KR20140071968A

KR20140071968A - Ｐｃｒ에 의한 미생물 ｄｎａ 검출 방법, 이를 위한 시스템 및 조성물

Info

Publication number: KR20140071968A
Application number: KR1020137033578A
Authority: KR
Inventors: 칭-핑 쳉; 샤이-신 창
Original assignee: 다이노큐브 인베스트먼트, 엘엘씨; 칭-핑 쳉
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2014-06-12
Also published as: WO2012159060A3; CN103917660B; JP6112623B2; JP2014516529A; AU2012255042B2; CA2842659A1; RU2013153505A; TWI465572B; AU2012255042A1; RU2620953C2; BR112013029601A2; EP2710155A2; CN103917660A; US9388458B2; EP2710155A4; US20120295806A1; TW201247878A; WO2012159060A2

Abstract

본 발명은 광범위 PCR에 의해 샘플 중 낮은 존재비의 미생물 DNA를 검출하기 위한 방법, 이를 위한 시스템 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 표적 DNA 주형의 5' 말단을 비 박테리아 태깅 서열로 태깅하여, 주형을 PCR 시약 중에 존재하는 내부 오염 물질과 격리시키는 신규 전략을 기반으로 한다. 또한, 태깅된 주형을 증폭하기 위하여 주형과 프라이머 세트를 태깅시키기 위한 융합 프로브도 제공한다. 본 발명의 방법을 용이하게하고 자동화하기 위한 시스템 및 키트도 또한 제공된다.

Description

ＰＣＲ에 의한 미생물 ＤＮＡ 검출 방법, 이를 위한 시스템 및 조성물{METHODS, SYSTEMS, AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF MICROBIAL DNA BY PCR}

관련 출원에 대한 상호 참고 문헌

본 출원은 전체 내용이 본원에 참조로 포함되어 있는 미국 가출원 제61/487,709호(2011년 5월 19일 출원)의 이익을 주장한다.

서열 목록

본 출원은 서열 목록을 포함하고 있다.

본 발명의 분야

본 발명은 분자 분석 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 미량의 미생물 DNA를 검출하기 위한 PCR 기반 방법과 이를 수행하기 위한 조성물에 관한 것이다.

이론상 중합 효소 연쇄 반응(PCR)은 분석물(예를 들어 식품 샘플이나 임상 표본) 중 미생물을 신속하게 검출하기 위한 모든 현존 방법들 중 잠재적으로 가장 감수성이 크다. 광범위한 병원체들의 검출이 필요하고, 병원체들 중 일부가 시험관 내 배양되는 것이 어렵거나 오랜 배양을 필요로 하는 경우, PCR의 가치가 특히 높게 평가된다. 예를 들어, 보존 유전자, 예를 들어 16S rRNA 유전자(박테리아) 또는 18S rRNA 유전자(진핵 생물 병원체, 예를 들어 진균)를 표적화함으로써, 하나의 PCR 반응만을 사용하여 랜덤 스크리닝 또는 검출이 이루어질 수 있다. 그러나, 실제로 미량의 미생물을 검출하기 위한 광범위 PCR(broad-range PCR)을 사용하는 것에는 여전히 난제가 수반된다. 미생물 검출시 PCR의 실제적인 적용을 한정하는 몇 가지 인자들로서는 억제 인자, 오염 및 실험 조건에 대한 PCR 고유의 취약성을 포함한다. 가장 어렵고도 오랜 기간의 문제점들 중 하나로서는 PCR 시약의 내부적 오염이 있다.

PCR 수행용 시약(심지어 시판중인 것)은 박테리아 공급원으로부터 얻어진다. 그러므로, 시약, 특히 Taq DNA 중합 효소는 불가피하게 공급 박테리아 유래의 어느 정도 수준의 DNA 오염을 함유한다. 오염 DNA는 보통 서머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 또는 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)로서 확인될 수 없는 균주 또는 균종을 1가지 초과로 포함하나, 이와 같은 균주 또는 균종은 균종 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리제네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) 또는 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii)(이 균종들은 모두 임상적으로 중요함)와 근접한 상동성을 가진다. 결과적으로, 통상의 PCR은 종종 이와 같은 오염물을 표적 미생물 DNA와 함께 공동 증폭하여 굉장히 빠른 속도로 위양성(false positive)을 나타내고, 이로 인해서 PCR 분석법이 신뢰도가 떨어지게 되어, 임상 적용을 막게 된다.

지난 20년 동안 이와 같은 문제점을 해결하기 위한 시도들이 다수 행하여진 바 있다. 이에 관한 몇몇 예로서는 UV 조사법, 제한 엔도뉴클레아제 분해법, 한외 여과법, 그리고 시약들을 DNaseI로 전처리하는 방법(참고 문헌 20 내지 참고 문헌 23)을 포함한다. 불행하게도, 이전의 모든 시도들은 반응 조건에 대한 고유한 한계들로 인하여 위양성을 완전히 없애는데 실패하였거나, PCR 반응에 수반되는 억제로 인해 감수성을 필요한 수준으로 얻어낼 수 없었다. 결과적으로, 광범위 PCR은 임상적으로 적절치 못하여, 대부분의 연구자들이 복합 PCR, 또는 비용이 많이 들고, 최적화가 어려우며, 실시가 까다로운 기타 비 PCR 방법을 계속하도록 만드는 것으로 일반적으로 여겨진다.

그러므로, 미생물의 임상학적 검출을 위한 PCR을 활용함에 있어서의 난제들을 극복할 미충족된 필요성이 여전히 존재한다.

상기한 바에 비추어 볼 때 본 발명의 목적은 샘플 중 미생물을 검출하기 위한 PCR 기반 방법으로서 감수성이 뛰어나고 정확하며 비용이 적게 들고 용이하게 실시할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PCR 기반 분자 진단법이, 특히 중요한 치료 환경에서 임상학적으로 실행될 수 있도록 만드는 시약과 진단용 키트를 제공하는 것이다.

임상학적 표본과 기타 생물학적 샘플 중 미생물을 검출하기 위한 PCR 기반 진단 분석법을 수행하기 위한 시스템을 제공하는 것이 본 발명의 추가 목적이다.

전술된 본 발명의 목적들은 PCR 시약에 있어서 내부 오염이라는 고질적인 문제를 극복하는 신규의 기법(본원에서는 PE-PCR이라고 칭하여짐)을 통해 충족된다.

간단히 말해서, PE-PCR 기법은 내부 오염이라는 문제를 해결하기 위한 이전의 모든 노력들이 오염 물질들을 제거 또는 파괴하고자 함으로써 상기 문제에 정면으로 접근하였음을 인식한 것이다. 거의 20년 동안 상기한 바와 같은 정공 접근법은 매우 미약한 성공만을 거두었다. PE-PCR에 있어서, 본 발명의 발명자들은 통상적인 생각을 버리고, 내부 오염에 관한 문제를 기발하게 피해 나가는 간접적 접근법을 고안하였다. 특히 PE-PCR 기법에서는 임의의 PCR 시약이 반응 혼합물에 첨가되기 전에 표적 주형의 5' 말단에 비 박테리아 서열을 부가하기 위한 DNA 융합 프로브가 사용된다. 이러한 방법에서 표적 주형은 자체의 5' 말단 비 박테리아 서열에 의해 오염 서열과 구별된다. 비 박테리아 태깅 서열(tagging sequence)에 상보성인 프라이머의 도움을 받을 경우, 태깅된 주형들은 표준적인 PCR에 의해 선택적으로 증폭될 수 있다. 비 박테리아 융합 프라이머(융합 프로브라고도 함)는 오로지 5' 말단이 태깅된 주형만을 증폭할 것이므로, 이와 같은 프라이머는 박테리아 유래 오염 물질을 무력하게 만든다.

그러므로, 본 발명의 제1 양태는 샘플 중 표적 미생물 DNA 1개 이상을 선택적으로 증폭하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이와 같은 양태에 따른 방법은 비 박테리아 서열을 가지는 5' 말단부와, 표적 미생물 DNA의 일부에 상보성인 서열을 가지는 3' 말단부로 이루어진 DNA 융합 프로브(들) 1개 이상을 이용할 것이다. 상기 방법은 일반적으로 융합 프로브(들)를 샘플 중 표적 미생물 DNA에 혼성화하는 단계; 표적 미생물 DNA의 미결합 3' 말단부 및 비혼성화 융합 프로브(들)를 제거하는 단계; 표적 미생물 DNA와 융합 프로브의 3' 말단을 연장하여 이중 가닥의 프라이머 연장된 주형을 형성하는 단계; 그리고 융합 프로브의 비 박테리아 서열에 상보성인 비 박테리아 서열을 가지는 프라이머 1개 이상을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 프라이머 연장된 주형을 선택적으로 증폭하는 PCR 방법을 수행하는 단계를 포함할 것이다.

본 발명의 제2 양태는 피험체 내 미생물 감염을 검출하는 방법에 관한 것이다. 이와 같은 본 발명의 양태에 따른 방법은 또한 전술한 바와 같은 DNA 프로브를 다수개 필요로 할 것이다. 이와 같은 방법은 일반적으로 피험체로부터 취하여진 샘플에 융합 프로브를 첨가하는 단계; 상기 융합 프로브를 샘플 중 미생물 DNA에 혼성화하는 단계; 미생물 DNA의 임의의 미결합 3' 말단부 및 비 혼성화 융합 프로브를 제거하는 단계; 미생물 DNA와 융합 프로브의 3' 말단을 연장하여 이중 가닥의 프라이머 연장된 주형을 형성하는 단계; 융합 프로브의 비 박테리아 서열에 상보성인 비 박테리아 서열을 가지는 정방향 프라이머(forward primer) 1개 이상을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 PCR 방법을 수행함으로써 프라이머 연장된 주형을 증폭하는 단계; 그리고 증폭된 PCR 생성물을 분석하여 미생물의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함할 것이다.

본 발명의 제3 양태는 PCR 방법에 의한 선택적 증폭을 위해서 샘플 중 표적 미생물 DNA로부터 프라이머 연장된 DNA 주형을 생성하기 위한 융합 프로브에 관한 것이다. 이와 같은 본 발명의 양태에 따른 융합 프로브는 일반적으로 표적 미생물 샘플의 일부와 상보성인 서열을 가지는 3' 말단부와 비 박테리아 서열을 가지는 5' 말단부로 이루어져 있다.

본 발명의 제4 양태는 선택적인 PCR 증폭 및 검출을 위해서 표적 미생물 DNA로부터 프라이머 연장된 DNA 주형을 생성하기 위한 키트에 관한 것이다. 이와 같은 본 발명의 양태에 따른 키트는 일반적으로 전술한 바와 같은 융합 프로브 다수개와; 3' →5' 엑소뉴클레아제 및 클레나우(Klenow) 중합 효소의 혼합물(사용하기 간편하게 포장된 것)을 포함할 것이다.

본 발명의 제5 양태는 샘플 중 표적 미생물을 검출하기 위한 시스템에 관한 것이다. 이와 같은 본 발명의 양태에 따른 시스템은 일반적으로 샘플을 수용하기 위한 샘플 수용 유닛(sample receiving unit); 샘플에 시약을 첨가하고 반응 조건을 유지하기 위한 샘플 처리 유닛(sample processing unit); 그리고 처리된 샘플을 분석하기 위한 샘플 분석 유닛(sample analyzing unit)을 포함한다. 상기 샘플 처리 유닛은 다수개의 융합 프로브들을 샘플에 첨가하는 단계와, 상기 융합 프로브들이 샘플 중 미생물 DNA와 혼성화하도록 만드는 조건을 유지하는 단계; 분해/연장 시약을 첨가하여, 혼성화된 표적 미생물 DNA의 미결합 3' 말단부 및 비 혼성화 융합 프로브를 제거하고, 표적 미생물 DNA 및 혼성화된 융합 프로브들의 3' 말단을 3' →5' 방향으로 연장하여 이중 가닥의 프라이머 연장된 주형을 생성하는 단계; PCR 시약을 첨가하고 반응 조건을 유지하여 프라이머 연장된 주형들을 증폭시키는 단계; 그리고 처리된 샘플을 분석용 분석 유닛으로 보내는 단계를 수행하도록 자동화 및 배치되는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태들과 이점들은 이하 상세한 설명과 첨부된 특허 청구의 범위로부터 명백할 것이다.

도 1은 본 발명의 구체예들에 따른 PE-PCR 방법의 개략도를 나타낸다.
도 2는 시판중인 중합 효소들이 박테리아 DNA의 감수성 및 특이적 광범위 증폭에 사용되기에 충분히 순수하지 못함을 나타내는 겔 전기 영동 이미지를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 구체예들에 따른 PE-PCR 방법이 오염 박테리아 DNA를 함께 증폭시키지 않으면서 표적 박테리아 DNA를 특이적으로 증폭시킬 수 있음을 보여주는 겔 전기 영동 이미지를 나타낸다. (A) 소정량의 에스.아우레우스(S. aureus) 게놈 DNA를 대상으로 하여 PE-PCR을 수행한 결과(이 경우, 융합 프로브 M13-TstaG422 및 프라이머 세트 M13 및 TstaG765 사용). (B) 에스. 아우레우스 게놈 DNA(100fg)를 대상으로 PE-PCR을 수행한 결과(상부 패널)[패널 A와 같은 조건(레인 1), M13 프라이머 부재시(레인 2), 그리고 100fg 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 EK 혼합물에 첨가하거나(레인 3) PCR 혼합물에 첨가하여(레인 4) 조성한 인공 오염 조건]. PE-PCR은 또한 주형 DNA의 부재 하에서도 수행되었다(레인 5). 에스. 아우레우스 게놈 DNA의 존재는 종 특이적 PCR(에스.아우레우스에 특이적인 염색체 DNA 단편을 증폭함(하부 패널))에 의해 확인되었다. (C) 소정량의 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 광범위 PE-PCR용 주형으로서 사용하였을 때의 결과(융합 프로브 M13-16S-p201F 및 프라이머 세트 M13 및 p1370 사용). (D) 에스. 아우레우스 게놈 DNA(100fg)를 대상으로 광범위 PE-PCR을 수행한 결과(상부 패널)(패널 C와 같은 조건(레인 1), 100fg 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 EK 혼합물에 첨가하거나(레인 2) PCR 혼합물에 첨가하여(레인 3) 조성한 인공 오염 조건). 광범위 PE-PCR은 또한 주형 DNA의 부재 하에서도 수행되었다(레인 4). 에스. 아우레우스 게놈 DNA의 존재는 종 특이적 PCR(에스.아우레우스의 염색체 DNA 단편을 증폭함(하부 패널))에 의해 확인되었다. NTC는 주형 대조군이 존재하지 않음을 나타낸다.
도 4는 PCR 시약들을 DNase I로 전처리한 후 주형 박테리아 DNA를 대상으로 수행된 광범위 실시간 PE-PCR 증폭법 및 광범위 실시간 PCR 증폭법을 비교한 결과를 나타낸다. (A) 소정량의 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 대상으로 광범위 실시간 PE-PCR을 수행한 결과(LC그린 I 플러스 HRM 염료의 존재하에 융합 프로브 M13-16S-p201F 및 프라이머 세트 M13 및 p1370 사용). (C) 대안적으로, DNase I(1U 및 2.5U)으로 전처리하였거나 전처리 하지 않은 PCR 반응 혼합물을 실시간 PCR용으로 사용하여, 소정량의 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 증폭하였다. PCR 생성물들을 대상으로 HRMA를 수행하였다(HR-1 기기 사용). 증폭 결과(좌측 컬럼의 그래프 전부) 및 미분 플롯(우측 컬럼의 그래프 전부)를 보였다. NTC는 주형 대조군이 존재하지 않음을 나타낸다.
도 5는 12개의 상이한 박테리아 종에 대한 광범위 실시간 PE-PCR 및 HRMA에 대한 변성 곡선 플롯을 나타낸다. 12개의 상이한 박테리아 종으로부터 유래하는 게놈 DNA 소정량을 대상으로 광범위 실시간 PE-PCR을 수행하였다(이 경우, LC그린 I 플러스의 존재 하에 융합 프로브 M13-16S-p201F 및 프라이머 세트 M13 및 p1370을 사용함). PCR 생성물을 대상으로 HRMA를 수행하였으며(HR-1 기기 사용), 미분 플롯을 보였다. NTC는 주형 대조군이 존재하지 않음을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 구체예들에 따른 시스템의 개략도를 나타낸다.

이하 본 발명은 첨부된 도면들에 도시된 특정 구체예들을 참고로 하여 상세히 기술될 것이다. 본 발명은 예시적 특정 구체예들과 실시예들의 관점에서 기술될 것이지만, 본원에 개시된 구체예들은 오로지 예시를 위한 것으로서 본원에 첨부된 청구항들의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 당업자에 의해 다수의 변형 및 변경이 가하여질 수 있음이 이해될 것이다.

정의

달리 지정되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어들은 이하에 제시된 의미들을 가지며, 일반적으로는 본 발명의 당업자들에 의해 사용되는 용어들과 동일한 의미를 가진다. 실무자들은 특히 업계에서 사용되는 용어와 이러한 용어의 정의에 관하여 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. and Ausubel F M et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.]을 참고할 수 있을 것이다. 본 발명은 기술된 특정 방법, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않고, 이와 같은 것들에 변화가 가하여질 수 있음이 이해될 것이다.

본원에 인용된 모든 공보는 명백히 본 발명과 연관되어 사용될 수 있는 방법 및 조성물을 예시 및 개시할 목적으로 본원에 참조로 포함되어 있다.

본원에 사용된 "유전자"란 용어는, 폴리펩티드, 전구체 또는 RNA(예를 들어 rRNA, tRNA)를 생산하는데 필요한 암호화 서열을 포함하는 핵산(예를 들어 DNA) 서열을 말한다. 폴리펩티드는 그것이 전장 또는 단편의 원하는 활성이나 기능성(예를 들어 효소 활성, 리간드 결합, 신호 전달, 면역원성 등)을 가지는 한, 전장 암호화 서열 또는 암호화 서열의 임의의 부분에 의해 암호화될 수 있다. 상기 용어는 또한 어느 한쪽 말단 상에서 약 1kb 이상의 거리로 5' 및 3' 말단 둘다의 암호화 영역에 인접하여 위치하는 서열 및 구조적 유전자의 암호화 영역을 포함하기도 하므로, 상기 유전자는 전장 mRNA의 길이에 상응한다. 암호화 영역의 5'에 위치하고 mRNA에 존재하는 서열들은 5' 비 번역 서열이라고 칭하여 진다. 암호화 영역의 하류 또는 3'에 위치하고 mRNA에 존재하는 서열들은 3' 비번역 서열이라고 칭하여진다. "유전자"란 용어는 유전자의 게놈형과 cDNA 둘다를 포함한다. 유전자의 게놈형 또는 클론은 "인트론" 또는 "개입 영역" 또는 "개입 서열"이라고 칭하여지는 비 암호화 서열들이 삽입되어 있는 암호화 영역을 포함한다. 인트론은 핵 RNA(hnRNA)로 전사되는 유전자 분절이며; 인트론은 조절 요소, 예를 들어 인핸서(enhancer)를 포함할 수 있다. 상기 인트론은 핵내 전사체 또는 1차 전사체로부터 제거되거나 "스플라이싱"되므로; 상기 인트론은 메신저 RNA(mRNA) 전사체에는 존재하지 않는다. 번역시 mRNA의 역할은 초기 폴리펩티드 내 아미노산의 순서 또는 아미노산 서열을 특정하는 것이다.

본원에 사용된 "프로브 및/또는 프라이머"는 RNA 또는 DNA일 수 있다. DNA는 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 일반적으로는 합성 올리고뉴클레오티드이지만, 클로닝된 cDNA 또는 게놈 서열 또는 이것의 상보체로부터 생성될 수 있다. 분석용 프로브는 일반적으로 그 길이가 20개 뉴클레오티드 이상이지만, 이보다 약간 짧은 프로브(14개 내지 17개 뉴클레오티드)가 사용될 수도 있다. PCR 프라이머는 그 길이가 5 뉴클레오티드 이상, 바람직하게는 15개 뉴클레오티드 이상, 더욱 바람작하게는 20개 내지 30개 뉴클레오티드이다. 짧은 폴리뉴클레오티드는 유전자의 작은 영역이 분석용으로 표적화될 때 사용될 수 있다. 유전자 육안 분석용인 폴리뉴클레오티드 프로브는 온전한 엑손(entire exon) 1개 이상을 포함할 수 있다. 프로브는 검출 가능한 신호를 제공하기 위해서 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여, 예를 들어 효소, 바이오틴, 방사성 핵종, 형광단, 화학 발광 물질, 상자성 입자 등(이것들은 다수의 공급처, 예를 들어 몰리큘라 프로브스 인코포레이션(Molecular Probes, Inc.), 유진, 오레그( Eugene, Oreg.) 및 애머샴 코포레이션(Amersham Corp.), 알링톤 하이츠 Ill(Arlington Heights, Ill.)로부터 시판되고 있음)으로 표지화될 수 있다.

모노뉴클레오티드들은 서로 반응하여 하나의 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 5' 포스페이트가 이것과 이웃하는 펜토스 고리의 3' 산소에 포스포디에스테르 결합을 통해 한 방향으로 부착되는 방식으로 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 형성하므로, DNA 분자는 "5' 말단들"과 "3' 말단들"을 가진다고 한다. 그러므로, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 말단은, 만일 이 말단의 5'포스페이트가 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 3' 산소에 결합되지 않은 상태라면 "5' 말단"이라고 칭하여지고, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 말단의 3' 산소가 후속 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 5' 포스페이트와 결합되지 않은 상태라면 "3' 말단"이라고 칭하여진다. 본원에 사용된 핵산 서열은 또한 크기가 큰 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내부에 존재할지라도 5' 말단 및 3' 말단을 가진다고 할 수 있다. 선형 또는 환형 DNA 분자에 있어서, 개별 요소들은 "하류" 또는 3' 요소의 "상류" 또는 5' 요소라 칭하여진다. 이러한 용어의 정의는 전사가 DNA 가닥을 따라서 5'에서 3' 방향으로 진행된다는 사실을 반영한다.

본원에 사용된 "상보성인" 또는 "상보성"이란 용어는 염기 쌍형성 규칙에 따라서 관련되어 있는 폴리뉴클레오티드들(즉 뉴클레오티드들의 서열)을 일컫는데 사용된다. 예를 들어 서열 "A-G-T" 서열은 서열 "T-C-A"에 상보성이다. 상보성은 "부분적"일 수 있는데, 이는 오로지 핵산의 염기들 중 일부만이 염기 쌍형성 규칙에 따라서 매칭될 수 있다는 의미이다. 또는 핵산들 간에는 "완전한" 또는 "전체적인" 상보성이 존재할 수 있다. 핵산 가닥들간 상보성의 정도는 핵산 가닥들간 혼성화 효율 및 세기에 상당한 영향을 미친다. 이는 증폭 반응뿐만 아니라, 핵산들 간 결합에 의존하는 검출 방법에 있어서도 특히 중요하다.

본원에 사용된 "혼성화"란 용어는 상보성 핵산들의 쌍형성을 일컫는데 사용된다. 혼성화와 혼성화 세기(즉 핵산들 간 결합의 세기)는 핵산들간 상보성 정도, 관련 조건들의 엄중도, 형성된 혼성체의 T_m, 그리고 핵산 내 G:C 비율과 같은 인자들에 의해 영향을 받는다. 분자 구조 내 상보성 핵산들이 쌍을 형성하고 있는 단일 분자는 "자가 혼성화된(self-hybridized)" 분자라고 칭하여진다.

"증폭"은 주형 특이성과 관련된 핵산 복제의 특별한 경우이다. 비 특이적 주형 복제(즉 주형 의존성이되 특이적 주형에 의존적이지는 않은 복제)와는 대조적일 것이다. 본원에서 주형 특이성은 복제(즉 적당한 폴리뉴클레오티드 서열의 합성)의 신뢰성 및 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드) 특이성과 구별된다. 주형 특이성은 종종 "표적" 특이성의 관점에서 기술된다. 표적 서열들은, 이것들이 다른 핵산과 구분되어야 한다는 의미에서 "표적"인 것이다. 증폭 기술은 주로 이와 같은 구분을 위해서 디자인되어 오고 있다.

본원에 사용된 "중합 효소 연쇄 반응" ("PCR")이란 용어는, 클로닝이나 정제 과정을 거치지 않고 게놈 DNA 혼합물 중 표적 서열 분절의 농도를 증가시키는 방법에 대해 기술되어 있는 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호(K.B.Mullis)(본원에 참조로 포함되어 있음)의 방법을 말한다. 이와 같은 표적 서열을 증폭시키는 방법은 과량의 올리고뉴클레오티드 프라이머 2개를, 원하는 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물에 도입한 다음, DNA 중합 효소의 존재 하에 고온 사이믈을 특정 횟수만큼 수행하는 것으로 이루어져 있다. 상기 2개의 프라이머들은 이중 가닥 표적 서열을 이루는 각각의 가닥에 대해 각각 상보성이다. 증폭이 진행되기 위해서 혼합물은 변성되고, 이후 프라이머는 표적 분자 내 이 프라이머와 상보성인 서열들에 어닐링된다. 어닐링이 이루어진 후 프라이머는 중합 효소로 연장되고, 그 결과, 상보성 가닥들의 새로운 쌍이 생성된다. 변성, 프라이머 어닐링 및 중합 효소 연장 단계는 다수 회 반복될 수 있으며(즉 변성, 어닐링 및 연장은 하나의 "사이클"을 구성하므로; 다수의 "사이클"이 진행될 수 있으며), 그 결과, 원하는 표적 서열의 증폭된 분절이 다량으로 얻어질 수 있다. 원하는 표적 서열의 증폭된 분절의 길이는 각각에 대한 프라이머들의 상대적 위치들에 의해 결정되므로, 이와 같은 길이는 제어 가능한 매개 변수이다. 이와 같은 과정의 양태가 반복 실시되므로, 상기 방법은 "중합 효소 연쇄 반응" (이하 "PCR"이라 함)이라 칭하여 진다. 표적 서열의 원하는 증폭 분절은 혼합물 중 (농도의 관점에서) 우점하는 서열이 되므로, 이 분절은 "PCR 증폭된" 것이라고 칭하여진다.

본원에 사용된 "실시간 PCR"이란 용어는, PCR 분석법으로부터 방출된 신호가, 통상의 PCR 방법(즉 분석 신호가 PCR 반응의 종료 시점에 검출되는 방법)과는 대조적으로, 각각의 PCR 증폭 사이클이 진행되는 중에(즉 "실시간"으로) 앰플리콘 생산 여부에 대한 지표로서 반응 내내 모니터링되는 방법을 의미한다. 실시간 PCR은 일반적으로 형광 리포터의 검출 및 정량을 바탕으로 한다. 신호는 반응중 PCR 생성물의 양에 정비례하여 증가한다. 각각의 사이클에 있어서의 형광 방사량을 기록함으로써 지수기(즉 PCR 생성물의 양이 처음으로 급증하는 것이 표적 주형의 초기량과 상관되어 있는 시기)가 진행되는 동안의 PCR 반응이 모니터링될 수 있다. "실시간 PCR"에 관한 일반적인 설명에 관하여는 문헌[Dehee et al. J. Virol. Meth. 102:37-51 (2002); and Aldea et al. J. Clin. Microbiol. 40: 1060-1062 (2002) (실시간 동력학적 정량법으로서 PCR의 지수 선형 기 동안 측정이 진행될 수 있는 경우 "라이트사이클러(LightCycler)"를 사용하는 것에 대해 언급)]을 참조한다.

PCR이 수행될 경우 게놈 DNA 내 특이적 표적 서열의 단일 복사체는 몇 가지 상이한 방법(예를 들어 표지화된 프로브를 사용하는 혼성화 방법; 바이오틴화된 프라이머를 혼입한 후 아비딘 효소 접합체를 검출하는 방법; ³²P 표지화된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 예를 들어 dCTP 또는 dATP를 증폭된 분절에 혼입하는 방법)에 의해 검출 가능한 수준으로 증폭될 수 있다. 게놈 DNA 이외에 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 적당한 프라이머 분자 세트로 증폭될 수 있다. 특히 증폭된 분절들로서 PCR 방법에 의해 생성된 것들은 그 자체로서 후속 PCR 증폭용으로 효율적인 주형이다.

본원에 사용된 "PCR 생성물", "PCR 단편" 및 "증폭 생성물"이란 용어는, 변성, 어닐링 및 연장과 같은 PCR 단계들이 2사이클 이상 종료된 후 그 결과로 생성된 화합물들의 혼합물을 말한다. 이와 같은 용어들은 표적 서열들 1개 이상의 분절들 1개 이상이 증폭된 경우를 포함한다.

본원에 사용된 "샘플"이란 용어는 최광의로 사용된다. 한 가지 의미에서, "샘플"은 임의의 공급원과 생물학적 샘플 및 환경 샘플로부터 얻어진 표본 또는 배양액을 포함하는 의미이다. 생물학적 샘플은 동물(사람 포함)로부터 얻어질 수 있으며, 유체, 고체, 조직 및 기체를 포함한다. 생물학적 샘플들은 혈액 생성물, 예를 들어 혈장 및 혈청등을 포함한다. 환경 샘플로서는 환경 물질, 예를 들어 표면재, 토양, 물, 결정 및 산업용 샘플을 포함한다. 그러나, 이와 같은 예들은 본 발명에서 사용될 수 있는 샘플 유형들을 제한하는 것으로서 해석되지는 않는다.

PE - PCR 기법에 관한 일반적 설명

도 1은 예시적 PE-PCR 실험이 어떻게 실시되는지를 개략적으로 도시한 것이다. 단계 1a를 시작으로 해서, 표적 DNA 주형들, 예를 들어 미생물의 게놈 DNA를 함유하는 샘플 분석물은 과량의 융합 프로브들과 혼합된다. 각각의 융합 프로브는 비 박테리아 서열을 가지는 5' 말단부와, 표적 DNA 주형상 특정 위치에 상보성인 서열을 가지는 3' 말단부로 이루어져 있다(5' 말단부→3' 말단부의 순서로 이루어짐).

단계 1b에 있어서, 샘플 혼합물이 가열되면 DNA 주형이 변성되고, 그 결과, 융합 프로브는 표적 DNA 주형에 혼성화될 수 있다(단계 2a).

일단 융합 프로브들이 이 자체들의 대상 표적들에 혼성화되면, 3' 말단 엑소뉴클레아제 및 클레나우 DNA 중합 효소의 혼합물(EK 혼합물)이 샘플에 첨가된다(단계 2b). 단계 2a에 나타낸 바와 같이, 만일 혼성화 위치가 정확히 주형의 3' 말단에 존재하지 않으면 융합 프로브의 비 박테리아 부분은 주형과 결합하지 않을 것이므로, 풀어진 말단이 생성될 것이다.

단계 3a에 있어서, 표적 DNA의 3' 말단(풀어진 말단)의 비 결합부는 과량의 미결합 융합 프로브와 함께 3' 말단 엔도뉴클레아제에 의해 분해되어 떨어져 나간다. 엑소뉴클레아제 분해가 이루어진 후에는 융합 프로브 가닥 상에 5' 돌출부(overhang)가 형성된다.

단계 3b에 있어서, 클레나우 DNA 중합 효소는 융합 프로브 가닥과 주형 가닥 둘다를 5' →3' 방향으로 연장할 것이며, 그 결과, 끝이 편평한(blunt) 말단을 가지는 이중 가닥 주형이 생성될 것이다. 융합 프로브로부터 연장된 가닥은 이 가닥의 5' 말단에 위치하는 비 박테리아 태깅 서열을 가질 것인 반면에, 표적 DNA 주형으로부터 연장된 가닥은 이 가닥의 3' 말단에 위치하는 비 박테리아 태깅 서열을 가질 것이다. 이와 같은 프라이머 연장 단계는 EK 혼합물의 열 불활성화에 의해 종결될 수 있다.

이 단계에서의 주형은 특유의 서열들로 태깅되어 있으므로, PCR에 의해 증폭될 준비가 된 것이라 할 수 있다. 오로지 태깅된 주형들만이 증폭되었는지를 확인하기 위해서, 단계 4에서 PCR을 진행시키는데 사용되는 프라이머 세트는 1개 이상의 정방향 프라이머(도 1에서 non-bac-F로 표시)(비 박테리아 태깅 서열에 상보성임)와 역방향 프라이머(도 1에서 bac-R로 표시)(융합 프로브의 표적 DNA 주형 하류상에 존재하는 서열에 상보성임)를 포함하여야 한다.

상기에 개략적으로 기술된 PE-PCR 기법은 간단한 기법으로서, 기타 시약 전처리를 수행할 필요 없이 하나의 반응 용기 내에서 수행될 수 있다. 상기 기법은 내부 박테리아 DNA 오염이라는 고질적인 문제를 해결해 주고, 현존하는 PCR 프로토콜과 양립할 수 있는, 당장 사용 가능한(turnkey) 해결책을 제공한다. 이와 같은 기법을 바탕으로 하여 본 발명의 발명자들은 다양한 방법, 시스템, 조성물 및 키트를 고안하였다. 당업자들은 PE-PCR 기법이 임의의 분석 방법들과 함께 사용되어, PCR 생성물을 추가로 정량하거나 특성 규명하는 것이 유리할 수 있음을 이해할 것이다. 이와 같은 기법의 예시적 용도들 중 일부로서는 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염을 조기에 검출하기 위하여 임상 표본을 분자 수준에서 진단하는 것을 포함할 수 있다. 기타 용도로서는 법의학적 용도, 생물 무기 검출 또는 고고학적 샘플 정량을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

융합 프로브

일반적으로 본 발명의 구체예들에 따른 융합 프로브는 바람직하게는 정방향 프라이머이다. 상기 융합 프로브는 2개의 구성 성분들을 가질 것인데, 이것들 중 하나는 비 박테리아 서열을 암호화하는 것이고, 또 다른 하나는 표적 DNA의 일부에 상보성인 서열을 암호화하는 것이다. 비 박테리아 서열은 PCR 시약들 중 내부 박테리아 오염 물질과 구별시키는 태깅 서열로서 사용된다. 상보성 서열은 혼성화 조건 하에서 융합 프로브를 표적 DNA에 결합시키는 표적 서열로 사용된다.

유효한 융합 프로브를 디자인하기 위한 규칙은 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 융합 프로브는 비 박테리아 DNA 서열(5' 말단) 및 미생물 표적 서열에 상보성인 서열로 이루어져 있다. PCR 증폭이 진행되는 중 사람의 게놈 DNA가 존재할 수 있으므로, 5' 말단 비 박테리아 DNA 서열은 사람의 게놈 DNA 서열에 상보성이지 않는 것이 바람직하다. 기타 종으로부터 유래하는 샘플 중 박테리아 DNA를 검출하는 것과 관련된 용도에도 유사한 기법이 적용된다. 3' 말단 박테리아 DNA 서열은 미생물 DNA에 보편적으로 존재하는 표적 유전자 서열에 상보성이다. 3' 박테리아 서열의 T_m은 37℃ 이상 및 95℃ 이하이다. 프라이머 디자인(예를 들어 비 헤어핀형 서열)에 관한 일반적인 규칙은 서열 선별에 적용된다.

태깅 서열은 비 박테리아 공급원으로부터 유래된 서열일 수 있거나, 또는 인공적으로 디자인된 서열일 수도 있다. 몇몇 바람직한 구체예에서, 태깅 서열은 바이러스 서열, 바람직하게는 M13 파지로부터 유래하는 서열이다.

표적화 서열은 융합 프로브를 특이적인 표적 주형이나 보존된 서열(즉 광범위한 미생물 DNA에 융합 프로브를 결합시키는 서열)에 결합시키는 독특한 서열일 수 있다. 몇몇 예시적인 구체예에서, 표적화 서열은 바람직하게 16S rRNA 유전자로부터 유래하는 보존된 서열이다.

융합 프로브는 당업계에 일반적으로 알려진 임의의 방법, 예를 들어 화학적 합성법(이에 한정되는 것은 아님)에 의해 제조될 수 있다.

검출 방법

샘플 중 낮은 존재비로 존재하는 미생물 DNA는 검출 방법 및 기기의 한계로 인해 검출이 어렵다. 샘플 중 낮은 존재비로 존재하는 DNA를 검출하기 위해서 표준 PCR을 실시하는 것은 일반적으로 노이즈 백그라운드 장(sea of noisy background)에 대하여 표적 DNA 주형을 선택적으로 증폭하는 것을 포함한다. 표적 DNA 주형이 충분히 다량으로 복제되면 상기 주형은 용이하게 검출될 수 있다. 전술된 바와 같은 융합 프로브는 백그라운드 노이즈와 원치 않는 오염으로부터 표적 DNA를 효과적으로 구별하는 수단을 제공하고, 이로써 표적 DNA는 선택적으로 증폭될 수 있다. 일단 증폭이 이루어지면 다수의 분석 도구들은 증폭된 핵산 생성물을 특성 규명하기 위해 사용될 수 있다.

그러므로, 본 발명의 구체예들에 따라서 피험체 중 미생물 감염을 검출하기 위한 방법은 일반적으로 피험체로부터 취하여진 샘플에 융합 프로브를 첨가하는 단계; 융합 프로브를 샘플 중 미생물 DNA에 혼성화하는 단계; 혼성화되지 않은 융합 프로브 및 미생물 DNA의 임의의 미결합 3' 말단부를 제거하는 단계; 미생물 DNA 및 융합 프로브의 3' 말단을 연장하여 이중 가닥의 프라이머 연장된 주형을 생성하는 단계; 융합 프로브의 비 박테리아 서열에 상보성인 비 박테리아 서열을 가지는 정방향 프라이머 1개 이상을 포함하는 프라이머 세트로 PCR 방법을 수행함으로써 프라이머 연장된 주형들을 증폭하는 단계; 및 증폭된 PCR 생성물을 분석하여 미생물의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함할 것이다.

바람직하게, 샘플은 피험체의 체액, 예를 들어 혈액, 소변, 뇌척수액, 타액 또는 객담 등으로부터 취하여진다. 피험체로부터 취하여진 샘플의 종류는 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 임상 조건(즉 피험체가 발병이 의심된다는 조건)의 유형에 상응할 것이다. 예를 들어 바람직한 구체예에서 샘플은 균혈증이 발병된 것으로 의심되는 피험체로부터 유래하는 혈액 샘플이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 샘플은 박테리아(예를 들어 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae))에 감염된 것으로 의심되는 피험체로부터 유래하는 뇌척수액으로서, 시험관 내에서는 배양되기 어려운 것이다.

샘플을 제조하는 것은 통상적으로 미생물로부터 DNA를 방출시키는데 필요한 과정이다. 미생물 DNA를 방출/추출하는 방법은 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 유리하게는 샘플을 제조하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이와 같은 제조 단계들은 항상 필요한 단계인 것은 아니며, 단계의 필요 여부는 분석법의 용도와 구체적인 목적에 따라서 결정된다.

융합 프로브들을 표적 DNA에 혼성화하는 과정은, 일반적으로 샘플을 우선 표적 DNA에 대한 변성 온도(T_m) 초과로 가열하여 이 프로브들이 단일 가닥 DNA로 변성되도록 만든 다음, 온도를 점차 T_m 미만으로 냉각시켜 결합 및 어닐링이 진행되도록 함으로써 이루어진다. 적당한 혼성화 조건은 또한 당업계에 알려져 있으며, 통상적으로는 당업자들에 의해 결정될 수 있다.

과량의 융합 프로브와 표적 DNA의 3' 말단 미결합부는 3' 엑소뉴클레아제에 의해 제거될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 3' 엑소뉴클레아제는 이.콜라이 엑소 I이다. 기타 3' 엑소뉴클레아제도 적당히 사용될 수 있다.

주형은 5' →3' 중합 효소를 사용하여 연장될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 5' →3' 클레나우 중합 효소가 사용된다.

3' 엑소뉴클레아제 및 3' →5' 중합 효소는 편의를 위하여 단일 혼합물(EK 혼합물)로 제공될 수 있다. 당업자들은 엑소뉴클레아제 및 중합 효소의 최적 비율이 융합 프로브의 디자인뿐만 아니라, 사용된 특정 엑소뉴클레아제 및 중합 효소에 의존적일 것임을 이해할 것이다. 이와 같은 비율은 통상의 최적화 실험에 의해서 결정될 수 있으며, 바람직하게는 임상 조건에서 검출 방법을 실시하기 이전에 적용되어야 할 것이다. 엑소뉴클레아제 및 중합 효소 활성을 없애기 위해서는 급랭제가 첨가될 수 있거나, 아니면 간단히 샘플을 가열하여 효소를 불활성화할 수 있다.

PCR 방법은 시판중인 Taq DNA 중합 효소와 프라이머 세트(융합 프로브의 태깅 서열에 상보성인 서열을 가지는 정방향 프라이머를 1개 이상 포함)를 사용하는 표준 PCR이 바람직하다. 기타 통상적 PCR 프로토콜도 또한 이 프로토콜이 프라이머 연장된 주형과 양립 가능한한 적당히 사용될 수 있다. 이와 같은 통상의 PCR을 수행하는 방법은 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 본 발명의 PE-PCR 기법과 함께 수행되도록 당업자들에 의해 수정될 수 있다. 예를 들어 실시간 PCR은 또한 프라이머 연장된 주형을 증폭함과 동시에 미생물 DNA의 존재비를 정량하는데 사용될 수도 있다.

마지막에 말하기는 하지만 매우 중요하게도, 증폭된 PCR 생성물은 당업계에 알려진 임의의 수의 통상적 분석 방법으로서 상기 증폭된 PCR 생성물의 기원을 특성 규명하고 이를 동정하기 위한 방법에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어 변성 곡선 분석은 증폭된 PCR 생성물을 대상으로 이루어질 수 있으며, 이로써 변성 곡선 프로필이 얻어질 수 있다. 상이한 미생물로부터 유래하는 DNA는 일반적으로 미생물 내 통상적이지 않은 뉴클레오티드 함량으로 인하여 독특한 변성 곡선 프로필을 가질 것이다. 이와 같은 변성 곡선 프로필은 샘플의 기원을 동정하기 위한 일종의 "핑거프린트(fingerprint)"로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 기타 분석 방법들로서는 서열 결정법, 마이크로어레이 분석법, 질량 분광 분석법, 변성 곡선 분석법, 예를 들어 고해상도 변성 분석법, 변형 HPLC, 모세관 전기 영동법, 아가로스 및/또는 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법, 이종 이중체 이동성 분석법(HMA) 및 NMR 분광 분석법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

시스템 및 키트

본 발명에 따라서 PE-PCR 방법을 수행하기 위해서는, 통상적 PCR용 시약 또는 실시간 PCR용 시약 이외에, 과량의 프로브를 제거하고 혼성화된 프로브/주형을 연장하기 위한 융합 프로브 및 시약이 필요하다. 그러므로, 본 발명의 키트는 다수의 예비 제조 융합 프로브 및 변성/연장 시약(예를 들어 EK 혼합물)을 편리한 포장, 예를 들어 바이알이나 카트리지의 형태(이에 한정되는 것은 아님)로 포함할 것이다. 상기 키트는 PCR 증폭을 촉진하기 위한 추가의 시약들 또는 자체의 사용을 지도하는 지침 매뉴얼을 추가로 포함할 수 있다.

고 처리량 분석법의 수행을 도모하기 위해서, 자동화된 시스템도 본 발명의 검출 방법을 수행하도록 구성될 수 있다. 도 6은 본 발명의 예시적인 시스템을 개략적으로 도시한 것을 보여준다.

도 6을 참고하였을 때, 본 발명의 구체예들에 따른 시스템은 분석될 샘플을 수용하는 샘플 수용 유닛(1) 및 샘플에 다양한 시약들을 첨가하고 적당한 반응 조건을 유지하도록 구성된 처리 유닛(2)을 가진다. 예를 들어 미생물 DNA는 샘플 용기(3)로부터 반응 챔버(4 및 5)로 추출될 수 있으며, 여기에서 융합 프로브 및 EK 혼합물은 프라이머 연장된 주형을 생성하도록 첨가될 수 있다. 그 다음, 프라이머 연장된 주형은 PCR 챔버(6) 내에서 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 이후, PCR 반응 챔버는 샘플 분석 유닛(7)에 보내어질 수 있다.

처리 유닛은 다수의 상이한 방식으로 구성될 수 있다. 처리 유닛을 작동하기 위한 예시적인 수단은 일련의 마이크로컴퓨터로 제어되는 액츄에이터들 또는 미세 유체 장치들일 수 있다. 분석 유닛은 또한 적용될 특정 분석 방식에 따라서 임의의 수의 방식으로 작동될 수 있다. 상기 분석 유닛의 예로서는 질량 분광 분석기, DNA 서열 결정 장치, 모세관 전기 영동 장치 또는 변성 온도 분석 장치를 들 수 있다. 바람직하게 본 발명의 시스템은 현존하는 자동화 PCR 시스템, 예를 들어 BD Max™ 시스템(뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))을 개량하여 제조될 수 있다.

비 자동화 시스템은 또한 개별 구매 부품들을 사용하여 조립될 수도 있다. 예를 들어 예시적인 구체예에서, 샘플 처리 과정은 수동으로 수행될 수 있거나, 아니면 별도의 샘플 처리/제조 유닛에서 수행될 수 있다. PCR 반응은 표준적인 열 순환기, 예를 들어 라이트사이클러^®480 시스템(로쉬 다이아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corporation)(인디애나주 인디애나폴리스 소재))을 사용하여 수행될 수 있다. 종 확인 분석법(species identification analysis)은 고해상도 변성 곡선 분석법(라이트사이클러^®32 시스템(유타주 솔트 레이크 시티 소재, 아이다호 테크놀로지스(Idaho Technologies)) 사용)에 의해 수행될 수 있다.

본 발명을 완전히 그리고 완벽하게 이해함에 있어서 독자들의 이해를 돕고자 이하 예시적인 특정 실시예가 제공된다.

실시예

낮은 존재비로 존재하는 박테리아의 PE - PCR 에 의한 광범위 검출

몇몇 "저-DNA" 및 핫스타트 Taq DNA 중합 효소는 상업상 공급처로부터 시판된다. 본 발명의 발명자들은 출발 시점에서 처음에 4개의 시판 저-DNA 또는 핫스타트 Taq DNA 중합 효소를 관찰한 결과, 상기 저-DNA 또는 핫스타트 Taq DNA 중합 효소는 보편적 프라이머 세트 p201-p1370을 사용하는 박테리아 DNA의 광범위 증폭에 적당하지 않음이 입증되었다.

본 발명의 발명자들은 이와 같은 중합 효소를 사용하여 고전적 PCR을 수행하였으며, 그 결과 각각의 스타필로코커스 아우레우스 박테리아 게놈 DNA 100fg(박테리아 게놈 복사체 20개에 해당)를 함유하는 샘플과 "주형을 함유하지 않는 대조군(No Template Control; NTC)"이 증폭되었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상당량의 증폭 DNA 생성물이 NTC 반응에서 발견되었는데, 이로 인하여 상기 생성물은 샘플 반응으로부터 구분될 수 없게 되었다. 이와 같은 결과는, 시판되는 Taq DNA 중합 효소와 PCR 시약은 일반적으로 검출 한도가 펜토그램 수준이어야 하는 임상 환경에서 광범위 박테리아 DNA 검출용으로서 충분히 순수하지 않음을 확인시켜 주는 것이다.

PE-PCR 기법에 대한 "원리의 증명(proof-of-principle)" 수단으로서 일련으로 희석된 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 대상으로 상기 기법에 의한 분석이 수행되었다. 구체적으로, 에스. 아우레우스의 번역 연장 인자 Tu(Tuf) 유전자는 PE-PCR 증폭에 대한 표적으로서 선택되었다. 융합 프로브(M13-TstaG422)는 M13 정방향 프라이머 서열(5' 말단) 및 Tuf 서열(3' 말단)(기탁 번호 AF298796)로 디자인되었다(표 1). M13-TstaG422가 주형 DNA에 어닐링된 후 EK 혼합물이 반응에 첨가되며, 그 결과, 미결합 융합 프로브가 분해되고 프라이머 연장이 개시된다. 이후, 프라이머 연장 생성물을 대상으로 PCR 증폭이 수행된다(Tuf 게놈 서열에 상응하는 하류 프라이머 TstaG765 및 M13 사용). 결과적으로 50fg(샘플 중 에스. 아우레우스 게놈 복사체 10개와 동등)의 박테리아 DNA로 391bp의 단일 PCR 생성물이 생성되었다. 이와는 대조적으로 NTC 대조군에서는 PCR 생성물이 관찰되지 않았다(도 3의 A). 이와 같은 결과는 본 발명의 PE-PCR이, 정확하며 검출 감도를 펜토그램 범위로 낮출 정도로 감수성이라는 것을 말해준다.

PCR 시약과 효소의 박테리아 DNA 오염을 모의하기 위해 에스. 아우레우스 게놈 DNA 100fg를 EK 혼합물과 Taq DNA 중합 효소-PCR 반응 혼합물 각각에 스파이킹(spiking)하였다. 상당량의 PE-PCR 생성물은 오로지 주형 박테리아 DNA가 프라이머 연장 중에 존재하였을 때에만 생성되었다(도 3의 B, 레인 1). NTC 반응에서 PCR 생성물은 생성되지 않았으며(도 3의 B, 레인 5) 또는 M13 프라이머가 존재하지 않는 조건에서 PCR이 수행되었을 때에도 PCR 생성물은 생성되지 않았다(도 3의 B, 레인 2). 주목할만한 점은, PE-PCR이 스파이킹 박테리아 DNA를 공동 증폭시키지 않고서도 주형 박테리아 DNA의 증폭을 가속화하였다는 점이다.

EK 혼합물 또는 PCR 반응 혼합물 중 스파이킹 DNA의 존재(도 3의 B, 레인 3 및 레인 4)는 에스. 아우레우스 종 특이적 PCR에 의해 확인되었다(도 3의 B, 하부 패널). 이와 같은 데이터는, PCR 시약 및 효소 중 오염 박테리아 DNA는 주형 박테리아 DNA의 특이적 증폭을 방해하지 않음을 말해주는 것이며, 또한 본 발명의 PE-PCR 기법에 대한 원리 증명 수단을 제공한다.

박테리아 DNA의 광범위 증폭에 있어서 PE-PCR의 실현 가능성을 입증하기 위해서, 본 발명의 발명자들은 다양한 박테리아 종들간에 고도로 보존된 16S rRNA 유전자의 광범위 PE-PCR용인 보편적 융합 프로브 M13-16S-p201F를 디자인하였다. 일련의 희석된 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 대상으로 광범위 PE-PCR(융합 프로브 M13-16S-p201F, M13 정방향 프라이머, p1370 역방향 프라이머(표 1), 및 어떠한 오염 제거를 위한 전처리도 수행하지 않은 통상적으로 사용되는 핫스타트 Taq DNA 중합 효소(프로테크(Protech)) 사용)이 수행되었다. 237bp의 단일 PCR 생성물이 생성되었으며, 주형 DNA 10fg만큼 적은 양(에스. 아우레우스 게놈 DNA 복사체 2개와 균등)이 PE-PCR에 의해 검출될 수 있었다. NTC 반응에서는 PCR 생성물이 관찰되지 않았다(도 3의 C). 그러므로, 임상학적으로 중요한 다수의 박테리아 종으로부터 유래하는 게놈 DNA가 테스트되었으며, 이 게놈 DNA는 광범위 PE-PCR에 의해 증폭될 수 있음이 확인되었다.

본 발명의 발명자들은 또한 100fg의 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 EK 혼합물과 Taq DNA 중합 효소-PCR 혼합물 각각에 스파이킹하여 박테리아 DNA 오염을 모의하였다. 예상되는 바와 같이, 100fg의 주형 박테리아 DNA의 존재 하에서는 양성 PE-PCR 신호가 발생되었던 반면에(도 3의 D, 레인 1), 인공적 오염 조건 및 NTC 반응에서는 PCR 생성물이 생성되지 않았다(도 3의 D, 레인 2 내지 레인 4). 또한 반응 혼합물 중 스파이킹 DNA의 존재는 에스. 아우레우스 종 특이적 PCR에 의해 입증되었다(도 3의 D, 하부 패널). 이와 같은 데이터는 모두 PCR 시약에 의한 내부 오염이 일어났을 때 조차도 본 발명의 PE-PCR 기법이 박테리아 DNA를 광범위하게 검출할 수 있음을 입증한다. 이는 여태껏 얻을 수 없었던 이점이다.

본 발명의 기법의 검출 한계를 연구하기 위해서 상이한 농도(100fg 내지 10fg)의 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 대상으로 광범위 PE-PCR이 행하여졌다. 주형 박테리아 DNA 100fg, 50fg, 25fg 및 10fg에 대한 양성 PCR 신호가 얻어질 수 있는 확률은 각각 100%, 95%, 65% 및 55%였다(n=20). 그러므로 광범위 PE-PCR은 검출 한계와 특이성을 방해하지 않고 주형 박테리아 DNA를 특이적으로 증폭하도록 용이하게 수행된다.

변성 곡선 분석과 PE - PCR 을 결합한 특이적 검출법

본 발명의 PE-PCR 기법의 성능을 더욱 강화하기 위해서 본 발명의 발명자들은 프로토콜을 수정하여 실시간 PCR과 HRMA를 전술된 광범위 PE-PCR 검출 방법과 통합하였다. 성능을 입증하기 위하여 일련의 희석된 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 대상으로 HRM 염료 LC그린 I 플러스의 존재 하에 광범위 실시간 PE-PCR을 수행하였다. 증폭 플롯에 의해 밝혀진 바와 같이, 주형 DNA 10fg를 사용하였을 경우에는 앰플리콘 특이적 증폭이 이루어졌고 NTC 반응에서는 PCR 생성물이 생성되지 않았다(도 4의 A 및 도 4의 B). 에스. 아우레우스의 PCR 앰플리콘 중 독특한 뉴클레오티드 함량은 식별력있는 미분 플롯을 구성하였던 반면에, NTC 반응에 대해서는 변성 피크가 관찰되지 않았다. 주형 DNA 100fg, 50fg, 25fg 및 10fg에 대한 양성 PCR 신호를 얻을 수 있는 확률은 각각 100%, 90%, 50% 및 30%였다(n = 10).

비교를 위해서 PCR 시약은 DNase I로 전처리되었으며, 이후, 다시 주형 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 대상으로 광범위 PCR 증폭(프라이머 쌍 p201 및 p1370 사용)이 행하여졌다. 증폭 및 미분 플롯에 의해 밝혀진 바와 같이(도 4의 C), DNaseI이 첨가되면 PCR 증폭이 유의적으로 억제되었다. DNase 농도가 1U일 때, 내부 오염 DNA는 완전히 제거되지 않았다. DNase I의 농도를 2.5U까지 증가시키면 PCR 억제가 추가로 이루어졌고, 이로 인하여 박테리아 DNA의 광범위 PCR 증폭에 대한 검출 한계는 감소하였다.

본 발명의 기법의 효능을 추가로 입증하기 위해서, 본 발명의 발명자들은 광범위 실시간 PE-PCR을 수행하여 추가의 공통 박테리아 종 12개를 분석하였다(표 2). 미분 플롯과 변성 온도를 이용하는 PCR 생성물의 HRMA는 대부분의 박테리아 종들을 용이하게 분별하였다(도 5 및 표 2). 이와 같은 접근법이 사용되었을 때 주형의 서열 결정을 상당히 없앨 수 있어 비용면에서나 편의상 더 많은 이익을 얻을 수 있었다.

재료 및 방법

재료

엑소 I 및 클레나우 DNA 중합 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolab)(메사츄세츠주 입스위치 소재)으로부터 구입되었다. LC그린 I 플러스 시약 세트 및 HR-1 기기는 아이다호 테크놀로지(유타주 솔토 레이크 시티 소재)로부터 구입되었다. 핫스타트 Taq DNA 중합 효소는 프로테크(Protech)(대만 타이페이 소재)로부터 구입되었다. 급속 핫스타트 Taq DNA 중합 효소는 KAPA 바이오시스템스(KAPA Biosystems)(매사츄세츠주 워번 소재)로부터 구입되었다. "저-DNA" Taq DNA 중합 효소는 타카라(Takara)(일본 시가현 소재)로부터 구입되었다. 울트라툴스(ULTRATOOLS) Taq DNA 중합 효소는 바이오툴스 인코포레이션(Biotools Inc.)(스페인 마드리드 소재)으로부터 구입되었다. 라이트사이클러 모세관은 로쉬 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)(인디애나주 인디애나폴리스 소재)로부터 구입되었다. DNase I은 프로메가(Promega)(위스콘신 매디슨 소재)로부터 구입되었다. 박테리아 균주는 전술된 바와 같이 임상학적 분리체였다(참고 문헌 11). 프라이머와 융합 프로브 서열에 대한 전체 목록은 표 1에 보였다.

박테리아 게놈 DNA 의 분리

밤새 배양한 박테리아 현탁액(4㎖)은 10,000rpm에서 10분 동안 원심 분리되고, 그 다음 펠릿은 용액 I 완충액(25mM Tris-HCl, pH7.5, 50mM 글루코스, 10 mM EDTA 및 40㎍/㎖ 리소스타핀) 4㎖ 중에 재현탁되었다. 상기 박테리아 현탁액은 37℃에서 2시간 동안 항온 처리되었으며, 20% SDS 280㎕와 프로티나제 K(10㎎/㎖) 40㎕ 및 RNase A(10㎎/㎖)를 함유하는 반응 완충액은 상기 박테리아 현탁액에 첨가되었고, 이 혼합물은 55℃에서 밤새 항온 처리되었다. 페놀/클로로포름 추출후, 상청액은 깨끗한 미세 원심 분리 튜브에 옮겨졌으며, DNA는 에탄올로 침전되었다. 이 침전물을 75% 에탄올로 2회 세정한 후, DNA 펠릿은 물에 재현탁되었으며(정량용), 이후 후속 PCR 분석법이 수행되었다.

PE - PCR

하나의 반응 튜브 내에서 통상의 PE-PCR이 수행되었다. 요약하면, 어닐링 단계에서는 H₂O 8㎕, 융합 프로브(2ng/㎕) 5㎕, 박테리아 게놈 DNA(소정 농도) 5㎕, 그리고 10X PCR 완충액 2㎕를 함유하는 어닐링 혼합물 20㎕가 사용되었다. 상기 반응 혼합물은 5분 동안 95℃로 가열되었으며, 이후 이 반응 혼합물의 온도는 37℃로 유지되었다. 그 다음, EK 혼합물(H₂O 3㎕, 10X PCR 완충액 1㎕, dNTP(2mM) 5㎕, 클레나우 DNA 중합 효소(5U/㎕) 1㎕ 및 엑소 I(20U/㎕) 1㎕ 포함) 11㎕가 상기 어닐링 혼합물에 첨가되었으며, 이 혼합물은 다시 37℃에서 2시간 동안 항온 처리되었다. 80℃에서 20분 동안 열 불활성화가 수행된 후, 반응 혼합물은 50㎕로 만들어졌다(H₂O 14㎕, 10X PCR 완충액 2㎕, 정방향 프라이머 M13(5μM) 1㎕, 역방향 프라이머(5μM) 1㎕ 및 핫스타트 Taq DNA 중합 효소(5U/㎕) 1㎕ 첨가시). PCR 사이클의 조건은 다음과 같았다: 95℃, 10분(1사이클) → 95℃, 15초 및 60℃, 1분(45사이클). 스파이킹 에스. 아우레우스 게놈 DNA를 검출하기 위해서, M13과 역방향 프라이머 대신 SA-F 및 SA-R 프라이머 세트(에스. 아우레우스 게놈 DNA 단편을 특이적으로 증폭함(참고 문헌 43))가 사용되었다(표 1).

실시간 PE-PCR을 위해서, 융합 프로브 결합 및 프라이머의 연장시 반응의 규모는 일정 비율로 축소되었다(8㎕). 이후, 반응 혼합물은 20㎕가 되었으며(H₂O 1.5㎕, 10X 소 혈청 알부민(BSA) 2㎕, 10X LC그린 I 플러스 2㎕, 10X PCR 완충액 0.8㎕, 정방향 프라이머 M13(5μM) 0.4㎕, 역방향 프라이머(5μM) 0.4㎕ 및 핫스타트 Taq DNA 중합 효소(5U/㎕) 0.5㎕ 첨가시), 이후 모세관에 옮겨졌다. 실시간 PCR은 라이트사이클러 1.5 기기를 사용하여 수행되었으며, 사이클 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 10분 동안 1사이클, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분씩 45사이클(전이율(transition rate) = 20℃/s).

고해상도 변성 곡선의 작성 및 분석

증폭 생성물이 담긴 유리 모세관이 HR-1 기기(아이다호 테크놀로지)에 장착된 후, PCR 단편은 0.3℃/s의 비율로 64℃ 내지 69℃에서 변성되었다. 변성 프로필은 HR-1 소프트웨어로 평가되었다[즉 형광도 정규화와 온도를 오버레이하여 0% 내지 20%의 형광도에서의 곡선들을 중첩함].

오염 제거 및 광범위 PCR 증폭을 위한 DNase I 전처리

10X BSA 2㎕, dNTP(2mM) 2㎕, 10X LC그린 I 플러스 2㎕, 10X PCR 완충액 1㎕, 핫스타트 Taq DNA 중합 효소(5U/㎕) 0.5㎕를 함유하는 PCR 시약들이 DNase I(1U 또는 2.5U)과 함께 항온 처리되었다(37℃, 30분). 85℃에서 15분 동안 DNase I을 열 불활성화한 후, 반응 혼합물은 20㎕로 만들어졌다(10X PCR 완충액 1㎕, 정방향 프라이머 p201(5μM) 2㎕, 역방향 프라이머 p1370(5μM) 2㎕ 및 주형 DNA 5㎕ 첨가시). PCR 사이클 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 10분 동안 1사이클, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분씩 45사이클(전이율 = 20℃/s).

예시적 진단 키트

바람직한 분야에서, PE-PCR은 균혈증 또는 패혈증을 테스트하는 임상학적 진단 분석법의 기반으로 사용될 수 있다. 이하 표에는 이와 같은 진단 키트에 포함될 수 있는 시약들이 나열되어 있다.

[표 1]

[표 2]

참고 문헌

이하 참고 문헌들은 각각 본원에 참조로 포함되어 있다.

서열 목록

<110> DYNOCUBE INVESTMENTS, LLC TSENG, Ching-Ping <120> METHODS, SYSTEMS, AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF MICROBIAL DNA BY PCR <130> IPA131200 <150> US 61/487,709 <151> 2011-05-19 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion probe <400> 1 cagggttttc ccagtcacga cggccgtgtt gaacgtggtc aaatcaaagt tgg 53 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer based on M13 sequence <400> 2 cagggttttc ccagtcacga c 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer based on TstaG765 <400> 3 taaccatttc agtaccttct ggtaa 25 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer based on S. aureus fragment <400> 4 aatctttgtc ggtacacgat attcttcacg 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer based on S. aureus fragment <400> 5 cgtaatgaga tttcagtaga taatacaaca 30 <210> 6 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion probe based on M13, 16S p201F <400> 6 cagggttttc ccagtcacga cgaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atg 53 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer based on p1370 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is deoxyinosine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is deoxyinosine <400> 7 agncccgnga acgtattcac 20

Claims

융합 프로브 다수개를 표적 미생물 DNA에 혼성화하는 단계(여기서, 상기 융합 프로브 각각은 비 박테리아 DNA 서열을 가지는 5' 말단부와, 상기 표적 미생물 DNA 일부에 상보성인 서열을 가지는 3' 말단부로 이루어짐);
표적 미생물 DNA의 임의의 미결합 3' 말단부 및 비혼성화 융합 프로브를 제거하는 단계;
표적 미생물 DNA와 융합 프로브의 3' 말단을 연장하여 이중 가닥의 프라이머 연장된 주형을 형성하는 단계; 및
융합 프로브의 비 박테리아 서열에 상보성인 비 박테리아 서열을 가지는 프라이머 1개 이상을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 프라이머 연장된 주형을 선택적으로 증폭하는 PCR 방법을 수행하는 단계
를 포함하는, 샘플 중 표적 미생물 DNA 1개 이상을 선택적으로 증폭하는 방법.
제1항에 있어서, 제거 단계 및 연장 단계는 엑소뉴클레아제 I 및 클레나우 DNA 중합 효소의 혼합물을 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 융합 프로브의 5' 말단부의 비 박테리아 서열은 바이러스 DNA 서열 또는 인공적으로 디자인된 서열로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 융합 프로브의 3' 말단부의 서열은 16S rRNA 유전자 서열의 보존된 부분에 상보성인 방법.
제1항에 있어서, 표적 미생물 DNA는 박테리아, 진균 또는 바이러스의 게놈 DNA로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 PCR 방법은 표준적 PCR 또는 실시간 PCR로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플은 박테리아 DNA 오염에 대해 미처리된 방법.
피험체의 샘플에 다수개의 융합 프로브를 첨가하는 단계(여기서, 상기 융합 프로브 각각은 비 박테리아 DNA 서열을 가지는 5' 말단부와, 상기 표적 미생물 DNA 일부에 상보성인 서열을 가지는 3' 말단부로 이루어짐);
상기 융합 프로브를 샘플 중 미생물 DNA에 혼성화하는 단계;
미생물 DNA의 임의의 미결합 3' 말단부 및 비 혼성화 융합 프로브를 제거하는 단계;
미생물 DNA와 융합 프로브의 3' 말단을 연장하여 이중 가닥의 프라이머 연장된 주형을 형성하는 단계;
융합 프로브의 비 박테리아 서열에 상보성인 비 박테리아 서열을 가지는 정방향 프라이머 1개 이상을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 PCR 방법을 수행함으로써 프라이머 연장된 주형을 증폭하는 단계; 및
증폭된 PCR 생성물을 분석하여 미생물의 존재 또는 부재를 확인하는 단계
를 포함하는, 피험체 내 미생물 감염을 검출하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 샘플은 박테리아 DNA 오염에 대해 미처리된 방법.
제9항에 있어서, 상기 1개 이상의 미생물은 박테리아, 진균 또는 바이러스로부터 선택되는 방법.
제9항에 있어서, 상기 융합 프로브의 5' 말단부의 비 박테리아 서열은 바이러스 서열 또는 인공적으로 디자인된 서열로부터 선택되는 방법.
제9항에 있어서, 상기 융합 프로브의 3' 말단부의 서열은 16S rRNA 유전자 서열의 보존된 부분에 상보성인 방법.
비 박테리아 서열을 가지는 5' 말단부; 및
표적 미생물 샘플의 일부와 상보성인 서열을 가지는 3' 말단부
로 이루어진, PCR 방법에 의한 선택적 증폭을 위해서 샘플 중 표적 미생물 DNA로부터 프라이머 연장된 DNA 주형을 생성하기 위한 융합 프로브.
제13항에 있어서, 상기 비 박테리아 서열은 바이러스 서열인 융합 프로브.
제13항에 있어서, 상기 비 박테리아 서열은 M13 정방향 프라이머 서열인 융합 프로브.
제13항에 있어서, 상기 융합 프로브의 3' 말단부의 서열은 16S rRNA 유전자의 보존된 서열에 상보성인 융합 프로브.
제13항에 의한 융합 프로브 다수개를 포함하는, 선택적인 PCR 증폭 및 검출을 위하여 표적 미생물 DNA로부터 프라이머 연장된 DNA 주형을 생성하기 위한 키트.
제17항에 있어서, 3' →5' 엑소뉴클레아제 및 클레나우 DNA 중합 효소의 혼합물을 추가로 포함하는 키트.
샘플을 수용하기 위한 샘플 수용 유닛(sample receiving unit);
샘플 처리 유닛(sample processing unit); 및
상기 샘플을 분석하기 위한 샘플 분석 유닛(sample analyzing unit)
을 포함하고,
상기 샘플 처리 유닛은,
제13항에 의한 융합 프로브들 다수개를 샘플에 첨가하고, 상기 융합 프로브들이 샘플 중 미생물 DNA와 혼성화하도록 만드는 반응 조건을 유지하는 단계;
분해/연장 시약을 첨가하여, 혼성화된 표적 미생물 DNA의 미결합 3' 말단부 및 비 혼성화 융합 프로브를 제거하고, 표적 미생물 DNA 및 혼성화된 융합 프로브들의 3' 말단을 3' →5' 방향으로 연장하여 이중 가닥의 프라이머 연장된 주형을 생성하는 단계;
PCR 시약을 첨가하고 반응 조건을 유지하여 프라이머 연장된 주형들을 PCR 증폭을 수행하는 단계(여기서, 상기 PCR 시약은 융합 프로브의 비 박테리아 서열에 상보성인 서열을 가지는 프라이머 1개 이상을 포함함); 및
처리된 샘플을 분석용 분석 유닛으로 보내는 단계
를 수행하도록 구성된 컴퓨터 제어 유닛인, 샘플 중 표적 미생물을 검출하기 위한 시스템.
제19항에 있어서, 상기 분석 유닛은 고 해상도 변성 곡선 분석 유닛인 시스템.