CN109312397A - Penta E基因座多态性人体鉴定 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了使用Penta E短串联重复基因座中的多态性进行人体鉴定的方法和组合物。这些新公开的多态性在预防等位基因丢失方面意义重大。

Description

Penta E基因座多态性人体鉴定
技术领域
本发明公开了使用Penta E短串联重复基因座中的多态性进行人体鉴定的方法和组合物。
合并序列表
本申请含有序列表，所述序列表已经通过EFS-Web以ASCII格式提交并且以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
法医学、亲子鉴定、组织分型以及个体化用药领域常规地使用基于DNA的技术进行身份测定、基因分型、表型预测以及疾病预测和/或预防。DNA分型涉及分析具有感兴趣特征的基因组DNA的等位基因，通常称为“标记物”。现今所使用的大多数分型方法专门被设计成用于检测并分析已知在群体中以至少两种不同形式出现的DNA标志物的一个或多个区域的长度和/或序列方面的差异。所述长度和/或序列变异被称为“多态性”。DNA中存在这种变异的任何区域(即，“基因座”)都被称作“多态基因座”。
近年来，多态短串联重复序列(STR)作为遗传标志物的发现和发展在DNA分型中起到了重要作用。STR已经变成了人类身份和法医DNA测试的主要手段。由联邦调查局运行的组合DNA指数系统(CODIS)DNA数据库存储所选个体的DNA档案信息。该档案包括13个STR标记物(13个具有STR重复的基因座)和一个疾病性别决定基因座AMEL。所选择的DNA档案来自被定罪的罪犯，法医、被捕者、失踪或身份不明的人，以及失踪者参考DNA(血亲亲属)。未鉴定样品的DNA档案与CODIS DNA档案的比对，提供了潜在的鉴定匹配或可能的肇事者的调查线索。
现有的商业STR分析产生的DNA档案与改进的STR分析间的匹配，在数据库内和数据库之间提供了DNA档案的连续性和可比性。DNA序列的改变(例如迄今未知的突变，多态性或重排)可导致等位基因丢失(靶核酸扩增失败或显著降低)。新STR分析中等位基因丢失的发生可使DNA数据库内部和数据库之间的匹配变得困难或不精确。因此，设计新的分析以使群体内的所有潜在扩增产物都被检测仍然是在开发STR分析时一个持续关注的问题。因此，本领域需要基于发现人DNA序列中的新变异来改进基于DNA的技术。
本发明的一些实施例的概述
在一些实施例中，本发明公开了一种用于人体鉴定的方法，其包含杂交Penta E基因座旁侧的第一引物和第二引物以及扩增Penta E基因座，其中所述扩增产生的扩增产物至少包含序列
AAGAAAATTGTGGACAGGTGCG(SEQ ID NO：1)、
AAGAAAATTGTGGCCAGGTGTG(SEQ ID No：2)或
AAGAAAATTGTGGACAGGTGTG(SEQ ID NO：3)。
在一些实施例中，公开了一种用于人体鉴定的方法，包含使第一引物和第二引物与Penta E基因座杂交以及扩增Penta E基因座，其中所述扩增产生至少两种扩增产物，一种扩增产物包含SEQ ID No：1，另一种扩增产物包含SEQ ID NO：2。在其他实施例中，扩增产生至少两种扩增产物，一种扩增产物包含SEQ ID No：1，另一种扩增产物包含SEQ ID NO：3。在一些实施例中，扩增产生至少两种扩增产物，一种扩增产物包含SEQ ID No：2，另一种扩增产物包含SEQ ID NO：3。
在一些实施例中，本文公开了一种方法，其包含选择性地杂交Penta E基因座旁侧的至少第一和第二引物，其中第一引物在最接近的Penta E基因座重复的1，000个碱基对内，并且第一引物包含GGACAGGTGCG的序列(SEQ ID NO：4)、GGCCAGGTGTG(SEQ ID NO：5)、GGACAGGTGTG(SEQ ID NO：6)、GCCAGGTGTG(SEQ ID NO：7)、GCCAGGTGTG(SEQ ID NO：8)、GACAGGTGTG(SEQ ID NO：9)、ACAGGTGCG、CCAGGTGTG或ACAGGTGTG。
在一些实施例中，本文公开了包含非人类聚合酶、人基因组DNA和标记扩增产物的组合物，其中标记的扩增产物包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。
在其他实施例中，所公开的组合物包括非人类聚合酶，人基因组DNA和两种或更多种标记的扩增产物，其中一种标记的扩增产物包含SEQ ID No：1，另一种标记的扩增产物包括SEQ ID NO：2。在其他实施例中，扩增产生至少两种标记的扩增产物，一种标记的扩增产物包括SEQ ID No：1，另一种标记的扩增产物包括SEQ ID NO：3。在一些实施例中，扩增产生至少两种标记的扩增产物，一种标记的扩增产物包括SEQ ID No：2，另一种标记的扩增产物包括SEQ ID NO：3。
附图说明
本领域的技术人员将理解，下文描述的附图仅用于举例说明的目的。所述附图并不旨在以任何方式限制本教导内容的范围。
图1图解说明了SEQ ID NO：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3(表示为SNP2和SNP1)与Penta E短串联重复的相对位置(表示为“STR重复”)。同时还展示了即时公开的SEQ ID NO：1-3与Promega PowerPlex16(“PP16”)引物的相对位置。
具体实施方式
为了解释本说明书，将应用以下定义并且只要合适，以单数形式使用的术语也将包括复数并且反之亦然。除非明确想要相反含义(例如在最初使用所述术语的文档中)，否则为了解释本说明书和其关联的权利要求书，在下文阐述的任何定义与所述词语在任何其它文档、包括以引用的方式并入本文中的任何文档中的用法冲突的情况下，应该总是以下文阐述的定义为准。应注意，除非明确地并且毫不含糊地限于一个指示物，否则如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。作为解释目的，而不是作为限制，“X和/或Y”可以意指“X”或“Y”或“X和Y”。
本文中所使用的章节标题仅用于组织目的并且不应解释为以任何方式限制所描述主题。本说明书中引用的所有文献，包括(但不限于)专利、专利申请、文章、书籍以及论文，全都出于任何目的以其全文引用的方式明确地并入本文中。在所并入的文献中的任一个与本文中所定义的任一术语矛盾的情况下，以本说明书为准。虽然结合各种实施例描述本教导内容，但是并非旨在将本教导内容限制于此类实施例。相反，本领域的技术人员应当了解，本教导内容涵盖各种替代方案、修改以及等效形式。
人类基因组富含重复的DNA序列。因为这些重复的DNA序列可以在个体之间变化，所以这些序列用于个体鉴定。美国联邦调查局(FBI)致力于建立一个核心基因座集合，以纳入被称为CODIS(联合DNA指数系统)的国家数据库。13个CODIS基因座是CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、VWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51和D21S11。
“基因座”是染色体或核酸分子上的特定位置。基因座的等位基因位于同源染色体上的相同位点处。因此，CODIS基因座代表几个不同染色体上的13个特定位置的集合。由于这些基因座的重复性，它们被称为短串联重复序列。“短串联重复序列(STR)位点”是人类基因组的一个区域，包含长度为3-7个碱基的短重复序列元件。在给定的STR标记物处的重复无需是完美的重复。STR的实例包括但不限于三重重复；ATCATCATC，4-PEAT；GATAGATA等。
通过确定各种基因座(例如，CODIS基因座)的STR档案(即样品中STR基因座的等位基因)，并将结果与已知样品相同基因座的STR档案或已知个体的STR档案数据库进行比对，有助于鉴定人或鉴定人缘生物样品。将未鉴定样品中各种基因座的STR档案与已鉴定的STR档案进行比对，可以鉴定人源生物样品，鉴定人和/或提供可能的犯罪者的调查线索。通过同时分析单个反应容器中的多个基因座，可提高获得未知样品STR档案的效率。
在CODIS成立后，Promega公司的科学家们对Penta E基因座进行了表征。Penta E基因座是位于人染色体15上的五核苷酸STR基因座，具有AAAGA重复模序。虽然Penta E基因座不是CODIS基因座之一，但它广泛用于人体鉴定。
本文公开了与Penta E基因座联系紧密的多态性区域。这种多态性区域非常重要，因为未考虑到多态性可能使人体鉴定分析不确定。“多态性”或“DNA多态性”是指DNA序列中的两个或多个不同核苷酸序列在同一杂交群体中共存的情况。
如何使人体鉴定分析更广泛的一个实例是等位基因丢失。“等位基因丢失”是指靶核酸扩增失败或显著降低。等位基因丢失可能是由于引物3′末端未能与靶核酸的引物结合位点结合而引起的。结果，靶核酸没有扩增。
引物
在一些实施例中，本文公开了一种方法，包含选择性杂交位于Penta E基因座旁侧的第一和第二引物。术语“引物”是指能够选择性地与靶核酸或模板杂交的多核苷酸(寡核苷酸)及其类似物。
引物允许通过从引物3′末端延伸合成与相应多核苷酸模板、旁侧序列或扩增产物反向互补的序列。引物的长度通常可以介于约10到100个核苷酸之间并且可以提供与模板反向互补的多核苷酸的模板定向合成的起始点，所述合成可以在存在恰当酶、辅因子以及例如核苷酸等底物的情况下发生。
引物可以机械合成。新产生的DNA多核苷酸在细胞DNA复制期间形成。这些天然存在的DNA多核苷酸称为冈崎片段。机械合成的引物可与这些天然的冈崎片段不同，因为缺少5′磷酸或存在修饰，例如标签。这些差异使得机械合成的引物在化学上和功能上与冈崎片段不同。例如，缺少5′磷酸会阻碍冈崎片段的连接。冈崎片段可含有核糖核酸(RNA)。
在一些实施例中，本文公开了一种方法，包含选择性地杂交位于PentaE基因座旁侧的第一引物和第二引物，其中第一引物不具有5′磷酸。在其他实施例中，本文公开了一种方法，包含选择性地杂交位于Penta E基因座旁侧的第一引物和第二引物，其中第二引物不具有5′磷酸。在一些实施例中，本文公开了一种方法，包含选择性地杂交位于Penta E基因座旁侧的第一引物和第二引物，其中第一和第二引物不具有5′磷酸。因此，在一些实施例中，本文公开了一种方法，包含选择性地杂交位于Penta E基因座旁侧的第一引物和第二引物以及扩增Penta E基因座，其中扩增产生的扩增产物至少包含序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3，并且其中第一引物不具有5′磷酸，第二引物不具有5′磷酸，或第一引物和第二引物不具有5′磷酸。
在一些实施例中，本文公开了一种方法，包含选择性地杂交Penta E基因座旁侧的至少第一引物和第二引物，其中第一引物在最接近的Penta E基因座重复的1，000个碱基对内，并具有SEQ ID NO：1，2，3，4，5，6，7，8，9、ACAGGTGCG、CCAGGTGTG或ACAGGTGTG的序列。在其他实施例中，公开了一种方法，包含选择性杂交Penta E基因座旁侧的至少第一引物、第二引物和第三引物，其中第一引物和第二引物在最接近的Penta E基因座重复的1，000个碱基对内，并且其中第一引物具有SEQ ID NO：1，2，3，4，5，6，7，8，9、ACAGGTGCG、CCAGGTGTG或ACAGGTGTG的序列，第二引物具有SEQ ID NO：1，2，3，4，5，6，7，8，9、ACAGGTGCG、CCAGGTGTG、或ACAGGTGTG的序列，其中第一引物和第二引物不共享相同的SEQ ID NO。在一些实施例中，第一引物、第二引物和第三引物不具有5′磷酸。在其他实施例中，标记第一引物和第二引物。在一些实施例中，标记第一引物、第二引物和第三引物。
在其他实施例中，标记第一引物，但不标记第二引物和第三引物。在一些实施例中，标记第一引物和第二引物，但不标记第三引物。在其他实施例中，每种引物用相同的标签标记。在一些实施例中，第一引物和第二引物用相同的标签标记。
术语“选择性地杂交”和其变体意指在恰当的严格性条件下，指定序列(例如(但不限于)引物)与包含一系列反向互补核苷酸的第二序列(例如(但不限于)靶标旁侧序列或扩增子的引物结合位点)退火，但不退火到不当序列，例如非靶核酸。
通常，随着反应温度朝向特定双链序列的解链温度增加，选择性杂交的相对量通常增加。一个序列与另一个序列杂交或选择性地杂交的声明涵盖其中两个序列均整体彼此杂交或选择性地杂交的实施例，和其中所述序列中的一个或两个仅一部分杂交或选择性地杂交到完整的另一个序列或另一个序列的一部分的实施例。
如本文中所用，术语“严格性”是指温度、离子强度和其他化合物存在的条件，在此条件下进行核酸杂交。在“高严格性”条件下，核酸碱基配对只发生在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间。因此，当需要将彼此不完全互补的核酸一起杂交或退火时，常需要“弱”或“低”严格性的条件。本领域可以采用许多等效条件来形成低严格性条件。
Label(标签)
“标签”是指直接或间接与核苷酸连接从而使分子可通过仪器或方法检测的部分。例如，标签可以是以下部分：(i)提供可检测信号或(ii)与第二标签相互作用以修饰由第一标签或第二标签提供的可检测信号。可以单独使用许多不同种类的标签，或者与一种或多种不同标签组合使用。荧光团是标签的一个实例。
“荧光团”是指在与生物化合物或金属离子结合时或在被酶代谢时的内在荧光或显示出荧光变化的部分。已知许多荧光团，其中的实例包括香豆素类、吖啶类、呋喃类、丹酰基类、氰基类、芘类、萘类、苯并呋喃类、喹啉类、喹唑啉酮类、吲哚类、苯并唑类、硼酸杂氮杂吲哚类、恶嗪类和黄嘌呤类，后者包括荧光素类、罗丹明类、玫瑰胺类和红豆杉类。
在一些实施例中，第一引物和第二引物用荧光团标记。在一些实施例中，第一引物、第二引物和第三引物用荧光团标记。
在其他实施例中，第一引物用荧光团标记，但第二引物和第三引物不是。在一些实施例中，第一引物和第二引物用荧光团标记，但第三引物不是。在其他实施例中，每个引物用相同的荧光团标记。在一些实施例中，第一引物和第二引物用相同的荧光团标记。
荧光团的更多实例包括：5-或6-羧基荧光素(FAMTM)、VICTM(分子量为550，吸光度最大值为538nm，发射最大值为554nm的染料)、NEDTM、TAZTM、SIDTM、JOETM、TMR-ET、CXR-ET、BTG、BTY、BTR2、BTP、BTO、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、IRD-700/800、花青染料(例如CY3TM、CY5TM、CY3.5TM、CY5.5TM、Cy7TM)、黄原胶、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEXTM)、6-羧基-1，4-二氯-2’，7’-二氯荧光素6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲基荧光素(JOETM)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRATM)、6-羧基-X-罗丹明(ROXTM)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、罗丹明BODIPY染料(如BODIPY TMR)、俄勒冈绿、香豆素(如伞形酮)、苯甲酰亚胺(如Hoechst33258)；菲啶类，例如Yakima Yellow、350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700、750、溴化乙锭)、吖啶染料、咔唑染料、吩恶嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料、Atto 390、Atto 425、Atto465、Atto 488、Atto 495、Atto520、Atto 532、Atto 550、Atto 565、Atto590、Atto 594、Atto 620、Atto 633、Atto 647N、Atto 655、Atto RhoG6、Atto Rhol l、Atto Rhol2、Atto Rhol0l、BMNTM-5、BMNTM-6、CEQ8000D2、CEQ8000 D3、CEQ8000 D4、DY-480XL、DY-485XL、DY-495、DY-505、DY-510XL、DY-521XL、DY-521XL、DY-530、DY-547、DY-550、DY-555、DY-610、DY-615、DY-630、DY-631、DY-633、DY-635、DY-647、DY-651、DY-675、DY-676、DY-680、DY-681、DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-732、DY-750、DY-751、DY-776、DY-780、DY-781、DY-782、CALGold 540、CALFluor RED 590、CAL Fluor Red610、CAL Fluor Red 635、700Dx、800CW、Yakima6-(4，7-二氯-2’，7’-二苯基-3’，6’-二新戊酰荧光素-6-羧酰胺基)-己基-1-0-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺(SIMA)、CALGold 540、CALOrange560、CAL Fluor Red 635、570、670、LIZ、Sunnyvale Red、LC610、LC640、LC670和LC705。
扩增
本发明提供了用于扩增Penta E STR基因座的多态性区域的方法、组合物和试剂盒。
核酸扩增技术传统上根据扩增过程的温度要求进行分类。等温扩增在恒定温度下进行，与需要在高低温循环的扩增相反。等温扩增技术的实例有：链置换扩增、自持序列复制、Qβ复制酶系统以及专利WO 90/10064和WO 9I/03573中公开的技术。
在一些实施例中，本文公开了一种用于人体鉴定的方法，包含杂交Penta E基因座旁侧第一引物和第二引物以及扩增Penta E基因座，其中扩增产生的扩增产物至少包含序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，并且其中扩增是等温扩增过程。
在一些实施例中，公开了一种用于人体鉴定的方法，包含使第一引物和第二引物与Penta E基因座杂交以及扩增Penta E基因座，其中所述扩增产生至少两种扩增产物，一种扩增产物包含SEQ ID NO：1且另一种扩增产物包含SEQ ID NO：2，并且其中扩增是等温扩增过程。在其他实施例中，扩增产生至少两种扩增产物，一种扩增产物包含SEQ ID NO：1，另一种扩增产物包含SEQ ID NO：3，并且其中扩增是等温扩增过程。在一些实施例中，扩增产生至少两种扩增产物，一种扩增产物包含SEQ ID NO：2，另一种扩增产物包含SEQ ID NO：3，并且其中扩增是等温扩增过程。
在一些实施例中，本文公开了一种方法，包含选择性地杂交Penta E基因座旁侧的至少第一引物和第二引物以及扩增Penta E基因座，其中第一引物在最接近的Penta E基因座重复的1，000个碱基对内，并包括序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、ACAGGTGCG、CCAGGTGTG或ACAGGTGTG，并且其中扩增是等温扩增过程。
需要温度循环的扩增技术实例是：聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应、连接酶检测反应(LDR)、LDR-PCR、链置换扩增、基于转录的扩增、限制性扩增(美国专利号5,102,784)、自持序列复制(或“3SR”)、基于核酸转录的扩增系统、Qβ复制酶系统和滚环扩增、杂交信号扩增、基于核酸序列的扩增、修复链反应、回旋镖DNA扩增和分支DNA方法。
PCR使用一对扩增引物，包括“上游”或“正向”引物和“下游”或“反向”引物，其限定待扩增的RNA或DNA区域。第一引物和第二引物可以是正向或反向引物并且在本文中可互换地使用并且不是限制性的。
在一些实施例中，本文公开了一种用于人体鉴定的方法，包含杂交Penta E基因座旁侧的第一引物和第二引物以及扩增Penta E基因座，其中扩增产生的扩增产物至少包含序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，并且其中扩增是需要热循环的扩增过程。在一些实施例中，需要热循环的扩增过程是PCR。
在一些实施例中，公开了一种用于人体鉴定的方法，包含使第一引物和第二引物与Penta E基因座杂交以及扩增Penta E基因座，其中所述扩增产生至少两种扩增产物，一种扩增产物包含SEQ ID NO：1，另一种扩增产物包含SEQ ID NO：2，并且其中扩增是需要热循环的扩增过程。在一些实施例中，需要热循环的扩增过程是PCR。在其他实施例中，扩增产生至少两种扩增产物，一种扩增产物包含SEQ ID NO：1，另一种扩增产物包含SEQ ID NO：3，并且其中扩增是需要热循环的扩增过程。在一些实施例中，需要热循环的扩增过程是PCR。在其他实施例中，扩增产生至少两种扩增产物，一种扩增产物包含SEQ ID NO：2，另一种扩增产物包含SEQ ID NO：3，并且其中扩增是需要热循环的扩增过程。在一些实施例中，需要热循环的扩增过程是PCR。
在一些实施例中，本文公开了一种方法，包含选择性地杂交Penta E基因座旁侧的至少第一引物和第二引物以及扩增Penta E基因座，其中第一引物在最接近的Penta E基因座重复的1，000个碱基对内，并包括序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、ACAGGTGCG、CCAGGTGTG或ACAGGTGTG，并且其中扩增是需要热循环的扩增过程。在一些实施例中，需要热循环的扩增过程是PCR。
样品
“样品”是指含有核酸的固体或液体。样品的实例包括全血、血浆、血清、唾液、口颊细胞、汗液、阴道分泌物、阴道细胞、精液、组织、尿液或脑脊液。用于培养细胞的液体培养基可以是样品。样品可以是其上收集有细胞的滤纸；例如，口颊细胞、血细胞、精液或阴道液。样品可以是已接触到表面的滤纸，例如其上有指纹的表面。样品可以是其上沉积有细胞的布料。例如，样品可以是其上涂有血液、唾液、精液或阴道液的布料。样品可以是拭子或其一部分，拭子上已经收集细胞；例如，口颊细胞、血细胞、精液或阴道液。拭子可以由诸如棉或NylonTM材料制成。样品可以是接触到表面的拭子；例如，其上有指纹、血液、唾液或阴道液的表面。样品可以是从与细胞接触的纸或棉签中提取的提取物；即应用了核酸提取方法以收集释放的核酸的纸或棉签。
在一些实施例中，本文公开了一种方法，包含使第一引物和第二引物与样品接触，使样品进行扩增反应，从而形成反应产物，其中反应产物包括SEQ ID No：1、2或3。在一些实施例中，样品是血液。在其他实施例中，样品是涂在纸上的血液。在一些实施例中，样品是口颊细胞。在其他实施例中，样品是涂在纸上的口颊细胞。在一些实施例中，样品是擦过表面的纸张。在一些实施例中，该表面具有指纹。在一些实施例中，第一引物具有序列SEQ IDNO：1，2，3，4，5，6，7，8，9、ACAGGTGCG、CCAGGTGTG或ACAGGTGTG。在其他实施例中，反应产物包含SEQ ID NO：1的5′末端14位的腺苷、SEQ ID NO：2的5′末端21位的胸苷，或SEQ ID NO：314位的腺嘌呤和21位的胸腺嘧啶。在一些实施例中，标记反应产物。在其他实施例中，标签为荧光团。在一些实施例中，扩增反应是PCR。
样品可以是混合的。也就是说，样品可以包括固体或液体，或者是含有源自一个以上个体的核酸的固体或液体。例如，混合样品可包含阴道分泌物或阴道细胞和精液。又或者例如，混合样品可以是来自两个以上人的细胞。在一些实施例中，样品是混合样品。
术语“扩增子”、“扩增产物”和“反应产物”在本文中可互换使用，并且是指用于以线性或指数方式增加多核苷酸序列的广泛技术，并且可以是扩增反应的产物。扩增子可以是双链或单链，并且可以包括通过使双链扩增产物变性获得的分开的组分链。在某些实施例中，一个扩增循环的扩增子可以充当后一扩增循环中的模板。例示性扩增技术包括(但不限于)PCR或采用引物延伸步骤的任何其他方法。扩增的其他非限制性实例包括(但不限于)连接酶检测反应(LDR)和连接酶链式反应(LCR)。扩增方法可包括热循环或可以等温执行。在各种实施例中，术语“扩增产物”包括来自任何数量的扩增反应循环的产物。
如本文所用，术语“鉴定”(indentification)和“身份”(identity)在本文中可互换使用，并且是指样品或生物样品来源的个体和/或性别的鉴定。
聚合酶
在一些实施例中，本文公开了包含非人类聚合酶、人基因组DNA和扩增产物的组合物，其中扩增产物包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。在一些实施例中，标记扩增产物。在其他实施例中，标签为荧光团。
“聚合酶”是催化核苷酸聚合的酶。DNA聚合酶催化脱氧核苷酸的聚合。
多种细菌衍生的核酸聚合酶可用于本文所述的方法、组合物和试剂盒中。例如，从栖热水生菌、嗜热栖热菌、噬热细菌、强烈火球菌、热带热球菌和海栖热袍菌分离的聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，T4 DNA聚合酶，T5 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶等。
在一些实施例中，本文公开了包含非人类聚合酶、人基因组DNA和扩增产物的组合物，其中扩增产物包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，并且其中所述非人类聚合酶是一种细菌DNA聚合酶。在一些实施例中，细菌DNA聚合酶是Taq聚合酶或其变异体。
任何上述酶的聚合酶活性可通过本领域已知的方法测定。例如，聚合酶活性可以测量为32P-dCTP掺入活化的鲑鱼精子DNA的速率。反应缓冲液可以是，例如，50mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇(DTT)、50μg/ml牛血清白蛋白(BSA)和4％(v/v)甘油。核苷酸底物和DNA被大量过量使用，通常至少为被测聚合酶Km的10倍，例如，dATP、dTTP和dGTP各为200μM，195μM dCTP加5μM标记的dCTP，和250μg/ml活化的DNA。将反应在冰上淬灭，并将反应混合物的等分试样点在离子交换过滤器上。洗涤未掺入的核苷酸，然后进行闪烁计数以测量掺入的放射性。
“基因组DNA”是指基因或基因区段的染色体DNA序列，包括非编码区的DNA序列以及编码区。基因组DNA还指直接从细胞或染色体分离的DNA或者全部或部分此类DNA的克隆拷贝。
在一些实施例中，公开了一种人体鉴定方法，包含从基因组DNA扩增Penta E基因座，检测扩增产物、扩增子，其中扩增子含有SEQ ID NO：1、2或3的序列，并且扩增子表明是人类。在一些实施例中，标记扩增子。在其他实施例中，标签为荧光团。
试剂盒
如本文中所用，术语“试剂盒”指用于传递物质的任何传递系统。在反应分析的情形下，这类传递系统包括允许从一个位置到另一个位置储存、输送或传递反应试剂(例如适合的容器中的寡核苷酸、酶、引物组等)和/或支持材料(例如缓冲液、进行分析的书面说明等)的系统。举例来说，试剂盒可包括一个或多个含有相关反应试剂和/或支持材料的外壳(例如盒子)。如本文所使用，术语“分部式试剂盒”指两个或更多个单独的容器的传递系统，每个单独的容器含有完整试剂盒组分的子部分。容器可共同或单独地递送到既定接收方。举例来说，第一个容器可含有用于分析的酶，而第二个容器含有寡核苷酸。实际上，在术语“分部式试剂盒”中包括任何包含两个或更多个单独容器的传递系统，所述容器各自含有全部试剂盒组分的子部分。相比之下，“组合式试剂盒”指在单个容器中(例如在收纳各种所需组分的单个盒子中)含有反应分析的所有组分的传递系统。术语“试剂盒”包括分部式和组合式试剂盒。
在其他实施例中，包括用于人体鉴定的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含至少一对用于PCR扩增Penta E基因座的寡核苷酸引物，其中引物对的第一引物在最接近的Penta E基因组重复的1，000个碱基对内，并且第一引物包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、ACAGGTGCG、CCAGGTGTG或ACAGGTGTG。在一些实施例中，所述试剂盒也包括等位基因分型标准物。如本文所用的术语“等位基因分型标准物”是指包含来自遗传标记的多个扩增等位基因的标准大小标记。在一些实施例中，标记第一引物。在其他实施例中，标签为荧光团。在一些实施例中，标记引物对的第二引物。在一些实施例中，标记引物对的第二引物而不是第一引物。
分析
通过分析单个扩增的序列或通过分析从多重反应获得的扩增产物的混合物，可以使用各种方法分析扩增的等位基因的产物。如本文所用的术语“等位基因”是指与基因或DNA链段相关的遗传变异，即，占据相同基因座的DNA序列的两种或两种以上替代形式中的一种。
术语“检测(detecting)”和“检测(detection)”在本文中在广义上使用并且涵盖可以确定核酸序列的存在或鉴别核酸序列的任何技术。在一些实施例中，检测包括对来自核酸的可检测信号进行定量，包括(但不限于)实时检测方法，例如定量PCR(“Q-PCR”)。在一些实施例中，检测包括使用扩增产物作为模板测定测序产物或测序产物家族的序列；在一些实施例中，所述检测包括获得测序产物家族的序列。
检测方法包括荧光标记产物、放射性同位素标记产物的检测、扩增产物的银染，或使用DNA嵌入染料如溴化乙锭(EtBr)和绿色花青染料以显现双链扩增产物。
在本教导中使用的适合于连接到引物的荧光标签很多。借由荧光分析，至少一种荧光标记引物可以用于扩增每个基因座。荧光检测可以是理想的，优于标记和产物检测的放射性方法，例如因为荧光检测不需要使用放射性材料，并且因此避免了伴随着放射性材料的使用的监管和安全性问题。还可以选择用标记的引物进行荧光检测，所述荧光检测优于其他非放射性检测方法，例如DNA嵌入剂和银染色，因为荧光检测方法一般展现出比银染色和DNA嵌入剂少的扩增假影。这部分由于以下事实：在荧光检测中只检测到上面连接有标签的DNA扩增链，而使用银染色和嵌入剂检测方法对每一个扩增产物的两条链均进行染色和检测，这导致了许多非特异性扩增假影的可视化。
在一些实施例中，在多重扩增反应中对引物进行荧光标记。如本文中所用，术语“多重”是指在单个扩增反应容器内同时发生的至少两个或更多个扩增反应。通常，至少两种不同的标签、至少三种不同的标签、至少四种不同的标签、至少五种不同的标签，以及至少六种或更多种不同的标签可用于标记两种、三种、四种、五种或至少六种不同的引物。当使用大小标记来评估多重反应的产物时，用于制备大小标记的引物可以用与扩增反应中相关基因座的引物不同的标签进行标记。随着自动荧光成像和分析的出现，可以实现对多重扩增产物的更快检测和分析。
在本发明传授内容的一些实施例中，可以使用荧光团来标记多重扩增的至少一个引物，例如通过共价结合到引物，由此产生经荧光标记的引物。在一些实施例中，多重分析中用于不同目标基因座的引物可以用不同荧光团标记，取决于荧光团的发射波长，每个荧光团产生带不同颜色的产物。这些不同标记的引物可以用于同一多重反应中，并且接着一起分析其各别扩增产物。可对扩增特异性基因座的引物对的正向或反向引物进行标记，但是更多时候可以对正向引物进行标记。
本教导的各种实施例可包括含有至少四种不同染料的单一多重系统。这些至少四种染料可包含任何四种上述染料，或能够产生可彼此区分的信号的任何其他四种染料，例如6-FAMTM、NEDTM和染料。其他实施例可以包括包含至少五种不同染料的单一多重系统。这些至少五种染料可包含任何五种上述染料，或能够产生可彼此区分的信号的任何其他五种染料，例如6-FAMTM、NEDTM、和染料。其他实施例可以包括包含至少六种不同染料的单一多重系统。这些至少六种染料可包含任何六种上述染料，或能够产生可彼此区分的信号的任何其他六种染料，例如6-FAMTM、NEDTM、和最大发射波长约为620nm的第六种染料(SIDTM)。在一些实施例中，可以使用TED染料或TAZ染料代替SID染料。本方法和组合物的各种实施例不限于任何固定数量的染料。
PCR产物可在筛分或非筛分介质上分析。在这些教导的一些实施例中，例如，可以通过电泳分析的PCR产物；例如，毛细管电泳，如H.Wenz et al.(1998)，Genome Res.8：69-80中所述(另请参阅E.Buel et al(1998)，J.Forensic Sci.43：(1)，pp.164-170)，或平板凝胶电泳，如M.Christensen et al.(1999)，Scand.J.Clin.Lab.Invest.59(3)：167-177)中所述，或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(参见J.Sambrook et al.(1989)Molucular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，pp.13.45-13.57)。电泳中DNA片段的分离主要基于不同的片段大小。扩增产物也可以通过色谱分析；例如通过大小排阻色谱(SEC)。
在一些实施例中，本文公开了包含标记的扩增产物的组合物，所述标记的扩增产物包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3以及筛分或非筛分介质。在其他实施例中，公开了包含标记的扩增产物的组合物，所述标记的扩增产物包含SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3，以及筛分或非筛分介质和大小标准。在一些实施例中，介质是性能优化聚合物(POP)。在其他实施例中，介质是聚合的聚丙烯酰胺。在其他实施例中，所公开的组合物包括两种或更多种标记的扩增产物，其中一种标记的扩增产物包含SEQ ID NO：1，另一种标记的扩增产物包含SEQ ID NO：2以及筛分或非筛分介质。在其他实施例中，组合物还包含大小标准。在一些实施例中，介质是性能优化聚合物(POP)。在其他实施例中，介质是聚合的聚丙烯酰胺。在其他实施例中，扩增产生至少两种标记的扩增产物，一种标记的扩增产物包含SEQ ID NO：1，另一种标记的扩增产物包含SEQ ID NO：3以及筛分或非筛分介质。在其他实施例中，组合物还包含大小标准。在一些实施例中，介质是性能优化聚合物(POP)。在其他实施例中，介质是聚合的聚丙烯酰胺。在一些实施例中，扩增产生至少两种标记的扩增产物，一种标记的扩增产物包含SEQ ID NO：2，另一种标记的扩增产物包含SEQ ID NO：3以及筛分或非筛分介质。在其他实施例中，组合物还包含大小标准。在一些实施例中，介质是性能优化聚合物(POP)。在其他实施例中，介质是聚合的聚丙烯酰胺。
在使用荧光染料标记扩增产物的情况下，可以使用荧光检测设备分析电泳和分离的产物，例如ABI310或3130xl型遗传分析仪，或ABI377 DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)；或Hitachi FMBIOTM II荧光扫描仪(HitachiSoftware Engineering America，Ltd.，CA)。在本教导的各种实施例中，PCR产物可以通过毛细管凝胶电泳方案结合诸如ABI3130xl型遗传分析仪(Applied Biosystems)等电泳仪器进行分析，并且可以使用Applied Biosystems的ID Softwarev3.2进行电泳扩增产物的等位基因分析。在其他实施例中，扩增产物可以通过电泳分离，例如，按ABI377自动荧光DNA测序仪所制备的约4.5％，29∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺，8M尿素凝胶。
在一些实施例中，检测步骤可以与扩增步骤组合，例如，但不限于熔解曲线测定。用于进行检测步骤的示例性方法包括ABI基因分析仪仪器系列，ABI序列检测系统仪器系列，以及StepOneTM和Applied Biosystems实时PCR仪器系列(均来自Applied Biosystems)；以及可从Affymetrix、Agilent和Amersham Biosciences等公司(另请参阅Gerry et al.，J.Mol.Biol.292：251-62，1999；De Bellis et al.，MinervaBiotec.14：247-52，2002；以及Stears et al.，Nat.Med.9：140-45，包括2003年新增的补充材料)购得的市售微阵列和分析系统，或珠阵列平台(Illumina，San Diego，CA)。示例性软件包括GeneMapperTM软件、分析软件、软件和RapidFinderTM软件(均来自Applied Biosystems)。
在一些实施例中，通过监测反应混合物中双链DNA总量的增加来检测扩增的等位基因，如下列文献和专利所述：Higuchi et al.，1992，BioTechnology 10：413-417；Higuchi et al.，1993，BioTechnology 11：1026-1030：以及European PatentPublication Nos.487，218和512，334，此处每一条都通过引用合并到本文中。双链靶DNA的检测依赖于溴化乙锭(EtBr)和其他DNA结合标记物与双链DNA结合时所表现出的增强的荧光。由于靶序列的合成而导致的双链DNA的增加引起可检测到的荧光增加。
虽然已经结合特定实施例描述了本发明的原理，但是应明确了解，这些描述仅仅是为了举例并且不打算限制本发明的范围。已经出于说明和描述的目的提供了本文中已经公开的内容。这并不打算是穷尽性的或将所公开的内容限制于所述的精确形式。许多修改以及变化对于所属领域的技术人员来说将是显而易见的。选择并描述所公开的内容以便最佳地解释所述领域所公开的实施例的原理和实际应用，由此使得所属领域的其他技术人员能够了解适合于所涵盖的特定用途的各个实施例和各种修改。公开内容的范围打算由以下权利要求书和其等效物限定。
实例
DNA样品制备
对约1500个匿名华裔(注意SNP只在西藏样品中发现)的人体样本进行了广泛的人群研究，这些样本均来自试纸全血和口腔拭子。纸上的血液直接PCR扩增。用Prep-n-GO裂解缓冲液处理口腔拭子，然后用直接扩增裂解液。
扩增
基于以下反应制备了PCR反应混合物：
体积计算要包括足够的额外3个反应的试剂，以提供在试剂转移期间发生的潜在损失的过量体积。中速涡旋10秒以混合试剂，然后进行短暂离心以抽出可能积聚在盖子中的任何液体。将25μL的PCR反应混合物放入每个反应瓶中，然后加入样品(1.2毫米圆盘)。盖上管或孔，并在3000rpm下短暂离心约30秒以除去任何气泡并确保在扩增前将圆盘置于小瓶或孔的底部。
在MicroAmpTM 96孔反应板中建立PCR反应，所述反应板由MicroAmp 8联排管盖或MicroAmp透明胶膜覆盖。根据以下热循环条件扩增样品：在95℃下初始孵育1分钟，在94℃下孵育10秒变性，59℃孵育1.5分钟退火30个循环，最后在60℃延伸10分钟，所得反应物可以无限期地在4℃保持。当使用配有96-孔银制或镀金银制基座(block)的GeNAMP PCRSystem 9700时，选择最大模式(Max Mode)。
克隆和测序
通过用包含Penta E基因座重复序列的引物首先PCR扩增血样，进行不一致等位基因的PCR克隆和测序。使用用于测序的TOPOTM TA克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)克隆PCR产物，并且细菌转化产生许多菌落。对于每个样品，通过在水中将菌落稀释10-6倍，使用Penta E引物PCR扩增25个循环，并使用Applied Biosystems 3500xl型遗传分析仪(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)进行筛选，筛选10个细菌菌落的不一致等位基因。挑取含有不一致等位基因的菌落和许多挑选的含有一致等位基因的对照菌落培养过夜，用Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化这些菌落的质粒DNA。使用BigDyeTerminator v1.1循环测序试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，按照制造商的建议使用M13正向和反向引物进行测序。使用大约200ng质粒DNA进行测序反应，并使用BigDye XTerminatorTM纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)除去未掺入的染料终止子。在36cm毛细管阵列上，使用Performance Optimized Polymer(POP-4TM聚合物)在Applied Biosystems3130xl型遗传分析仪上对样品进行电泳。使用DNA测序分析软件v5.2(Thermo Fisher Scientific)分析序列。

Claims (10)

1.一种方法，包括：
a.将第一引物与待分析的样品接触；
b.将第二引物与样品接触；
c.将核酸样品、第一引物和第二引物进行扩增反应，从而形成扩增产物，其中第一引物、第二引物或第一引物和第二引物均用非核酸标签标记，其中反应产物包含SEQ ID NO：1的5′末端14位的腺苷、SEQ ID NO：2的5′末端21位的胸苷或SEQ ID NO：314位的腺嘌呤和21位的胸腺嘧啶。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括根据长度分离扩增产物，从而形成分离的扩增产物。
3.根据权利要求2所述的方法，还包括将扩增产物与等位基因分型标准物进行比较，从而确定Penta E基因座重复数。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述分离通过毛细管凝胶电泳进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述非核酸标记物是荧光团。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品选自口腔细胞、血液、纸上血液、纸上口腔细胞、组织、尿液、唾液、阴道细胞、皮肤、纸上指纹。
7.一种包含非人类聚合酶、人基因组DNA和标记扩增产物的组合物，其中标记扩增产物包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。
8.一种包含标记扩增产物的组合物，所述扩增产物包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3和筛分或非筛分培养基。
9.根据权利要求8所述的组合物，还包含一种大小标准。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述筛分培养基是性能优化的聚合物。
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