CN112877410B

CN112877410B - 一种优化的基于crispr介导的核酸检测系统及其检测方法

Info

Publication number: CN112877410B
Application number: CN202110243673.XA
Authority: CN
Inventors: 费腾; 黎子涵; 赵文畅; 马仕欣
Original assignee: Northeastern University China
Current assignee: Northeastern University China
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2041-03-05
Also published as: CN112877410A

Abstract

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统及其检测方法。其中，优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统中，每20μL体系包括：50nM～100nM CRISPR‑Cas蛋白；50nM～100nM crRNA；200～300nM单链DNA荧光信号报告分子和/或单链RNA荧光信号报告分子；0.2～1M脯氨酸或0.5～1M甜菜碱；CutSmart反应缓冲液；0.1～100ng靶标样品；以及水。本发明提出使用CutSmart反应缓冲液可以使CRISPR‑Cas12a和Cas13a系统稳定、高效地进行检测。本发明发现0.2～1M L‑Proline的添加可以显著提高Cas12a和Cas13a对靶标序列的检测能力，同时0.5～1M Betaine的添加也可以提升Cas13a对靶标序列的检测能力。

Description

一种优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统及其检测方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统及其检测方法。

背景技术

随着生物检测技术的发展，核酸检测技术因其快速、特异、准确、灵敏等优点在诊断领域发挥了越来越重要的作用，被广泛应用于病毒、真菌和细菌的快速检测及鉴定，以及疾病的诊断和肿瘤早筛中。核酸检测主要包括以PCR、等温扩增(主要为RPA和LAMP)、基因芯片和二代高通量测序为基础的多种检测技术。

目前实时定量PCR已成为分子诊断方法的基本技术和黄金标准，然而PCR技术需要反复的热变性，离不开能够精准控温仪器的支撑，同时需要业务能力熟练的专业人员进行操作，极大地限制了其在临床检测中的应用。基因分子检测技术的市场需求不断增加，发展趋势也日益精准化、便携化和一体化，现有的核酸检测技术面临着操作复杂、成本高昂、准确性低、应用场景受限等问题。因此，需要人们开发更为方便的即时检测系统。

近年来，CRISPR-Cas系统逐渐被应用在分子检测领域，其中以Cas12和Cas13系统为核心的分子检测技术的开发最具有代表性，已成为核酸即时检测技术的主要技术分支。Cas12和Cas13系统具有一个相似的特点：在靶标核酸序列存在的情况下，它们会靶向结合特异性DNA或RNA，在激活顺式切割活性的同时会产生一种反式切割活性即非特异性地切割附近的单链DNA或RNA分子，利用这一特点设计出5’端带有荧光基团，3’端带有荧光淬灭基团的单链DNA或RNA信号报告分子。通过荧光信号强度反映靶标核酸序列的含量，检测体系中靶标序列越多，荧光信号值越高。在实际应用中，检测样品中的靶标序列含量很难达到CRISPR检测系统的检测限，通常会在检测前预扩增待检测的靶标序列，为了减少操作的复杂性，利用无需热变性的核酸等温扩增技术来衔接CRISPR检测系统成为了一个常用的选择。2017年，张锋等利用Cas13a蛋白结合RPA等温扩增技术及逆转录技术，开发了一种能够对痕量DNA和RNA进行检测的新方法SHERLOCK。2018年，Jennifer等开发了可以检测核酸的新方法DETECTR，他们将Cas12a蛋白和LAMP等温扩增技术结合，其灵敏度可以实现对aM级样品的检测。无论是SHERLOCK还是DETECTR核酸检测方法，尽管其公布了CRISPR检测体系的反应缓冲液成分，但是不同实验室或机构使用人为配制的反应缓冲液，其检测能力必然存在巨大差异。等温扩增技术虽然反应温度恒定，扩增时间短，但是其对目的核酸序列扩增的特异性并不强。而且CRISPR检测系统的检测灵敏度有待提高，其蛋白活性的长期维持也存在巨大问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是筛选一种易于获得的商业化反应缓冲液使CRISPR-Cas12a/Cas13a检测系统可以被广泛稳定地应用，提供一种通过添加化合物来提升等温扩增技术特异性和CRISPR-Cas12a/Cas13a系统检测能力的核酸检测方法，以解决等温扩增技术特异性差，CRISPR检测系统不稳定以及灵敏度低等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统，所述的核酸检测系统中每20μL体系包括50nM～100nM CRISPR-Cas蛋白、50nM～100nM crRNA、200～300nM单链DNA荧光信号报告分子(ssDNA FQ reporter)和/或单链RNA荧光信号报告分子(ssRNA FQ reporter)、0.2～1M脯氨酸(L-Proline)或0.5～1M甜菜碱(Betaine)、CutSmart反应缓冲液、0.1～100ng靶标样品以及水，其中，CRISPR-Cas蛋白和crRNA的摩尔浓度比例为1：1时检测效果最佳。

在一些可选的实施方案中，所述的CRISPR-Cas蛋白为CRISPR-Cas12a蛋白或者CRISPR-Cas13a蛋白。

进一步地，在一些实施方案中，CRISPR-Cas12a蛋白选自AsCas12a、LbCas12a、Lb4Cas12a、Lb5Cas12a、FnCas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a或BoCas12a。

在一个优选的实施方案中，所述的CRISPR-Cas12a蛋白为AsCas12a(蛋白编码核酸序列参考Addgene Plasmid#123638)，所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统为用于检测靶标样品中DNA靶标核酸序列的AsCas12a的检测系统。优先地，所述的AsCas12a的检测系统中每20μL体系包括50nM AsCas12a蛋白、50nM crRNA、250nM ssDNA FQ reporter、0.2～1M L-Proline、10*CutSmart反应缓冲液、靶标样品以及水。

进一步地，在一些实施方案中，CRISPR-Cas13a蛋白选自LwaCas13a、LbaCas13a、CamCas13a、LbuCas13a、LshCas13a、RcaCas13a、HheCas13a、PprCas13a、LseCas13a、LbmCas13a或LbnCas13a。

在一个优选的实施方案中，所述的CRISPR-Cas13a蛋白为LwaCas13a(蛋白编码核酸序列参考Addgene Plasmid#105815)，所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统为用于检测靶标样品中RNA靶标核酸序列的LwaCas13a检测系统。优选地，所述的LwaCas13a检测系统中每20μL体系中包括100nM LwaCas13a蛋白、100nM crRNA、250nM ssRNA FQreporter、0.2～1M L-Proline或0.5～1M Betaine、10*CutSmart反应缓冲液、靶标样品和水。

在一个优选的实施方案中，其中，所述的水为超纯水(UltraPure水)，通过水使反应体系达到20μL，并且，上述各成分浓度均为体系终浓度。

第二方面，本发明提供了一种优化的基于CRISPR介导的核酸检测方法，其基于上述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统，具体包括以下步骤：

S1：获得CRISPR-Cas蛋白，其中所述的CRISPR-Cas蛋白为用于检测DNA的CRISPR-Cas12a蛋白和/或用于检测RNA的CRISPR-Cas13a蛋白；

S2：确定靶标样品的靶标核酸序列，通过分子克隆及体外转录技术得到纯化的靶标核酸序列；

S3：针对靶标核酸序列设计特异性的crRNA，利用分子克隆及体外转录技术得到纯化的crRNA；

S4：合成单链DNA信号报告分子和/或单链RNA信号报告分子；

S5：基于如上述第一方面所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统，构建反应体系，并对靶标样品进行检测，使用实时定量PCR仪读取荧光信号。

进一步地，所述CRISPR-Cas12a和Cas13a蛋白的制备方法包括：将AsCas12a和LwaCas13a蛋白核酸序列构建到pET-28a原核表达载体中，使用Rosetta2(DE3)pLysS感受态细胞进行转化，利用IPTG进行低温诱导可溶性蛋白表达，通过His标签进行亲和纯化，脱盐和分子筛纯化获得目的蛋白。

进一步地，所述的靶标核酸序列为SARS-CoV-2的S基因(编码表面刺突蛋白，Spikeprotein)和N基因(编码核衣壳蛋白，Nucleocapsid protein)的部分区段，通过PCR和体外转录等技术得到纯化的RNA靶标序列，具体序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

进一步地，所述的特异性crRNA的制备方法包括：针对新型冠状病毒的S基因和N基因，寻找包含CRISPR-Cas12a识别序列(PAM)TTTV的靶向序列，设计20nt长度的crRNA；Cas13a没有明确的识别序列(PFS)限制，设计28nt长度的crRNA。在合成DNA oligo时，在其3’端添加T7启动子的反向互补序列，然后将其与带有T7启动子(T7-F)的DNA oligo进行退火互补配对形成不完全双链DNA，在T7 RNA聚合酶的作用下进行体外转录，经过RNA纯化获得目的crRNA，其具体序列见SEQ ID NO.4-7。

进一步地，所述的单链DNA(ssDNA)和RNA(ssRNA)荧光信号报告分子(FQreporter)分别应用于CRISPR-Cas12a和Cas13a检测系统，在ssDNA/ssRNA FQ reporter的5’端利用6-羧基荧光素(6-FAM)，3’端利用荧光淬灭剂(BHQ1)进行标记，标记产物如下：

ssDNA FQ reporter：5’6-FAM-TTATT-BHQ1 3’(SEQ ID NO.8)

ssRNA FQ reporter：5’6-FAM-UUUUUU-BHQ1 3’(SEQ ID NO.9)。

进一步地，在CRISPR-Cas12a检测系统中加入DNA靶标核酸序列，在CRISPR-Cas13a检测系统中加入RNA靶标核酸序列，将其混合均匀放入实时定量PCR仪(AppliedBiosystems)中于37℃进行反应，监测荧光动力学。

进一步地，对痕量靶标核酸序列进行检测时，在步骤S5前还包括扩增靶标样品中的靶标核酸序列的步骤。所述的扩增采用等温扩增技术，等温扩增技术包括针对RNA靶标核酸序列扩增的RT-RPA和RT-LAMP；以及针对DNA靶标核酸序列扩增的RPA和LAMP。

具体地，将靶标样品加入到RT-RPA或RPA等温扩增体系，在37℃反应30～60分钟扩增获得特异性产物；或将靶标样品加入到RT-LAMP或LAMP等温扩增体系，在62℃反应15～30分钟扩增获得特异性产物，将扩增获得的特异性产物加入CRISPR-Cas12a检测体系，于37℃反应30～60分钟。

进一步地，所述的等温扩增技术结合CRISPR检测系统过程中，在每15.6μL的RPA或RT-RPA等温扩增体系加入0.5～1M Betaine，0.5～1M L-Proline，5％(v/v)DMSO或者5％(v/v)甘油(Glycerol)，均可以提升CRISPR系统的检测信号；在每10μL的LAMP或RT-LAMP等温扩增体系加入0.5～1M L-Proline，也可以显著提升CRISPR系统的检测信号。

本发明的效果和益处是：

(1)本发明提出使用CutSmart反应缓冲液可以使CRISPR-AsCas12a和LwaCas13a系统稳定、高效地进行检测。

(2)本发明发现0.2～1M L-Proline的添加可以显著提高AsCas12a和LwaCas13a对靶标序列的检测能力，同时0.5～1M Betaine的添加也可以提升LwaCas13a对靶标序列的检测能力。

(3)本发明发现在RT-LAMP扩增体系中添加0.5～1M L-Proline可以显著提升其对特异性产物的扩增；在RT-RPA扩增体系中添加0.5～1M Betaine，0.5～1M L-Proline，5％DMSO或者5％Glycerol均可提升其对特异性产物的扩增。

(4)本发明公开了一种优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统及其检测方法，解决了等温扩增技术特异性差，CRISPR检测系统不稳定、灵敏度低的问题，为临床诊断和实验室研究提供了一个高效、准确、稳定的检测方法。

附图说明

图1为CRISPR-Cas12a/Cas13a检测核酸原理示意图；

图2为SARS-CoV-2靶标序列及crRNA的基因组定位示意图；

图3为不同的反应缓冲液对AsCas12a检测能力影响的比较；

图4为不同的反应缓冲液对LwaCas13a检测能力影响的比较；

图5为添加化合物对CRISPR-Cas12a/Cas13a检测系统影响的示意图；

图6为添加不同化合物后AsCas12a检测SARS-CoV-2S基因的荧光检测结果；

图7为添加L-Proline的AsCas12a检测系统检测SARS-CoV-2S基因的动态监测荧光信号结果；

图8为添加不同化合物后LwaCas13a检测SARS-CoV-2N基因的荧光检测结果；

图9为添加L-Proline的LwaCas13a检测系统检测SARS-CoV-2N基因的动态监测荧光信号结果；

图10为在RPA和LAMP扩增过程添加化合物，利用AsCas12a系统检测特异性产物示意图；

图11为基于AsCas12a系统检测添加不同化合物后RT-LAMP扩增产物的荧光检测结果(N基因)；

图12为添加0.5M L-Proline对RT-LAMP扩增特异性产物的能力有显著提升(N基因，n＝3)；

图13为基于AsCas12a系统检测添加不同化合物后RT-RPA扩增产物的荧光检测结果(S基因)；

图14为添加1M Betaine，1M L-Proline和5％DMSO对RT-RPA扩增特异性产物的能力有显著提升(S基因)。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中：TwistAmp^TM Basic Kit购自TwistDx公司；WarmStart RTx Reversetranscriptase(#M0380L)，ProtoScript II Reverse Transcriptase(#M0368L)，Bst2.0WarmStart DNA Polymerase(#M0538S)，NEB2 Buffer(#B7002S)，NEB2.1Buffer(#B7202S)，NEB3 Buffer(#B7003S)，NEB3.1 Buffer(#B7203S)，Isothermal AmplificationBuffer(#B0537S)，和CutSmart Buffer(#B7204S)均购自NEB公司；Takara T Buffer(#SD6092)和Takara K Buffer(#SD6076)购自Takara公司；T7 RNA Polymerase(#30223-1)购自NxGen公司；常规试剂如Tris-HCl,MgCl₂，DMSO和甘油等购自Thermo Fisher；FQreporter核酸序列合成由上海华津生物科技有限公司完成；常规引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成。

本发明实施例中的SARS-CoV-2的S基因和N基因的靶标序列，CRISPR-Cas12a和Cas13a的crRNA的核酸序列信息如表1和表2所示。

表1.SARS-CoV-2的S基因和N基因的靶标序列

表2.CRISPR-Cas12a/Cas13a靶向S基因和N基因的特异性crRNA

实施例1：使用本发明检测SARS-CoV-2

CRISPR-Cas12a/Cas13a检测核酸原理示意图如图1所示，Cas12a和Cas13a与其对应的crRNA结合形成复合体，在特异性crRNA的指导下分别靶向DNA和RNA靶标序列，在激活顺式切割活性的同时会产生一种反式切割活性即非特异性地切割附近的单链DNA或RNA FQreporter，从而产生可以被读取的荧光信号，利用这一相关性，可以通过荧光信号的强弱来判断靶标序列的含量。

SARS-CoV-2靶标序列及crRNA的基因组定位示意图如图2所示，S基因和N基因靶标序列在SARS-CoV-2基因组上的位置为图中放大部分，特异性crRNA设计位置标记在S基因和N基因的靶标序列上，用灰色条状表示。

本实施例中S基因的DNA靶标序列通过两条DNA oligo退火互补配对形成双链DNA，使用PCR技术对DNA两端序列进行延长，经过纯化获得S基因的DNA靶标序列，命名为SARS-CoV-2-S-DNA；在对S基因DNA进行延长时，在其5’端引入T7启动子序列，利用T7 RNA聚合酶(NxGen)将DNA片段转录成RNA，命名为SARS-CoV-2-S-RNA。

本实施例中检测采用20μL体系，如表3所示，但不限于此，包含相对应成分的比例调整：

表3.SARS-CoV-2病毒CRISPR-Cas12a/Cas13a检测体系

其中，10*Buffer分别为使用NEB2，NEB2.1，NEB3，NEB3.1，Takara T，Takara K，Isothermal Amplification Buffer和CutSmart反应缓冲液，用H₂O作为反应缓冲液的检测组作为阴性对照。

在上述反应体系配制完成后，将其混合均匀放入实时定量PCR仪(AppliedBiosystems)中于37℃进行反应，监测荧光动力学，每1分钟检测一次，持续检测90分钟。将每个时间点采集到的荧光FAM值减去背景ROX值，使用处理后的荧光信号值作为原始数据进行分析比较。

结果：如图3和图4所示，在CutSmart反应缓冲液条件下，AsCas12a和LwaCas13a均可稳定、高效地对靶标序列进行检测，其检测活性显著优于在其他反应缓冲液中的表现。

实施例2：添加化合物提高CRISPR-Cas12a/Cas13a对SARS-CoV-2的检测能力

在CRISPR-Cas12a/Cas13a检测系统添加化合物的示意图如图5所示，以SARS-CoV-2-S-DNA作为AsCas12a检测系统的靶标序列，以SARS-CoV-2-N-RNA作为LwaCas13a检测系统的靶标序列，分别在两种检测体系中添加不同的化合物以筛选可以显著提高CRISPR检测信号的化合物。

本实施例采用20μL体系如表4所示，但不限于此，包含相对应成分的比例调整：

表4.靶标SARS-CoV-2病毒添加不同化合物的CRISPR-Cas12a/Cas13a检测体系

其中，筛选的化合物包括0.2M Betaine，0.5M Betaine，1M Betaine，0.2M L-Proline，0.5M L-Proline，1M L-Proline，0.2M Urea，0.5M Urea，1M Urea，1％Formamide，5％Formamide，10％Formamide，1％DMSO，5％DMSO，10％DMSO，1％Glycerol，5％Glycerol和10％Glycerol(百分比为体积百分比)；不加化合物的检测组作为对照组，命名为nochemical；既不加化合物也不加靶标序列的检测组作为阴性对照，命名为no template。

本实施例中，利用荧光信号强度判定CRISPR-Cas12a/Cas13a的检测能力。使用实时定量PCR仪用于测量检测反应的荧光，在37℃进行反应，监测荧光动力学，其中Reporter通道选择FAM，Quencher通道选择NFQ-MGB，每1分钟检测一次，持续检测1小时。将每个时间点采集到的荧光FAM值减去背景ROX值，使用处理后的荧光信号值进行数据分析。使用检测1小时后的终点信号值比较添加不同的化合物对CRISPR-Cas12a/Cas13a的检测能力的影响。

添加不同化合物后AsCas12a检测SARS-CoV-2S基因的荧光检测结果如图6所示，与no chemical对照组相比，0.2M L-Proline，0.5M L-Proline，1M L-Proline的添加可将AsCas12a系统的检测能力提高5-7倍，10％Glycerol的添加也将AsCas12a系统的检测能力提高了2倍左右；添加L-Proline的AsCas12a检测系统检测SARS-CoV-2S基因的动态监测荧光信号结果如图7所示，L-Proline的添加显著提高了荧光信号的增长速度。

添加不同化合物后LwaCas13a检测SARS-CoV-2N基因的荧光检测结果如图8所示，与no chemical对照组相比，0.2M L-Proline，0.5M L-Proline，1M L-Proline的添加可将LwaCas13a系统的检测能力提高2倍多，1M Betaine的添加也将LwaCas13a系统的检测能力提高了2倍左右；添加L-Proline的LwaCas13a检测系统检测SARS-CoV-2N基因的动态监测荧光信号结果如图9所示，L-Proline的添加显著提高了荧光信号的增长速度。

本实施例中，L-Proline的添加对CRISPR-Cas12a和Cas13a的检测活性均有显著提升。

实施例3：AsCas12a系统结合等温扩增技术检测痕量SARS-CoV-2

在RPA和LAMP扩增过程添加化合物，利用AsCas12a系统检测特异性产物示意图如图10所示，以SARS-CoV-2-S-RNA和SARS-CoV-2-N-RNA分别作为RT-RPA和RT-LAMP扩增体系的模板，在扩增过程添加不同的化合物对靶标序列进行扩增，然后将扩增产物经过PCR纯化去除添加的化合物，DNA聚合酶和逆转录酶等干扰物质，将纯化的DNA作为AsCas12a检测系统的输入进行检测。

在本实施例中RT-LAMP扩增采用10μL体系如表5所示，但不限于此，包含相对应成分的比例调整：

表5.靶标SARS-CoV-2-N-RNA添加不同化合物的RT-LAMP扩增体系

其中，添加的化合物包括0.5M Betaine，1M Betaine，0.5M L-Proline，1M L-Proline，0.5M Urea，1M Urea，1％Formamide，5％Formamide，5％DMSO，10％DMSO，5％Glycerol和10％Glycerol(百分比为体积百分比)，所有添加化合物的扩增体系的SARS-CoV-2-N-RNA模板均为10³拷贝；N-RNA模板为10³拷贝且不加化合物的扩增体系作为对照组，命名为10³copies；N-RNA模板为10⁶拷贝且不加化合物的扩增体系作为阳性对照组，命名为10⁶copies；既不加化合物也不加靶标序列的扩增体系作为阴性对照，命名为0copy。

在上述RT-LAMP扩增体系中使用的具体引物序列如表6所示。

表6.靶向SARS-CoV-2-N-RNA的RT-LAMP扩增引物序列

在本实施例中RT-RPA扩增采用15.6μL体系如表7所示，但不限于此，包含相对应成分的比例调整：

表7.靶标SARS-CoV-2-S-RNA添加不同化合物的RT-RPA扩增体系

其中，添加的化合物包括0.5M Betaine，1M Betaine，0.5M L-Proline，1M L-Proline，0.5M Urea，1M Urea，1％Formamide，5％Formamide，5％DMSO，10％DMSO，5％Glycerol和10％Glycerol(百分比为体积百分比)，所有添加化合物的扩增体系的SARS-CoV-2-S-RNA模板均为10³拷贝；S-RNA模板为10³拷贝且不加化合物的扩增体系作为对照组，命名为10³copies；S-RNA模板为10⁶拷贝且不加化合物的扩增体系作为阳性对照组，命名为10⁶copies；既不加化合物也不加靶标序列的扩增体系作为阴性对照，命名为0copy。

在上述RT-RPA扩增体系中使用的具体引物序列如表8所示。

表8.靶向SARS-CoV-2-S-RNA的RT-RPA扩增引物序列

将RT-LAMP和RT-RPA的扩增产物经过PCR纯化后，使用AsCas12a检测系统的分别对其进行检测，检测体系参考表3，其中在检测系统中不加入任何核酸序列的检测组设置为对照组，命名为CRISPR Ctrl。

CRISPR检测是具有特异性的过程，只有存在crRNA可以靶向的序列时，才会激活其核酸酶活性。基于此特异性检测的能力，由于等温扩增技术的扩增特异性较差，我们通过检测系统的荧光信号值来反映输入到检测系统的扩增产物中靶标序列的含量，故荧光信号越强说明输入到CRISPR检测系统中的特异性靶标序列越多，说明添加化合物提高了扩增系统的特异性。

基于AsCas12a系统检测添加不同化合物后RT-LAMP扩增产物的荧光检测结果(N基因)如图11所示，RT-LAMP扩增体系中加入0.5M L-Proline和1M L-Proline的扩增产物作为AsCas12a检测体系的样品输入的荧光信号要显著高于10³copies组和其他化合物添加组，表明0.5M L-Proline和1M L-Proline的添加使RT-LAMP扩增出更多的特异性产物。此外，添加0.5M L-Proline对RT-LAMP扩增特异性的影响如图12所示，添加0.5M L-Proline在10³copies和10⁵copies模板输入量级下对RT-LAMP扩增系统的特异性均有显著提升。

基于AsCas12a系统检测添加不同化合物后RT-RPA扩增产物的荧光检测结果(S基因)如图13所示，在RT-RPA扩增体系中添加0.5M Betaine，1M Betaine，0.5M L-Proline，1ML-Proline，5％DMSO和5％Glycerol，AsCas12a检测体系的荧光信号要显著高于10³copies组和其他化合物添加组，表明这几种化合物的添加可以使RT-RPA扩增出更多的特异性产物。此外，基于AsCas12a系统检测添加1M Betaine，1M L-Proline和5％DMSO的RT-RPA扩增产物的动态荧光信号结果如图14所示，将10³copies S基因RNA作为RT-RPA扩增体系的模板，其扩增产物含量未能达到AsCas12a检测系统的检测限；而在RT-RPA扩增体系中添加这三种化合物后，其扩增产物可以使AsCas12a检测荧光信号快速增加。

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。

序列表

<110> 东北大学

<120> 一种优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统及其检测方法

<130> 2020S1099

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 149

<212> RNA

<213> 新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）

<400> 1

gguagauuug ccaauaggua uuaacaucac uagguuucaa acuuuacuug cuuuacauag 60

aaguuauuug acuccuggug auucuucuuc agguuggaca gcuggugcug cagcuuauua 120

uguggguuau cuucaaccua ggacuuuuc 149

<210> 2

<211> 273

<212> RNA

<213> 新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）

<400> 2

caauguaaca caagcuuucg gcagacgugg uccagaacaa acccaaggaa auuuugggga 60

ccaggaacua aucagacaag gaacugauua caaacauugg ccgcaaauug cacaauuugc 120

ccccagcgcu ucagcguucu ucggaauguc gcgcauuggc auggaaguca caccuucggg 180

aacgugguug accuacacag gugccaucaa auuggaugac aaagauccaa auuucaaaga 240

ucaagucauu uugcugaaua agcauauuga cgc 273

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7-F

<400> 3

gaaattaata cgactcacta taggg 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AsCas12a-crRNA

<400> 4

actcctggtg attcttcttc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AsCas12a-crRNA

<400> 5

cccccagcgc ttcagcgttc 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LwaCas13a-crRN

<400> 6

tccaacctga agaagaatca ccaggagt 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LwaCas13a-crRN

<400> 7

gaacgctgaa gcgctggggg caaattgt 28

<210> 8

<211> 5

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ssDNA FQ reporter序列

<400> 8

ttatt 5

<210> 9

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ssRNA FQ reporter序列

<400> 9

uuuuuu 6

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F3 primer

<400> 10

aacacaagct ttcggcag 18

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B3 primer

<400> 11

gaaatttgga tctttgtcat cc 22

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FIP primer

<400> 12

cgcattggca tggaagtcac tttgatggca cctgtgtag 39

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BIP primer

<400> 13

tgcggccaat gtttgtaatc agccaaggaa attttgggga c 41

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LF primer

<400> 14

ttccttgtct gattagttc 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LB primer

<400> 15

accttcggga acgtggtt 18

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPA-F primer

<400> 16

aggtttcaaa ctttacttgc tttacataga 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPA-R primer

<400> 17

tcctaggttg aagataaccc acataataag 30

Claims

1.一种优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统，其特征在于，在所述的核酸检测系统中，每20μL体系包括：

50nM～100nM CRISPR-Cas蛋白；

50nM～100nM crRNA；

200～300nM单链DNA荧光信号报告分子和/或单链RNA荧光信号报告分子；

0.2～1M脯氨酸或0.5～1M甜菜碱；

CutSmart反应缓冲液；

0.1～100ng靶标样品；以及水。

2.根据权利要求1所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统，其特征在于，所述的CRISPR-Cas蛋白为CRISPR-Cas12a蛋白或者CRISPR-Cas13a蛋白；其中，

所述的CRISPR-Cas12a蛋白选自AsCas12a、LbCas12a、Lb4Cas12a、Lb5Cas12a、FnCas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a或BoCas12a；

所述的CRISPR-Cas13a蛋白选自LwaCas13a、LbaCas13a、CamCas13a、LbuCas13a、LshCas13a、RcaCas13a、HheCas13a、PprCas13a、LseCas13a、LbmCas13a或LbnCas13a。

3.根据权利要求2所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统，其特征在于，所述的CRISPR-Cas12a蛋白为AsCas12a，所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统为用于检测靶标样品中DNA靶标核酸序列的AsCas12a的检测系统；

所述的AsCas12a的检测系统中每20μL体系包括50nM AsCas12a蛋白、50nM crRNA、250nM单链DNA荧光信号报告分子、0.2～1M脯氨酸、CutSmart反应缓冲液、靶标样品以及水。

4.根据权利要求2所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统，其特征在于，所述的CRISPR-Cas13a蛋白为LwaCas13a，所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统为用于检测靶标样品中RNA靶标核酸序列的LwaCas13a检测系统；

所述的LwaCas13a检测系统中每20μL体系中包括100nM LwaCas13a蛋白、100nM crRNA、250nM单链RNA荧光信号报告分子、0.2～1M脯氨酸或0.5～1M甜菜碱、CutSmart反应缓冲液、靶标样品和水。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统，其特征在于，所述的CRISPR-Cas蛋白和crRNA的摩尔浓度比例为1：1；所述的水为超纯水。

6.一种优化的基于CRISPR介导的核酸检测方法，其特征在于，所述的核酸检测方法基于权利要求1-5中任一项所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统，具体包括以下步骤：

S4：合成单链DNA信号报告分子和/或单链RNA信号报告分子；

S5：基于权利要求1-5中任一项的优化的基于CRISPR介导的核酸检测系统，构建反应体系，并对靶标样品进行检测，使用实时定量PCR仪读取荧光信号。

7.根据权利要求6所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测方法，其中，在步骤S5中，在CRISPR-Cas12a检测系统中加入DNA靶标核酸序列和/或在CRISPR-Cas13a检测系统中加入RNA靶标核酸序列，分别混合均匀，放入实时定量PCR仪中于37℃进行反应，监测荧光动力学。

8.根据权利要求6或7所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测方法，其中，在步骤S5前还包括扩增靶标样品中的靶标核酸序列的步骤，所述的扩增采用等温扩增技术，等温扩增技术包括：针对RNA靶标核酸序列扩增的RT-RPA和RT-LAMP；以及针对DNA靶标核酸序列扩增的RPA和LAMP。

9.根据权利要求8所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测方法，其中，扩增靶标样品中的靶标核酸序列包括：

a)将靶标样品加入到RT-RPA或RPA等温扩增体系，在37℃反应30～60分钟扩增获得特异性产物；或者将靶标样品加入到RT-LAMP或LAMP等温扩增体系，在62℃反应15～30分钟扩增获得特异性产物；

b)将a)中扩增获得的特异性产物加入CRISPR-Cas12a检测体系，于37℃反应30～60分钟。

10.根据权利要求9所述的优化的基于CRISPR介导的核酸检测方法，其中，

在每15.6μL的RPA或RT-RPA等温扩增体系包含0.5～1M甜菜碱、0.5～1M脯氨酸、5％(v/v)DMSO或者5％(v/v)甘油；

在每10μL的LAMP或RT-LAMP等温扩增体系包含0.5～1M脯氨酸。