の一般的な増幅又はPCR等の特異的な増幅により、さらに増幅してもよい。
スキームを図4に概説する。混合DNA分子の元のDNAサンプルにおける標的DNA分子の濃度を決定する(401)。標的分子(陽性液滴)を含有する予想平均液滴数が0.5未満になるまで、サンプルを希釈する。1つの標的の存在量を液滴における非標的DNAに対し富化する場合、陽性液滴の平均数を少なくして富化度を高める必要がある。理想的には、液滴の全サンプルは、1つの標的あたり2〜100滴、好ましくは3〜50滴、より好ましくは5〜20滴の陽性液滴を含むべきである。標的の複数の配列変異体が存在する可能性がある場合、それぞれの変異体は、別個の標的DNA分子としてカウントする。標的数、陽性液滴の平均数、NEEDLSによる富化の間の相関を、1ラウンドのNEEDLSで1つの標的について20,000滴の液滴と10滴の陽性液滴を有する例を用いて図3に示す。
NEEDLSを応用してマルチプレックスNEEDLSを実行できる。マルチプレックスNEEDLSは、解析した混合DNA分子のサンプルにおいて、第2の標的DNA分子を生成するための配列特異的なプライマーを用いて第2の連続配列を増幅することにより、少なくとも10(又は15)ヌクレオチドの第2の連続配列を検出するために設計された追加の特徴を利用する。幾つかの液滴が第1及び第2の連続配列の両方から特異的検出(例えば、蛍光シグナルにより)を示したら、それらは同じMDA増幅された標的DNA分子内に位置する。同様に、異なる特異的な標的DNA分子のそれぞれを検出するための特異的なプライマーを用いて、本発明の方法により、1〜20又はより様々な特異的標的DNA分子の固有の配列を、DNA分子の混合サンプルにおいて検出できると想定される。
III.i混合DNA分子のサンプル
NEEDLSを、標的DNA分子を含むことがわかっている混合DNA分子のサンプルに適用してもよい。混合DNA分子のサンプルは、DNA分子の混合集団(例えば、染色体DNA分子又はプラスミドDNA分子)を含む。この集団における個々のDNA分子は、それらのDNAにおいて少なくとも10(又は15)の核酸塩基対の既知の連続配列において少なくとも1塩基異なり、既知の連続配列を含む標的分子がサンプルにおける非標的分子とは異なる又は差別化可能になっている。混合DNA分子のサンプルは、追加的に、一本鎖RNA又はDNAポリヌクレオチドを含んでもよい。混合DNA分子のサンプルにおけるDNA分子の集団は、標的DNA分子を含む。
本発明の一実施形態によれば、標的DNA分子は、染色体または染色体外DNAのいずれであってもよい細胞のゲノムに由来する。さらに、標的DNA分子は、微生物細胞、植物細胞、動物細胞、または哺乳動物細胞の中から選択される細胞に由来してもよい。哺乳動物細胞はヒト細胞であってもよい。微生物細胞は、細菌細胞、酵母細胞または真菌細胞であってもよい。さらに、標的DNA分子は、真菌の菌糸体または真菌胞子由来であってもよい。
標的DNA分子を含む混合DNA分子のサンプルは、自然界または生物(例えば、生検)から採取したサンプルから調製してもよい。DNA分子の選択的抽出のための方法は当該分野で知られている[3]。標的DNA分子が細胞に由来する場合、細胞破壊または細胞透過処理の工程は、通常、細胞から全核酸分子(DNA又はRNAを含む)を放出するために必要であり、この工程は、その後のDNA分子の選択的抽出工程の前に行われる。
本発明の方法は、複数のサンプル液滴を形成することを含む、ここで各液滴は平均で0.5未満の特異的な標的分子を含む。好ましい実施形態では、特定の標的分子の分布はポアソン分布に従う。幾つかの液滴は、標的分子と比較して10倍以上の濃度で存在する非標的分子を含みうるが、標的分子のみを含む液滴もある。
ランダム縮重プライム化PCR(randomly degenerate primed PCR)、リンカーライゲーションPCR、オリゴヌクレオチドプライム化(Degenerate Oligonucleotide Primed)(DOP)PCR、多置換増幅(Multiple Displacement Amplification)(MDA)等の様々なアプローチがDNAの一般的な増幅として提案されている。MDAは、DNAが非常に少量であっても全ゲノム増幅(WGA)を行うのに効率的であることが証明されている[7]。伝統的なPCRベースのWGA法と比較して、MDAは、より高分子量でより良好にゲノムをカバーするDNA分子を生成する。MDAは、二つの酵素活性、バクテリオファージphi29DNAポリメラーゼによって例示されるようなDNA合成活性(ポリメラーゼ)および、3'の5'方向に一本鎖DNAを分解するエキソヌクレアーゼ活性、を有する鎖置換ポリメラーゼを用いる。これは真核生物のB型DNAポリメラーゼに属するポリメラーゼUniProtKB/TrEMBL:Q38545)である。他の有用なポリメラーゼとしてBstlポリメラーゼが挙げられる。
一般的な増幅に続いて、標的DNA分子を検出するための試薬を液滴に添加してもよい。あるいは、検出用の試薬を液滴の生成前に添加してもい。試薬の液滴への添加は、水性液体のアリコート(例えば、PCR反応または他の検出混合物を含む)を設けるための手段や、第2の非混和性液体に懸濁された水性の液体の液滴(例えば、一般的な増幅工程から得た液滴)に前記アリコートを融合するための手段や、第二の非混和性液中に懸濁された前記液体液滴の融合物をさらにコンパートメントへ分けるための手段を有する装置を用いて行ってもよい。液滴融合または液滴噴射技術の例は、[5、8]に記載されている。本発明の特定の実施形態では、一般増幅されたDNAを含む液滴に添加する試薬は、検出対象の特定の標的DNAに相補的な特異的なプライマーまたは特異的なプローブを含む。特異的なプライマーを添加する場合、試薬は、TaqポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼおよびdNTPを含む。また、試薬は検出工程で生成されたDNAのその後の分解を可能にするためのdUTP、および/または蛍光による検出を可能にする核酸色素を含有してもよい。他の実施形態では、検出は、標識プローブまたはプライマーからの蛍光に基づく。
本発明の方法は、一般的な増幅により増幅されたDNAを含む液滴内の標的核酸分子を検出することを更に含む。特定の実施形態において、検出は、標的分子の一部を増幅することを含む。核酸分子を増幅するのに適した増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応、またはネステッドポリメラーゼ連鎖反応が挙げられ、TaqManプローブ、スコーピオンプローブ、分子ビーコンプローブ、およびハイブリダイゼーションにより標的DNAが配列特異的に認識され標的配列の増幅により蛍光が増大するように機能する他の任意のプローブを含んでも含まなくてもよい。
標的が検出されなかった液滴から、検出可能な標的DNA分子を含む液滴に選択的に分けるために、液滴を物理的に選択または液滴をソートするための様々な異なる方法、例えば、ステアリング、加熱、および音波などを用いる方法が挙げられる[5]。このような物理的選択は、第2の不混和性液体に懸濁された水性の液体の液滴(例えば、特異的検出工程から得た液滴)を受け取る手段;および、前記液滴内の検出可能な成分を検出することができる検出ユニットに各液滴を通過させるための手段;および、検出可能な成分の有無により決定される選択コンパートメントに送達するために、前記液滴を方向づける手段;および、前記液滴を選択コンパートメントに送達する手段を有する装置を用いて行いうる。
特異的な標的配列の存在に基づいて液滴を物理的に選択した後、いくつかの場合では、PCR産物といった検出シグナルを除去する必要があることがある。このようなシグナルを除去するためのいくつかの方法が当該分野で知られている。dUTPが検出反応で使用された場合、検出分子は、ウラシルDNA Nグリコシラーゼを用いて除去してもよい[9]。あるいは、一般的な増幅により生成された分子は検出分子よりも非常に長いので、検出分子は、シリカ粒子に対する大きいDNAと小さいDNAの結合親和性の差異に基づくサイズ排除といったサイズ分離に基づく方法を用いて分離できる[10]。このようなシリカ表面は100bp未満のDNAへの結合効率が限られているので、シリカベースの精製を適用する場合100bp未満のDNAのみが効率的に除去される。しかし、検出分子を除去することが必要ではない場合もある。例えば、Phi29およびいくつかの他のポリメラーゼは1000bp未満のDNAに対する活性が低いので、続くNEEDLS富化後の工程が一般的な増幅である場合、検出分子を除去する必要が無いこともある。というのは、全部を増幅したとしても、検出分子が増幅されるのは、大きなDNA分子が実際の標的である場合と比較して限られた範囲のみだからである。
NEEDLSによる標的DNA分子の富化は、前記DNA分子における少なくとも15ヌクレオチドの固有の連続配列の1つまたは複数の検出に基づく。検出が、1つまたは複数の固有の連続配列が増幅されて標的DNA分子を生成するPCRに基づく場合、この分子の塩基配列が決定できる。加えて、5’及び3’方向で標的DNA分子にフランキングする塩基配列は、ラピッドゲノムウォーキング(RGW)[11]により決定できる。RGWは、標的DNA分子といった既知の配列から出発する大きなDNA分子における上流又は下流の配列を決定するための簡便なPCRベースの方法である。RGWは、PCRを用いて大きなDNA分子における6kbまでの個々の増幅を可能にする。前回のサイクルにおいて得られた配列に基づく新しいプライマーを用いてRGWの複数のサイクルを行うことにより配列が簡便に延長できる。典型的には、4つの異なる制限酵素で別々にDNAを消化し、その産物を特別に設計されたアダプターにライゲーションすることによって、大きな標的DNA分子の精製サンプルからライブラリが構成される。次いで、ライゲーションしたDNAを、サンガーシーケンシング、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーション、または2塩基コーディングシーケンシング、あるいは類似の方法によるシーケンシングといった、所望のDNAシーケンシング法を使用して、アダプターまたはDNA内の既知の配列にアニールするプライマーを用いてシーケンシングする[12]。
自然界から回収されたサンプル又は臨床サンプルから抽出されたDNA分子の混合サンプルにおける標的DNAを単離又は富化するためのNEEDLSの使用により、サンプルの複雑さのため他の方法によって分析できないゲノム又はその一部への直接アクセスがもたらされる。NEEDLSは特に、遺伝病、癌、および感染症に関与するDNA分子を単離又は富化するのに有用である。
ゲノム等の大きなDNA分子のシーケンシングを行うとき、得られる配列情報には、シーケンシングした分子が重複していないか又は組み立てることができないようなギャップが含まれることが多い。NEEDLSは、小さな検出領域の周囲100,000bpまでの配列を取得し、これにより、未知のギャップ領域をカバーするように設計できるので、NEEDLSはDNA配列のギャップを閉じるのに特に有用である。
NEEDLSは、医学的な兆候または疾患を診断またはその進行度をモニタリングするために、生検または対象(例えば、ヒトまたは動物対象)から得られる体液や排泄物のサンプルなどの多細胞生物に由来するサンプルにおける標的DNAを分析するのに使用してもよい。
NEEDLSは、複雑な混合DNAサンプルから所望のDNA領域の増幅が発生したサンプルを特異的に選択することに基づく。Phi29ベースの増幅(MDA)が、現在利用可能な最も信頼性の高いゲノム増幅として、繰り返し説明されてきたが、かなりのバイアスを含むことが知られている。Pan et al.[18]は、一般事項として、増幅バイアスを回避する複雑なDNAプールの非常に特異的な全ゲノム増幅(WGA)には課題が残っていると述べている。また、同様の事項が、DOP−PCRおよびランダムプライミングPCRなどの代替的な増幅法でも観察される。これら2つの増幅法は、座位表現(locus representation)を再現するにそれほど効率的ではないと記載されており[19]、多くのバイアス増幅産物が得られるという結果となる。存在する反応の鋳型の量にかからわす、バイアスは一見不可避なようであるが[20]、鋳型独立産物(template independent product;TIP)または増幅中に導入されたバイアスの量は、反応におけるDNA鋳型の量と負の相関するようであり、いくつかの研究では総収量の70〜75%を表すとされている[18]。全ゲノム増幅はNEEDLS過程でDNAを増幅するために適用され、それゆえ、ゲノム増幅のバイアスに関連するこれらの一般的な課題もNEEDLSに当てはまると予想される。よって、WGAを含む手順としては、標的DNA分子に対して多大なバイアスが観察されるだろうと予想される。したがって、WGAを採用するNEEDLSなどの手順は、混合サンプルにおけるDNAの特定の領域を富化できる方法として考慮されてこなかった。
NEEDLSは、例えば、生検のヒトゲノムといった生物学的サンプルの大きなゲノムにおけるDNA標的を検出し特徴付けるのに非常に効率的な解析ツールを提供する。これは、以下の例で説明することができる。
1.各液滴が混合DNA断片を含有し、かつ、1つの液滴当たり5個のDNA断片が平均で存在するように、DNAを複数の液滴に分ける。したがって、液滴数は100,000/5=20,000液滴となる。20,000個の液滴のうちたった1つの液滴のみに標的DNA分子が含まれる(つまり、各液滴は、0.1コピー未満の標的DNA分子を含むだろう)。
本実施例では、標的リパーゼDNA分子を分離、増幅、同定、単離、および再増幅するためにデュアルチャネルマイクロ流体システムをどのように適用することができるかを実証する。隣接するDNAを含む標的DNAは、元々の宿主からシーケンシングに利用できるようになる。その手順を図5に概略的に示す。
堆積コンポスト(中心温度38℃)から得た混合サンプルを使用して初期DNAサンプルを回収した。他の文献[13]に記載のようにビーズビーティングを用いてDNAを5gのサンプルから抽出した。抽出されたDNAをまず標的リパーゼ遺伝子の存在について検査したところ、下記のPCRに十分な量のDNAを含有することがわかった。PCRは、プライマーLip−Fw: 5’ - CTG AAT GGG GGA ATA ATG ACA AGC C - 3’[配列番号1]及びLip−Re: 5’ - CTA TAC TCT TCT TTT AAT TCC TCA GC - 3’[配列番号2]を用い、約105bpのPCR産物を得た。PCR条件は94℃、62.1℃、72℃(15秒/15秒/90秒)のサイクルを合計40サイクル行った。
Pan et al.[14]に記載のように100μLのPhi29反応体積を得た。まだ反応混合物を低温で(最大+4℃)保持しつつ、phi29混合物を、8チャネルの使い捨て液滴発生器のカートリッジ(BioRad)にウェルに載せた。同じ手順を他の追加のウェルについても行い液滴カートリッジの全容量を使用した。その後、残りのチャネルに、液滴油(BioRad)を充填した。完全に充填した液滴発生器のカートリッジを液滴発生器(BioRad)に入れ、カートリッジの全ての反応コンパートメントにおいて完全な反応体積の液滴を形成した(502)。
本実施例は、古典的なプライマー設計により、目的の領域を選択的に選択することによってNEEDLSの単一パスを使用して、如何に未完成のゲノム配列が「ギャップ閉鎖」することができるかについて説明する。この実施例では、Thermoanaerobacter italicus(CP001936J)のゲノム内に57のギャップの存在が示すペアエンドライブラリに対しギャップ閉鎖を実施した。本実施例では、ギャップが422bp〜5,201bpのサイズの範囲である。NEEDLSの単一パスの後に次世代シーケンシング(NGS)による再シーケンシングを行い、さもなくば未完成になってしまうゲノム内の全てのギャップを効率的に閉じる。所望の領域の増幅が行われているこれらの液滴を特異的に選択しシーケンシングすることによってギャップが閉鎖される。そうすることにより、選択的に標的とされた再シーケンシングが達成され、全てのギャップが閉鎖され完全な環状ゲノムを生成した。
(BG10特許)に記載のように2mLの嫌気下で完全増殖した細菌培養物を調製し、抽出をThermo Scientific Gene Jet DNA精製キットを用いて業者の説明通りに行った。溶出および抽出したDNAは、100μLの最終体積中に20ng/μLの濃度を有していた。
サンプルDNAを5x10-4に希釈し、1μLを、アニーリング緩衝液(SampliPhi)においてランダムエキソ耐性ヘプタマーおよびエキソ耐性ヘキサマープライマーと混合し、BioRad MyCycler PCR機を用いて温度を94℃に3分間上昇させ、その後、5℃/分の速度で温度を20℃まで徐々に減少させることにより、プライマーを鋳型にアニーリングさせた。20℃の温度に達した混合物を氷に移した。実施例1に記載のように、Phi29反応バッファ、dNTP、水、及びPhi29ポリメラーゼを混合物に加えた(701)。
プライマーは、ギャップの5’または3’方向のいずれかで約100bpの位置を標的とするように手動で設計されている。図6に示すように、5000bpよりも大きいギャップには、二組のプライマーを、一組のプライマーと一緒にギャップの各側に適用した。
プライマー1−GAP−Re:5’−CGGATTTCCTCCTTTCTATTCC[配列番号6]
プライマー2−GAP−Fw:5’−GCCTTGCAAATTCTACATTGACAG[配列番号7]
プライマー2−GAP−Re:5’-CCAAGAAAATCATGGGAGATAGTTC[配列番号8]
ギャップが埋められたペアエンドゲノム配列により、それぞれ5〜6対の設計されたプライマー(各10pmol/μL)を含む10通りの組み合わせのdUTP反応混合物(#1〜#10)をインシリコで作成した。各組み合わせには、10〜12個のプライマーが含まれていた。プライマーの組み合わせは、別個の液体溶液内で保持し、連続的にアラインさせ、その後[15]に記載されるように液滴とPCR液体サイズを合体させることによりそれぞれのMDA液滴と組み合わせた(705)。得られた最終的な液滴サイズは、10〜20nLの範囲であった。その後、全ての合体した液滴を1つの反応チューブに回収し、以下に記載されるようにdUTP−PCR反応を開始した。
単一のチューブ内の全ての合体された液滴について、MyCyclerPCR装置(BioRad社)にて以下のサイクリングパラメータを用いる二段階PCRとしてPCR増幅を実施した:94℃(15秒)、94℃で15秒の変性および72℃で15秒の伸長から成るサイクルを25サイクル(706)。PCR増幅の後、測定および単離のために[15]に記載されるようなマイクロ流体デバイスを用いて50,087個の液滴を解析し、1,807個を選択的にソートした(707)。
反応物にSDSを添加して最終濃度を10%(w/w)にすることにより液滴油を除去し、その後、酢酸アンモニウムを添加して最終濃度を2Mにした。溶液を5分間氷上に置き、その後4℃で10分間16.000Gで遠心分離することによって沈殿させた。2倍体積の7MグアニジンHCIを添加し、クリーンアップスピンカラム(GeneJet DNA抽出、Thermo Scientific)を使用して混合物をクリーンアップした。DNA抽出キットに含まれる洗浄バッファを用いて1回の洗浄手順を施した。その後、20μLの溶出したDNAを、業者の説明通りにUDG(Thermo Scientific)で処理し、10分間95℃で熱不活化することによって反応を停止させた。得られた産物を、遠心分離によってエタノール沈殿させ、その後DNAペレットを5μL(5mM)のトリスバッファに再懸濁した。
全体積が5μLの(UDG処理および沈殿した)DNA鋳型を、全体積が50μLの SampliPhi再増幅における鋳型として用い、合計1μgの増幅DNAを生成した(708)。合計体積をEurofins Genomic (Ebersberg、Germany)によってヌクレオチドシーケンシングし(710)、初期のギャップが埋められたゲノムと得られたGAPゲノムデータのアセンブリを、デフォルトパラメータでゲノムアセンブリするためのCLC Genomics Workbench version 6.0.4を用いて行った。最終結果により、ゲノムの完全アセンブリが示され、最終的な環状ゲノム配列が、合計2,451,061のヌクレオチドを有することがわかった。閉鎖GAP配列をGAPとして[配列番号9]に表す。
本実施例では、液滴ベースのSampliPhを使用してサンプル中の元の多様性を維持しながら、混合試料の標的亜集団から特異的にDNAを単離する方法を示す。この実施例では特異的なプライマーによりStaphylococciが標的とされる。これらのプライマーを用いて選択的に増幅された液滴を単離し、最後に、完全な16SrRNA保存配列、16Sと23SrRNAとの間の遺伝子間転写スペーサー(ITS)、および保存23SrRNA遺伝子領域にわたるPCRを分類に使用して高分解系系統解析を作成した。
Staphylococciの16SリボソームDNAを標的とするプライマーを、Primroseプライマー設計ソフトウェア[16]を用いて設計した。16S遺伝子の保存領域は、特異的プライマーStaph−Fw:5’- AGA CTG GGA TAA CTT CGG GA −3’[配列番号3]、とStaph−Re:5’- CGT CTT TCA CTT TTG AAC CAT GC -3’[配列番号4]により標的化し、76bpのPCR産物を生成した。
ボランティアから得た感染が疑われる組織の綿棒サンプルを鋳型として用い、GeneJet Genomic DNA purification(Thermo Scientific)を用いてDNAを抽出した。標的DNA配列(Staphylococcus aureus)の存在を確認するために、予備PCRを用いた。10倍希釈系列を使用し、融解曲線特性と共にRT−PCR解析から得たCq値に基づいて量を確認した。Garcia−Armisen et al.[17]に記載のMPNを用いて、得られたPCR結果を推定標的量に変換した。各細菌標的が平均5.5コピーの16SrRNA遺伝子を有すると推定されることより、総量約8,300個の16SrRNA遺伝子コピーを再計算したところ、μLあたり1,709個の標的化ブドウ球菌であると計算された(701)。
1μLのDNA鋳型を含有する20μLのSampliPhi混合物を調製し、実施例1に記載したように液滴発生器に添加し、それぞれ1nLのSampliPhi Phi29反応混合物を有する液滴を約20,000滴生成した(502)。反応物を30℃で2時間インキュベートし(504)、続いて温度を+4℃に下げて反応を停止させた。
最終増幅の直後に、RT混合物(SSO Advance Supermix、BioRad)を用いて、各液滴を9nLのRT−PCR混合物と合体させて10nLの反応容積を確立し、すべての必要なPCR反応成分を有するようにした。SSO Advance supermixを製造業者による説明通りに調製し、特異的プライマー(Staph−F[配列番号3]+Staph−R[配列番号4])を補充した(505)。
ソートされたSampliPhi増幅液滴を、Yu et al.[19]によって記載されたスピンカラムDNA抽出手順を用いて抽出した。この手順により、クリーンアップ中に用いたシリカ膜のサイズ依存性結合効率により、主に、100bpより大きい産物が精製される結果になる。よって、主にサイズが100bpより大きいDNA産物がクリーンアップにより精製される。従って、PCR産物の略全部が増幅から除去される一方、Phi29増幅されたDNAは容易に回収された。全量を50μLのSampliPhi反応に添加することにより、溶出した10μLのDNA(PCR産物のサイズのためPCR産物が減少)を再増幅した(508)。最終産物は、220ng/μLの濃度を有すると測定され、これは総量11μgのDNAに対応する。最終産物の塩基配列を決定した。
得られたDNAの配列の16SrRNAクローンライブラリー研究により、すべての16SrRNA遺伝子が同一であり、それらがブドウ球菌属に属するだろうことが判明したので、研究対象の感染は単一のブドウ球菌(Staphylococcus)株由来であったと結論付けた(図8)[配列番号10]。さらに、この研究の間に得られた配列データの解析により、得られた配列の系統学的類似性が強化され、得られた配列の全てが100%同一であったので、マルチプレックス感染培養よりむしろクローン分布であることが示される。16SrRNAおよび23SrRNA遺伝子の両方が存在する組み合わせ解析の結果により、距離を持って関連する(distantly related)細菌が解析されたサンプル中に存在する場合であっても、系統分類の精度が高くなる。さらに、16SrRNAと23SrRNA遺伝子との間の高度に可変なITS領域も解析に含まれていたので、記載の実施例は、非常に緊密に関連する株であっても区別する情報も提供する。我々は、クローン起源の感染の発生を複数の株起源の感染とを区別するためにもこの情報を用いた。
本実施例は、非標的バックグラウンド(HeLa)DNAが元々豊富であるサンプルにおいて、液滴ベースのSampliPhiを用いて、特異的に標的化されたDNA配列(E.coli由来のThrA遺伝子)からDNAを単離する方法を示す。液滴生成チップを用いてPhi29(酵素)反応成分を有する液滴を生成し、フルオロカーボンキャリア油中に約800〜900plのモノ分散液滴を生成した。各液滴にPCR成分を加え、標的配列が存在する液滴をPCRで増幅した後、蛍光液滴として検出し、ソーティング用のマイクロ流体デバイスを用いて収集した。
E.coliのthrA領域を標的とするプライマーおよびビーコンを手動で設計した。ビーコン折りたたみ構造は、mFoldソフトウェア[20]を用いて確認した。
MB8fw1:5’-GACGGTAGATTCGAGGTAATGC-3’[配列番号11]
MB8Re1:5’-TATGGCCGGCGTATTAGAAG-3’[配列番号12]
MB8.9:5’(HEX)−CGTTTGTGTTTTCGACCGGATCGATAACAGTAACG-3’(BHQ)[配列番号13]
E.coli(Life Technologies)およびHeLa(Promega)由来のDNAを、1μg/μlのE.coliおよび4μg/μlのHelaの最終濃度で混合した。ゲノムサイズに基づく計算から、この混合物は約200コピーの標的遺伝子(ThrA)prを含む。μlおよびリアルタイムPCR測定により、標的の初期量が200コピー/pgであることが確認された。
1μLのDNAサンプルを含む15μLのPhi29混合物を調製し、実施例1に記載したように液滴発生器に添加した。この手順により、それぞれ約800〜900μLのPhi29反応混合物を有する液滴を約16,500滴を生成した。液滴生成は、液滴生成の前に系内で増幅が起こらないように4℃で実施した。次いで、反応物を30℃で4時間インキュベートした。
最終増幅の直後に、合体用x接合チップを用いて各Phi29液滴を、(x1 PCRバッファ、0.1mMのdNTP、0.2mMのMg+、0.05UのGoTaq2、0.025pmol/μlのMB8−Fw1、0.025pmol/μlのMB8-Re1、0.018pmol/μlのMB8.9−BHQ−HEX)を含む4nLのPCR混合物と合体させた。合体した液滴(約5nl/液滴)の全回収物を、2試薬液滴チップ(ゲートサイズ:50μm)にポンプで注入し、平均サイズ80plの液滴を合計210,000個生成した。標準的なPCR装置(MyCycler、BioRad)において95℃(2分)+35サイクルの94℃(3秒)+56℃(15秒)の2段階増幅プロトコルを使用し、それぞれ合体させ再液滴で形成された液滴におけるPCR増幅を行った。標的鋳型が最初に増幅されたそれらの液滴は、特異的な標的が存在しない液滴と容易に区別できる強い蛍光シグナルを生成した。陽性液滴と陰性液滴との区別は、HEX蛍光発光源および検出フィルターを備えた標準蛍光顕微鏡(Nikon)を用いて行った。
集めた液滴を、重力流によってマイクロ流体装置から回収し、200μlのPCRチューブ内の50μlのフルオロカーボン油に回収した。10μlの水をチューブに添加して、混合物の水相の単離に使用した。次いで、10μlのサンプルを回収し、10μlの全容量を鋳型として使用し、最初のPhi増幅(Enzymatics)で上述した条件と同一の条件を用いて、再増幅した。
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Claims (15)
- 混合DNA分子のサンプルから1つ又は複数の標的DNA分子を富化するためのインビトロの方法であって、以下の工程を含む方法:
a)1つまたは複数の特異的な標的DNA分子および一般的なDNA増幅用の試薬を含む混合DNA分子の液体サンプル設けること(401);
b)前記液体サンプルから混合DNA分子をそれぞれ含有する複数の液滴を形成すること(403);
c)複数の液滴における混合DNA分子を一般的な増幅にかけること、ここで、各液滴は、1つの液滴あたり平均で0.5未満、好ましくは0.25未満、あるいは更により好ましくは0.1未満の前記1つ又は複数の標的DNA分子を含有する(404);
d)少なくとも1つの前記標的DNAを含有する液滴を特異的に検出すること(405);並びに、
e)少なくとも1つの前記標的DNA分子を含有する液滴を物理的に選択すること(406)、ここで工程(a)における混合DNA分子のサンプルにおける標的DNA分子の頻度に対し、標的DNA分子の頻度が、0.1×(標的DNAを有さない液滴数)×(標的DNAを有する液滴数)-1から10×(標的DNAを有さない液滴数)×(標的DNAを有する液滴数)-1の間に増加される。 - 液滴の合計数が少なくとも10,000である、請求項1に記載の方法。
- 工程c)における前記一般的な増幅の後、前記1つまたは複数の標的DNA分子の特異的検出用の試薬を、前記複数の液滴に添加する(505)、請求項1に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の標的DNA分子の特異的検出用の試薬が、前記サンプル中に含まれる(401)、請求項1に記載の方法。
- 前記標的DNA分子は、1つまたは複数の少なくとも10ヌクレオチドの固有連続配列を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(c)におけるDNAの一般的な増幅は、ランダム縮重プライム化PCR、リンカーライゲーションPCR、縮重オリゴヌクレオチドプライム化(DOP)PCR、及び多置換増幅の中から選択される技術によって行われる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 特異的検出はPCRを用いて行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 特異的検出用の試薬は、dUTPを含有する、請求項2〜6のいずれか1項に記載の方法。
- (f)前記1つ又は複数の標的DNA分子を特異的に検出するために、生成されたDNAを不活性化、分解、又は除去すること、を更に含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 不活性化は、ウラシルDNA Nグリコシラーゼを用いて行われる、請求項8に記載の方法。
- 前記方法は、
(g)工程(a)〜(e)を反復することを更に含み、
ここで、反復する工程(a)の前記液体サンプルにおける混合DNA分子は、工程(e)で選択された標的DNA分子を含む液滴由来である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。 - (h)工程(e)で得られた液滴中に含まれる標的DNA分子を増幅することを更に含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的DNA分子は、1,000〜100,000の核酸塩基対、好ましくは2,000〜70,000の核酸塩基対、より好ましくは2,500〜50,000の核酸塩基対を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的DNA分子は細胞のゲノムに由来する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)で形成された前記液滴は、1つの液滴あたり平均で0.5未満、好ましくは0.25未満、更により好ましくは0.1未満の標的DNA分子を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
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