CN114480327B - 一种Taq DNA聚合酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能进行快速PCR且耐受SYBR Green I的Taq DNA聚合酶突变体。本发明中筛选获得的Taq 01 DNA聚合酶突变体，在PCR和qPCR中均表现出快速PCR活性且更耐受SYBR Green I的活性。基于这些优势，该突变体可以在SYBR Green I等抑制剂存在的条件下进行快速PCR，从而在临床诊断和科学研究中可以更快的和更加灵敏的获得结果。

Description

一种Taq DNA聚合酶突变体
技术领域
本发明涉及生物领域，并具体涉及一种Taq DNA聚合酶突变体。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种应用十分广泛的体外扩增DNA技术。PCR自1985年问世以来，逐渐扩展到各个领域。除了在实验室分子生物学中运用，在临床疾病诊断和法医鉴定上也有着十分重要的作用。比如检测基因突变和微生物或病毒感染因子等，还比如可以进一步检测抗生素耐药基因和生物威胁剂。PCR的最早的诊断用途之一是用于镰状细胞贫血的产前诊断试验。使用PCR检测镰状细胞突变比以前的方法更快速和敏感。随后进行了更多基于PCR的诊断，包括检测低拷贝数病毒靶点(如HIV)；通过检测结核分枝杆菌诊断肺结核的试验；以及用于检测胃肠道幽门螺杆菌的不同分离物。
1992年，Higuchi等人开发了实时PCR(qPCR)。这种增强的PCR方法通过荧光染料(如SYBR Green I)或荧光共振能量转移(FRET)探针实时检测反应过程中形成的产物量。有三种主要的FRET探针：5'核酸外切酶探针(TaqMan)、分子信标和FRET杂交探针。SYBR GreenI是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时发出荧光，而当它从DNA分子释放时荧光减弱。实时PCR使得反应中DNA的起始量和整个过程中DNA的产生量实现可视化。与传统的培养方法相比，基于PCR的检测方法具有速度快、特异性强、灵敏度高等优点。
PCR反应主要依赖于DNA聚合酶。最初PCR技术中扩增DNA的酶来源于大肠杆菌聚合酶的Klenow片段。PCR扩增可以在短短几小时内就产生数十亿个拷贝的分子。随后在一些嗜热细菌中分离出了几种非常耐热的DNA聚合酶，包括Thermus aquaticus(Taq)、Thermusthermophilus(Tth)和Pyrococcus furiosus(Pfu)。它们在95℃的高温下依旧不会失去活性。其中，Taq DNA聚合酶是第一种应用于PCR的酶。它既有聚合酶活性又有外切酶活性。由于Taq DNA聚合酶高稳定性和高效性以及简单和经济的生产过程，这种聚合酶是大多数PCR应用中最受欢迎和最广泛使用的酶。
基于聚合酶链反应(PCR)的基因检测被广泛应用于疾病诊断和个性化医疗。但是，随着科学技术和社会的发展进步，临床诊断和科学研究中对于Taq DNA聚合酶的要求越来越高。这就暴露出它存在许多局限，包括DNA产量低、延伸DNA的长度短、聚合酶的速度慢、过程的保真度低和耐受性差等。具体而言，PCR检测通常涉及从血液和组织中提取基因组DNA，这增加了交叉污染的机会和完成检测所需的时间。直接在全血上进行的PCR反应又比较复杂，因为用于PCR的最常见的DNA聚合酶Taq在仅含0.2％全血的溶液中就完全被抑制。然而，在过去的20年里，各种直接从全血中实现高效PCR扩增的方法被开发出来。这些方法包括：
(1)在初始变性步骤之前加入加热-冷却循环，或简单地增加一个较长的初始变性周期；
(2)使用非Taq DNA聚合酶如rTth、Tfl、HotTub和Pwo；
(3)能够逆转血液对Taq DNA聚合酶抑制作用的药物，如甜菜碱、牛血清白蛋白、单链DNA结合蛋白和蛋白酶抑制剂；
(4)高pH反应缓冲液；
(5)使用干血斑；
(6)Taq突变体如KlenTaq。
目前已经发现了几种人血液中PCR的天然抑制剂，包括血红蛋白、免疫球蛋白G、乳铁蛋白和蛋白酶，但是它们的抑制机制尚不清楚。此外，全血中的抗凝血剂如EDTA和肝素也能抑制PCR反应。尽管一些特殊配方的缓冲液和酶试剂盒可直接用于全血PCR，但是这些工具非常昂贵，且耗费时间较长。
为了解决上述需求，可以从Taq DNA聚合酶本身着手去减小这些限制。其中一种就是在Taq DNA聚合酶突变体中筛选获得在某一方面具有优越性能的个体。而最有效、最快速的方法就是对Taq DNA聚合酶进行区域性自我复制筛选(即CSR高通量筛选)。
CSR主要基于一个反馈回路，每个聚合酶突变体都只能复制自己的编码基因。在利用易错PCR随机突变建立文库后，通过形成油包水乳剂在隔室中分离出聚合酶突变体。每个小室通常包含一个含有聚合酶突变体的表达型大肠杆菌细胞，这就提供了表型和基因型之间的联系，而这正是这一过程的关键。
当热循环导致细胞裂解时，PCR试剂也包含在隔室内并与表达的聚合酶结合。如果聚合酶突变体以活性酶的形式表达，或在压力条件下是有活性的，那么它将复制自己的基因，从而在热循环过程中增加编码活性聚合酶的基因的拷贝数。不能自我复制的不活跃的聚合酶将从基因库中逐渐减少最终消失。
以这种方式进行几轮甚至十几轮的筛选和富集最终获得想要的突变体聚合酶。
这个筛选过程中可以设置各种各样的压力来筛选不同突出性能的个体来满足不同的实验要求。比如1)在CSR过程中，通过逐步降低循环数和延伸时间，来筛选能够在短时间内即可扩增出大量产物的突变体，或者2)在CSR过程中，逐轮增加PCR抑制剂浓度如SYBRGreen I、肝素和SDS等，来筛选耐抑制剂的突变体，或者3)在CSR过程中，添加易形成二聚体的引物来筛选具有热启动活性的个体，或者4)在CSR过程中，加入能够阻断聚合进程的修饰引物筛选具有高外切酶活性的个体，从而应用于qPCR中高效切除探针，以提高检测的灵敏度。
在这些研究的过程中，许多不同突变的Taq DNA聚合酶被创造和研究，以一种或另一种方式改善这种酶的性质，包括提高酶的保真度，改变5'-3'核酸外切酶活性，提高酶分子与DNA的结合性，增强酶“冷敏感性”或增加酶对不同PCR抑制剂的耐受性。这些Taq DNA聚合酶突变体可用于qPCR、DNA测序、扩增含有各种PCR抑制剂(染料、血液、土壤)的DNA样品。例如，在qPCR中使用的SYBR Green I染料，它可以抑制Taq DNA聚合酶活性，降低PCR的效率和灵敏度。聚合酶对SYBR Green I的耐受性增加可能与血液和土壤中对其他PCR抑制剂的酶耐药性增加有关。
目前，在临床诊断和科学研究过程中，人们最期望能提高的就是PCR的速度和耐抑制。因为在临床诊断过程中DNA来源的复杂性、纯化过程的耗时性以及PCR过程对诊断的时效性有着极大的影响，有些病人或者疾病要求在短时间内就做出准确的判断以便后续的检查和用药。并且由于DNA来源的复杂性，其中包含了许多抑制PCR反应的物质，而大部分是针对Taq DNA聚合酶的。目前采用的方法是将Taq DNA聚合酶用特异性的抗体修饰以提高其耐受性，但是抗体修饰耗时耗力，科学家希望找到更快速更经济的方法。而对Taq DNA聚合酶进行随机突变，从突变体库中获得具有快速PCR活性和耐抑制的个体是最经济快速的方法。目前，科学家们也筛选获得了一些能够耐受抑制剂的突变体，如G59W、V155I、L245M、L375V、E507K、K508R、E734G、F749I、E189K、E230K、E507K、H28R、L30R、G38R、F73V、H75R、E76A、E76G、E76K、E90K、K206R、E315K、A348V、L351F、A439T、D452N、G504S、E507A、D551N、L552R、I553V、D578N、H676R、Q68OR、D732G、E734G、E734K、F749V。但是这些突变体目前还存在或多或少的问题，例如需要的模板量高，或者耐抑制的效果不能达到理想状态。而其中E507K是公认具有快速PCR活性且耐受SYBR Green I的突变体，可以利用E507K作为对照，来验证所获得的突变体是否具有快速PCR且耐抑制的效果。
发明内容
基于上述问题，本发明人建立了Taq DNA聚合酶定向进化和高通量筛选系统并确认了该系统的可行性。目前本发明人利用该系统定向进化出了可耐受SYBR Green I抑制和具有快速扩增活性的Taq DNA聚合酶突变体。经过几轮CSR的筛选，本发明人获得了一些活性较好的突变体，其中本发明人筛选获得Taq 01 DNA聚合酶突变体其突变位点为Y24N/F27L/D144G。
Taq DNA聚合酶的基因序列信息如下：
ATGGCGGGGATGCTGCCCCTCTTTGAGCCCAAGGGCCGGGTCCTCCTGGTGGACGGCCACCACCTGGCCTACCGCACCTTCCACGCCCTGAAGGGCCTCACCACCAGCCGGGGGGAGCCGGTGCAGGCGGTCTACGGCTTCGCCAAGAGCCTCCTCAAGGCCCTCAAGGAGGACGGGGACGCGGTGATCGTGGTCTTTGACGCCAAGGCCCCCTCCTTCCGCCACGAGGCCTACGGGGGGTACAAGGCGGGCCGGGCCCCCACGCCAGAGGACTTTCCCCGGCAACTCGCCCTCATCAAGGAGCTGGTGGACCTCCTGGGGCTGGCGCGCCTCGAGGTCCCGGGCTACGAGGCGGACGACGTCCTGGCCAGCCTGGCCAAGAAGGCGGAAAAGGAGGGCTACGAGGTCCGCATCCTCACCGCCGACAAAGACCTTTACCAGCTCCTTTCCGACCGCATCCACGTCCTCCACCCCGAGGGGTACCTCATCACCCCGGCCTGGCTTTGGGAAAAGTACGGCCTGAGGCCCGACCAGTGGGCCGACTACCGGGCCCTGACCGGGGACGAGTCCGACAACCTTCCCGGGGTCAAGGGCATCGGGGAGAAGACGGCGAGGAAGCTCCTGGAGGAGTGGGGGAGCCTGGAAGCCCTCCTCAAGAACCTGGACCGGCTGAAGCCCGCCATCCGGGAGAAGATCCTGGCCCACATGGACGATCTGAAGCTCTCCTGGGACCTGGCCAAGGTGCGCACCGACCTGCCCCTGGAGGTGGACTTCGCCAAAAGGCGGGAGCCCGACCGGGAGAGGCTTAGGGCCTTTCTGGAGAGGCTTGAGTTTGGCAGCCTCCTCCACGAGTTCGGCCTTCTGGAAAGCCCCAAGGCCCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCCCCGCCGGAAGGGGCCTTCGTGGGCTTTGTGCTTTCCCGCAAGGAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTGGCCCTGGCCGCCGCCAGGGGGGGCCGGGTCCACCGGGCCCCCGAGCCTTATAAAGCCCTCAGGGACCTGAAGGAGGCGCGGGGGCTTCTCGCCAAAGACCTGAGCGTTCTGGCCCTGAGGGAAGGCCTTGGCCTCCCGCCCGGCGACGACCCCATGCTCCTCGCCTACCTCCTGGACCCTTCCAACACCACCCCCGAGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGCGGGGAGTGGACGGAGGAGGCGGGGGAGCGGGCCGCCCTTTCCGAGAGGCTCTTCGCCAACCTGTGGGGGAGGCTTGAGGGGGAGGAGAGGCTCCTTTGGCTTTACCGGGAGGTGGAGAGGCCCCTTTCCGCTGTCCTGGCCCACATGGAGGCCACGGGGGTGCGCCTGGACGTGGCCTATCTCAGGGCCTTGTCCCTGGAGGTGGCCGAGGAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAGGTCTTCCGCCTGGCCGGCCACCCCTTCAACCTCAACTCCCGGGACCAGCTGGAAAGGGTCCTCTTTGACGAGCTAGGGCTTCCCGCCATCGGCAAGACGGAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACCAGCGCCGCCGTCCTGGAGGCCCTCCGCGAGGCCCACCCCATCGTGGAGAAGATCCTGCAGTACCGGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGACCCCTTGCCGGACCTCATCCACCCCAGGACGGGCCGCCTCCACACCCGCTTCAACCAGACGGCCACGGCCACGGGCAGGCTAAGTAGCTCCGATCCCAACCTCCAGAACATCCCCGTCCGCACCCCGCTTGGGCAGAGGATCAGGCGGGCCTTCATCGCCGAGGAGGGGTGGCTATTGGTGGCCCTGGACTATAGCCAGATAGAGCTCAGGGTGCTGGCCCACCTCTCCGGCGACGAGAACCTGATCCGGGTCTTCCAGGAGGGGCGGGACATCCACACGGAGACCGCCAGCTGGATGTTCGGCGTCCCCCGGGAGGCCGTGGACCCCCTGATGCGCCGGGCGGCCAAGACCATCAACTTCGGGGTCCTCTACGGCATGTCGGCCCACCGCCTCTCCCAGGAGCTAGCCATCCCTTACGAGGAGGCCCAGGCCTTCATTGAGCGCTACTTTCAGAGCTTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAGACCCTGGAGGAGGGCAGGAGGCGGGGGTACGTGGAGACCCTCTTCGGCCGCCGCCGCTACGTGCCAGACCTAGAGGCCCGGGTGAAGAGCGTGCGGGAGGCGGCCGAGCGCATGGCCTTCAACATGCCCGTCCAGGGCACCGCCGCCGACCTCATGAAGCTGGCTATGGTGAAGCTCTTCCCCAGGCTGGAGGAAATGGGGGCCAGGATGCTCCTTCAGGTCCACGACGAGCTGGTCCTCGAGGCCCCAAAAGAGAGGGCGGAGGCCGTGGCCCGGCTGGCCAAGGAGGTCATGGAGGGGGTGTATCCCCTGGCCGTGCCCCTGGAGGTGGAGGTGGGGATAGGGGAGGACTGGCTCTCCGCCAAGGAGTAA(SEQ ID NO：1)
Taq DNA聚合酶的蛋白序列信息如下：
MAGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE(SEQ ID NO：2)
Taq 01 DNA聚合酶突变体基因突变位点为T70A/T79C/A461G，相应的蛋白序列突变位点为Y24N/F27L/D144G。
如本发明所定义的，普通Taq DNA聚合酶的延伸速度为1kb/min，快速PCR是指在相同条件下，Taq DNA聚合酶突变体的延伸速度高于1kb/min。即在相同条件下，突变体可以在更短的时间，扩增相同长度的DNA片段。
在本发明中，本发明人通过PCR三步法、qPCR两步法验证了该突变体的性能。证明了它可以在短时间内即可获得大量的DNA产物，并且在高浓度SYBR Green I存在的条件下也可以快速扩增。这就说明该突变体可以应用于临床诊断和试剂盒的开发。
因此，在一方面，本发明提供了一种Taq DNA聚合酶，其包含选自以下位点中至少一个突变：Y24N、F27L和D144G。
在一个实施方案中，本发明的Taq DNA聚合酶包含选自以下位点中至少两个突变：Y24N、F27L和D144G。
在另一个实施方案中，本发明的Taq DNA聚合酶包含Y24N、F27L和D144G的突变。
在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码本发明的Taq DNA聚合酶。
在一个实施方案中，本发明的分离的核酸包含选自以下位点中至少一个突变：T70A、T79C和A461G。
在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸包含选自以下位点中至少两个突变：T70A、T79C和A461G。
在又一个实施方案中，本发明的分离的核酸包含T70A、T79C和A461G的突变。
在又一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明的Taq DNA聚合酶或分离的核酸。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒是诊断试剂盒。
在另一方面，本发明提供了一种PCR方法，其使用本发明的Taq DNA聚合酶进行PCR。
在一个实施方案中，本发明的PCR方法是快速PCR。
在另一个实施方案中，本发明的PCR方法是实时PCR。
在又一方面，本发明提供了本发明的Taq DNA聚合酶在用于制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于进行PCR方法。
在一个实施方案中，本发明的PCR方法是快速PCR。
在另一个实施方案中，本发明的PCR方法是实时PCR。
在又一个实施方案中，本发明的试剂盒是诊断试剂盒。
在进一步的方面，本发明提供了本发明的Taq DNA聚合酶或试剂盒的用途，其用于PCR、qPCR、DNA测序或扩增含有各种PCR抑制剂(染料、血液、土壤)的DNA样品。
本发明的有益效果至少在于以下两点：
(1)本发明的Taq 01 DNA聚合酶突变体，通过PCR-SYBR Green I浓度梯度验证，鉴定出具有耐抑制效果，该突变体可以在高SYBR Green I浓度条件下扩增出大量DNA产物；
(2)本发明的Taq 01 DNA聚合酶突变体，通过qPCR两步法，鉴定出在SYBR Green I存在条件下，能够进行快速qPCR，该突变体比E507K的CT值提前3-4个，而WT不能进行耐抑制的快速qPCR。
附图简要说明
图1为CSR高通量筛选原理图及筛选过程。
图2为CSR第四轮突变体库粗酶检测结果。
图3为PCR检测突变体对SYBR Green I耐受性，可以看出WT在SYBR Green 1:50的条件下就不能扩增出产物或者扩增产物条带很弱，而E507K和01在SYBR Green 1:50的条件下能够扩增出产物且产物量较多，并且其中Taq 01 DNA聚合酶突变体在SYBR Green 1:12.5的条件下还有微弱条带。
图4和图5为qPCR-SYBR Green I两步法检测突变体快速PCR，当用SYBR Green I作为染料时，qPCR检测突变体在抑制剂存在条件下是否具有快速PCR活性的结果图。可以看出当延伸时间1min时无论模板量的多少，Taq 01DNA聚合酶突变体和WT、E507K均能扩增出产物且CT值相差不大。但是将延伸时间降低到10sec时，WT不能扩增出产物，而E507K和01可以扩增出产物。而其中01突变体表现优越，在1ng或0.1ng基因组条件下比文献中报道的E507K突变体CT值提前1-2个左右。将延伸时间降低到1sec时，WT不能扩增出产物；其中01突变体仍然表现十分优越，在1ng或0.1ng基因组条件下比文献中报道的E507K突变体CT值提前了4个左右。
图6为qPCR-SYBR Green I两步法对比试剂盒中Taq-DNA聚合酶和Taq01 DNA聚合酶突变体活性，当用SYBR Green I作为染料时，qPCR检测突变体在抑制剂存在条件下是否具有快速PCR活性的结果图。在qPCR两步法过程中设置了不同退火时间。首先检测了延伸时间为1分钟时DNA聚合酶的活性，结果可以看出CT值由小到大为Taq 01<Taq，CT值相差2.5个左右。随后将延伸时间降低到10秒时，Taq 01的CT值为23左右而Taq不能扩增出DNA产物。最后将延伸时间降低到1秒时，Taq 01的CT值为28左右而Taq不能扩增出DNA产物。可以看出在试剂盒检测过程中，Taq 01的扩增速度明显快于Taq且在延伸时间较短时Taq不能扩增出DNA产物，而Taq 01仍然可以扩增出DNA产物。因此这就说明本发明筛选获得的Taq 01在某些抑制剂如SYBR Green I存在时仍然能进行快速PCR。这样就可以加大检测范围，对于一些存在抑制剂的HBV DNA模板也可以进行快速扩增。
具体实施方式
本发明可通过以下实施方案进行实施，但本发明并不限于此。本发明的实施例仅为示例性而非限制性的。
实施例
实施例1-Taq 01 DNA聚合酶突变体的获得
本实施例首先建立了CSR高通量筛选系统，并通过易错PCR获得突变体文库，然后将突变体文库进行乳化PCR并且在PCR过程中降低延伸时间和循环数(见图1)。
在第五轮文库中随机挑出6个克隆，通过诱导细菌产生粗酶来检测其活性并通过测序鉴定突变情况，结果发现在这种情况下野生型细菌无法扩增出2500bp的条带而其中Taq 01能扩增出条带表明其具有优异的活性(见图2)。因此，将其与WT和E507K一起纯化并检测活性。
实施例2-PCR检测突变体对SYBR Green I的耐受性
在PCR检测突变体对SYBR Green I耐受性中以小鼠基因组为模板，并设计了可以扩增1kb DNA的引物。引物序列为F：gcagatagggaaatggggctcctga(SEQ ID NO：3)，R：tcagcaagacctgcgtaggcaacgg(SEQ ID NO：4)。利用SYBR Green I对Taq DNA聚合酶的抑制作用来检测抗耐受作用。设置了四个SYBR Green的浓度梯度分别是0、1:50、1:25、1:12.5，在该压力条件下用Taq DNA聚合酶及突变体扩增1kb的小鼠基因组片段。
结果发现WT在SYBR Green 1:50的条件下就不能扩增出产物或者扩增产物条带很弱，而E507K和Taq 01在SYBR Green 1:50的条件下能够扩增出产物且条带较亮，并且其中Taq 01突变体在SYBR Green 1:12.5的条件下还有微弱条带而E507K没有明显条带，说明它能够耐受较高浓度的SYBR Green I(见图3)。
PCR体系：
组分 25μL反应混合物
双蒸水 添加至25μL
10×Taq缓冲液 2.5μL
2.5mM dNTP 2.5μL
10μM正向引物 0.5μL
10μM反向引物 0.5μL
小鼠基因组DNA 20ng
Taq-DNA聚合酶 0.5μL
50×SYBR Green I 0/0.5/1/2uL
PCR扩增程序：
实施例3-qPCR两步法检测快速PCR及耐受SYBRGreenI活性
在qPCR两步法检测中以人细胞基因组为模板，并设计了可以扩增148bp DNA的引物。引物序列为F：aaagccgctcaactacatgg(SEQ ID NO：5)，R：tgctttgaatgcgtcccagag(SEQID NO：6)。利用SYBR Green I染料检测qPCR过程中产物的生成。在qPCR两步法过程中设置了不同退火时间和模板量。
结果发现在延伸时间1min时无论模板量的多少，Taq 01DNA聚合酶突变体和WT、E507K均能扩增出产物且CT值相差不大。但是将延伸时间降低到10sec时，WT不能扩增出产物，其他E507K和Taq 01可以扩增出产物。并且其中Taq 01突变体表现优越，在1ng或0.1ng基因组条件下比文献中报道的E507K突变体CT值提前1-2个左右。再将延伸时间降低到1sec时，同样WT不能扩增出产物；其中Taq 01突变体仍然表现十分优越，在1ng或0.1ng基因组条件下比文献中报道的E507K突变体的CT值提前4个左右(见图4和5)。这就说明本发明所筛选获得的突变体在SYBR Grenn I抑制剂存在和低模板量的条件下仍然具有快速PCR的活性。
qPCR体系：
组分 20μL反应混合物
双蒸水 添加至20μL
10×Taq缓冲液 2μL
2.5mM dNTP 2μL
10μM正向引物 0.4μL
10μM反向引物 0.4μL
人基因组DNA 10ng/1ng/0.1ng
Taq-DNA聚合酶 0.5μL
50×SYBR Green I 0.4μL
qPCR扩增程序：
实施例4-示例性诊断试剂盒
乙型肝炎病毒(HBV)感染在世界范围内分布，估计有2.4亿人慢性感染，其中每年约有68.6万人死于乙型肝炎感染及其后果。目前已经开发出许多诊断试剂盒，为了验证本发明筛选获得的Taq 01DNA聚合酶能够更好的应用于该类试剂盒检测中，将试剂盒中的TaqDNA聚合酶和Taq 01 DNA聚合酶突变体进行对比。参考Elisabeth Lampe在Usefulness ofin-house real time PCR for HBV DNA quantification in serum and oral fluidsamples中设计的用于扩增HBV前S/S区的引物来检测HBV病毒DNA。
正向引物：5′-GAATCCTCACAATACCGCAGAGT-3′(SEQ ID NO：7)；
反向引物：5′-GCCAAGACACACGGGTGAT-3′(SEQ ID NO：8)。
在qPCR两步法过程中设置了不同退火时间。首先检测了延伸时间为1分钟时DNA聚合酶的活性，结果可以看出CT值由小到大为Taq 01<Taq，CT值相差2.5个左右。随后将延伸时间降低到10秒时，Taq 01的CT值为23左右而Taq不能扩增出DNA产物。最后将延伸时间降低到1秒时，Taq 01的CT值为28左右而Taq不能扩增出DNA产物。可以看出在试剂盒检测过程中，Taq 01的扩增速度明显快于Taq且在延伸时间较短时Taq不能扩增出DNA产物，而Taq 01仍然可以扩增出DNA产物。因此这就说明本发明筛选获得的Taq 01在某些抑制剂如SYBRGreen I存在时仍然能进行快速PCR。这样就可以加大检测范围，对于一些存在抑制剂的HBVDNA模板也可以进行快速扩增。
qPCR体系及程序如下：
组分 20μL反应混合物
双蒸水 添加至20μL
10×Taq缓冲液 2μL
2.5mM dNTP 2μL
10μM正向引物 0.4μL
10μM反向引物 0.4μL
HBV DNA 1ng
Taq-DNA聚合酶 0.5μL
50×SYBR Green I 0.4μL
qPCR扩增程序：
1.一种Taq DNA聚合酶，其包含选自以下位点中至少一个突变：Y24N、F27L和D144G。
2.根据实施方案1所述的Taq DNA聚合酶，其包含选自以下位点中至少两个突变：Y24N、F27L和D144G。
3.根据实施方案1或2所述的Taq DNA聚合酶，其包含Y24N、F27L和D144G的突变。
4.一种分离的核酸，其编码根据实施方案1-3中任一项所述的Taq DNA聚合酶。
5.根据实施方案4所述的分离的核酸，其中所述核酸包含选自以下位点中至少一个突变：T70A、T79C和A461G。
6.根据实施方案5所述的分离的核酸，其中所述核酸包含选自以下位点中至少两个突变：T70A、T79C和A461G。
7.根据实施方案6所述的分离的核酸，其中所述核酸包含T70A、T79C和A461G的突变。
8.一种试剂盒，其包含根据实施方案1-3中任一项所述的Taq DNA聚合酶或根据实施方案4-7中任一项所述的分离的核酸。
9.根据实施方案8所述的试剂盒，其为诊断试剂盒。
10.一种PCR方法，其使用根据实施方案1-3中任一项所述的Taq DNA聚合酶进行PCR。
11.根据实施方案10所述的PCR方法，其中所述PCR方法是快速PCR。
12.根据实施方案10或11所述的PCR方法，其中所述PCR方法是实时PCR。
13.根据实施方案1-3中任一项所述的Taq DNA聚合酶在用于制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于进行PCR方法。
14.根据实施方案13所述的用途，其中所述PCR方法是快速PCR。
15.根据实施方案13或14所述的用途，其中所述PCR方法是实时PCR。
16.根据实施方案13-15中任一项所述的用途，其中所述试剂盒是诊断试剂盒。
17.根据前述实施方案的Taq DNA聚合酶或试剂盒的用途，其用于PCR、qPCR、DNA测序或扩增含有各种PCR抑制剂(染料、血液、土壤)的DNA样品。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种Taq DNA聚合酶突变体
<130> IDC200394
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2499
<212> DNA
<213> Taq DNA聚合酶
<400> 1
atggcgggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60
cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120
gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180
gcggtgatcg tggtctttga cgccaaggcc ccctccttcc gccacgaggc ctacgggggg 240
tacaaggcgg gccgggcccc cacgccagag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300
gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360
gtcctggcca gcctggccaa gaaggcggaa aaggagggct acgaggtccg catcctcacc 420
gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgtcctcca ccccgagggg 480
tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540
gactaccggg ccctgaccgg ggacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600
gagaagacgg cgaggaagct cctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660
ctggaccggc tgaagcccgc catccgggag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720
ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780
aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840
ctcctccacg agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900
ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960
cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020
gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080
ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140
gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200
gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260
gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320
ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380
ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440
cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500
cccgccatcg gcaagacgga gaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560
gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtaccggga gctcaccaag 1620
ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680
cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740
ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tcaggcgggc cttcatcgcc 1800
gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860
cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920
gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgccgg 1980
gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040
gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100
cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160
gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220
cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280
atgaagctgg ctatggtgaa gctcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc 2340
cttcaggtcc acgacgagct ggtcctcgag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400
cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460
gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggagtaa 2499
<210> 2
<211> 832
<212> PRT
<213> Taq DNA聚合酶
<400> 2
Met Ala Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠基因组正向引物
<400> 3
gcagataggg aaatggggct cctga 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠基因组反向引物
<400> 4
tcagcaagac ctgcgtaggc aacgg 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人细胞基因组正向引物
<400> 5
aaagccgctc aactacatgg 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人细胞基因组反向引物
<400> 6
tgctttgaat gcgtcccaga g 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> HBV正向引物
<400> 7
gaatcctcac aataccgcag agt 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> HBV反向引物
<400> 8
gccaagacac acgggtgat 19

Claims (13)

1.一种Taq DNA聚合酶，其特征在于，在SEQ ID NO：2的基础上进行如下位点的突变：Y24N、F27L和H154R。
2.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶。
3.根据权利要求2所述的分离的核酸，其特征在于，在SEQ ID NO：1的基础上进行如下位点的突变：T70A、T79C和A461G。
4.一种试剂盒，其包含根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶或根据权利要求2-3中任一项所述的分离的核酸。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其为诊断试剂盒。
6.一种PCR方法，其使用根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶进行PCR。
7.根据权利要求6所述的PCR方法，其中所述PCR方法是快速PCR。
8.根据权利要求6或7所述的PCR方法，其中所述PCR方法是实时PCR。
9.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶在用于制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于进行PCR方法。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述PCR方法是快速PCR。
11.根据权利要求9或10所述的用途，其中所述PCR方法是实时PCR。
12.根据权利要求9或10所述的用途，其中所述试剂盒是诊断试剂盒。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述试剂盒是诊断试剂盒。
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