JP5900908B2 - 一塩基反復多型解析方法及び一塩基多型解析方法 - Google Patents
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Description
〔1〕一塩基反復多型中の反復数を解析する方法であって、以下のステップ:
(a)対象となる一塩基反復が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップであって、該遺伝子型判定マーカー中に含まれる各核酸断片は、該一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有するステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップであって、該被験核酸断片は該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片とは異なる標識物質を用いて標識されているステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該被験核酸断片における対象となる一塩基反復中の反復数を判定するステップ
を含む、上記方法。
(a)対象となる一塩基反復が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップであって、該遺伝子型判定マーカー中に含まれる各核酸断片は、続く分離処理において、該一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有する核酸断片とそれぞれ類似する挙動を示すものであるステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップであって、該被験核酸断片は該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片とは異なる標識物質を用いて標識されているステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該被験核酸断片における対象となる一塩基反復中の反復数を判定するステップ
を含む、上記方法。
(a)対象となる一塩基多型が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップであって、該遺伝子型判定マーカー中に含まれる各核酸断片は、該一塩基多型の近傍に存在する一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有するステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップであって、該被験核酸断片は該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片とは異なる標識物質を用いて標識されているステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該被験核酸断片における対象となる一塩基多型を判定するステップ
を含む、上記方法。
(a)対象となる一塩基多型が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップであって、該遺伝子型判定マーカー中に含まれる各核酸断片は、続く分離処理において、該一塩基多型の近傍に存在する一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有する核酸断片とそれぞれ類似する挙動を示すものであるステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップであって、該被験核酸断片は該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片とは異なる標識物質を用いて標識されているステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該被験核酸断片における対象となる一塩基多型を判定するステップ
を含む、上記方法。
〔6〕前記核酸領域がゲノム領域である、上記〔1〕〜〔5〕のいずれか1つに記載の方法。
〔7〕前記遺伝子型判定マーカー中の各核酸断片が、前記対象となる一塩基反復中の反復数において1ずつ異なる配列を有する、上記〔1〕〜〔6〕のいずれか1つに記載の方法。
〔8〕前記分離処理をキャピラリー電気泳動により行う、上記〔1〕〜〔7〕のいずれか1つに記載の方法。
〔9〕前記遺伝子型判定マーカー中の核酸断片が、1種類の標識物質を用いて標識されている、上記〔1〕〜〔8〕のいずれか1つに記載の方法。
〔10〕前記標識が蛍光標識である、上記〔1〕〜〔9〕のいずれか1つに記載の方法。
〔11〕前記核酸領域が細菌のゲノム領域である、上記〔1〕〜〔10〕のいずれか1つに記載の方法。
〔12〕前記細菌がヨーネ菌である、上記〔11〕に記載の方法。
〔13〕前記核酸領域が配列番号1又は2に示される配列又は該配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、上記〔1〕〜〔12〕のいずれか1つに記載の方法。
〔14〕対象となる一塩基反復多型又は一塩基反復の近傍に存在する一塩基多型が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する、標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカー、及び該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する核酸領域を増幅するためのプライマーペアを少なくとも含む、一塩基反復多型中の反復数又は一塩基多型を解析するためのキット。
(a)対象となる一塩基反復が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップであって、該遺伝子型判定マーカー中に含まれる各核酸断片は、該一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有するステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップであって、該被験核酸断片は該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片とは異なる標識物質を用いて標識されているステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該被験核酸断片における対象となる一塩基反復中の反復数を判定するステップ
を含む、一塩基反復多型中の反復数を解析する方法に関する。
(a)対象となる一塩基反復が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップであって、該遺伝子型判定マーカー中に含まれる各核酸断片は、続く分離処理において、該一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有する核酸断片とそれぞれ類似する挙動を示すものであるステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップであって、該被験核酸断片は該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片とは異なる標識物質を用いて標識されているステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該被験核酸断片における対象となる一塩基反復中の反復数を判定するステップ
を含む、一塩基反復多型中の反復数を解析する方法にも関する。
(a)対象となる一塩基多型が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップであって、該遺伝子型判定マーカー中に含まれる各核酸断片は、該一塩基多型の近傍に存在する一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有するか、又は続く分離処理において、該一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有する核酸断片とそれぞれ類似する挙動を示すものであるステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップであって、該被験核酸断片は該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片とは異なる標識物質を用いて標識されているステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該被験核酸断片における対象となる一塩基多型を判定するステップ
を含む方法により、一塩基反復の近傍に存在する一塩基多型を解析する方法も提供する。
(a)配列番号1又は2に示される配列を含む標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより標識被験断片を得るステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該核酸断片における対象となる一塩基反復中の反復数(又は一塩基多型)を判定するステップ
を含む、ヨーネ菌の遺伝子型判定方法に関する。
標識核酸断片の調製
ATCC(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)から購入したヨーネ菌参照株1〜4(それぞれ、受託番号ATCC19698、ATCC49164、ATCC700535、及びATCC19851)、並びに国内のヨーネ病発症事例から分離されたヨーネ菌野外株1〜11(独立行政法人 農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究所にて、VNTR型別に関する共同研究及び病性鑑定等のために収集された株の一部)を、それぞれ、マイコバクチン添加ハロルド(Harrold)卵黄寒天培地上で37℃、3ヶ月間培養し、コロニーを形成させた。各サンプルのコロニーを、200μLの核酸精製試薬インスタジーンマトリックス(Bio−Rad社製)に添加し、56℃にて30分間加温した後、ボルテックスで10秒間撹拌し、沸騰水上で100℃にて8分間処理した。再度ボルテックスで10秒間撹拌した後、12000rpmにて3分間遠心分離した。得られたサンプルは、使用まで−20℃で保存した。使用時に、溶解後、ボルテックスで10秒間撹拌し、12000rpmにて3分間遠心分離し、上清を鋳型溶液として後のPCR増幅で用いた。
M1−F2−Vic(配列番号3)
M1−R2−Tailed(配列番号4)
M2−F2−Fam(配列番号5)
M2−F2−Vic(配列番号5)
M2−R2−Tailed(配列番号6)
T2−F3−Ned(配列番号8)
T2−R3−Tailed(配列番号9)
蒸留水 57μL
10×Goldバッファー 10μL
8mM dNTP 10μL
25mM MgCl2 6μL
DMSO 4μL
25μM標識プライマー 2μL
25μMテイルドプライマー 2μL
Taq Goldポリメラーゼ 1μL
合計 92μL
プレヒート 95℃5分
36サイクル 変性ステップ 95℃10秒
アニーリング 67℃30秒
伸長ステップ 72℃60秒
反応終了 10℃
得られたPCR産物は、以下の5種類である:
M1−Fam
M1−Vic
M2−Fam
M2−Vic
T2−Ned
M1(配列番号1):GCGGTGTTCGGCAAAGTCGTTGTGCCGGGCGGCGTTTGGCCCGCGGACGTGCTGCCGGAGCCCGGGGCGATGCCGGTCACCACCCAGTGCACGTACGSCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGGGCGTCGGGGTCGTCGACCACCAGGGCCGCACCCGTTGGCGCGGACCACGCCAGCGGCGGTGCGATGCCCTCGCCCTTGCAGGTGTACCGCGGCGGGATCGGGGCGCCGTCGGTGAATGCCGGGCTGGTGATCGTCAA(SはC又はG)
M2(配列番号2):TGCTCAGCAGCCAGGTAGTCCGCATCCCGTGCCGCTCGATGCCGCTCGGCAGACCTGTGGTGGGCTTCGACGTCACCGAAGCCCCCCCCCCGGCAGCTCTGTCGTGCAACTGCGCGGCACGCTCATGGGCATCGCCGGCGGACAGGCGGGCCGCATGCAGACGTTCACGTGCCGCCGCGACACGCTCGGCCGCCTCATCAGCGGACCTACGTGCGGCTCCCGAAACTCTGGACCGCCGTTCGGCGTCGTCGCTCATGCGGCACCTCCAAGCCCACAACGCTAC
T2(配列番号7):CAACGACAATGCCACCGACAATGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCCTCCACGCCATCGACCGGCGGTCAAGCCTTCGGCGCCGCCCCGCCGGGTCAGCCCGGCACGTCGGGCGACCCCACGCCGGGCGGCAGCACGCCGGTCAGCGCGACCGCCAAGGGATCGACCCTGACC
得られたPCR産物をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、コスモアイ(カイノス社製)キャピラリー電気泳動装置を用いて純度及びDNA量を測定した。この精製PCR産物を鋳型として、5’末端に蛍光標識もテイル配列も付加されていない上記配列を有するプライマーを用いて、BigDye Terminater v3.1(アプライド・バイオシステムズ社製)を用いてサイクルシーケンス反応を行った。ターミネーター反応生成物精製カラムにより反応液から未反応の標識物質等を除去した後、ジェネティックアナライザApplied Biosystems3130(50cmキャピラリー、POP−7)又はABI PRISM(登録商標)3100(80cmキャピラリー、POP−4)にてシーケンス解析を行った。アライメント解析はGENETYX−MAC遺伝子情報処理ソフトウェアを用いて実施した。
(カッコ内は
VNTR型別)
参照株1 (7) (10) (5)
(Map−1)
参照株2 (7) (10) (6)
(Map−1)
参照株3 (15、16、17、 (10、11) (5)
(Map−1) 18、19)
参照株4 (10) (9) (5)
(Map−1)
野外株1 (15、16、17、 (10) (4)
(Map−2) 18)
野外株2 (8) (11) (5)
(Map−1)
野外株3 (9) (11、12) (5)
(Map−1)
野外株4 (11) (10) (5)
(Map−1)
野外株5 (13、14) (10) (4)
(Map−2)
野外株6 (14、15、16) (10、11) (4)
(Map−2)
野外株7 (18、19、20、 (10、11) (4)
(Map−2) 21)
野外株8 (8) (10) (5)
(Map−1)
野外株9 (9) (11) (6)
(Map−1)
野外株10 (9) (9) (5)
(Map−1)
野生株11 (9) (13、14) (5)
(Map−1)
上記で明らかになった反復数から、M1領域及びM2領域のそれぞれについて、可能な範囲の反復数(M1:7〜21;M2:10〜14)を網羅するように菌株の組み合わせを選択し、標識PCR産物を混合し、遺伝子型判定マーカーを作製した。具体的には、M1領域については、参照株1及び野外株2〜7から得られたVIC標識PCR産物を混合することにより、M2領域については参照株1及び野外株2、3、11から得られたFAM標識PCR産物を混合することにより、遺伝子型判定マーカーを得た。混合する際には、上記の波形解析から各PCR産物の配合割合を決定し、それぞれの反復数のピーク高ができるだけ均一となるように配合割合を決定した。
一塩基反復多型の解析として、断片長が1塩基レベルで判別できる電気泳動法、特に蛍光標識した核酸試料についてのキャピラリー電気泳動による解析は有望である。しかしながら、通常用いられる既定のフラグメント長を有する標準との比較のみからは、反復数の正確な判別は困難であった。また、キャピラリー電気泳動では、個々のランごとに若干の移動度の差異があり、このことにより、核酸試料を個別に電気泳動に供することのみによる一塩基反復の反復数の正確な判定はますます困難なものとなっていた(図2を参照)。さらに、上記で示されたように、単一検体から分離された菌株の中に、遺伝子型が異なる複数の菌株が含まれている場合があるため、このことが、一塩基反復の解析をさらに困難なものとしていた(図3の「参照株3」を参照)。
本発明者らは、上記のような遺伝子型判定マーカーを用いた一塩基反復多型の解析を実現する過程で、この遺伝子型判定マーカーにより一塩基多型(SNP)も解析することが可能である場合があることを見出した。
配列番号2:M2領域
配列番号3〜6:プライマー
配列番号7:T2領域
配列番号8及び9:プライマー
Claims (12)
- 一塩基反復多型中の反復数を解析する方法であって、以下のステップ:
(a)対象となる一塩基反復が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップであって、該遺伝子型判定マーカー中に含まれる各核酸断片は、続く電気泳動による分離処理において、該核酸断片と同じ標識物質で標識された、該一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有する2種以上の核酸断片とともに、異なる反復数を有する各分離ピークにおいて単一ピークを形成するステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップであって、該被験核酸断片は該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片とは異なる標識物質を用いて標識されているステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、電気泳動による分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該被験核酸断片における対象となる一塩基反復中の反復数を判定するステップ
を含む、上記方法。 - 一塩基反復とともにPCR増幅される核酸領域に存在する一塩基多型を解析する方法であって、以下のステップ:
(a)対象となる一塩基多型が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップであって、該遺伝子型判定マーカー中に含まれる各核酸断片は、続く電気泳動による分離処理において、
該核酸断片と同じ標識物質で標識された、該一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有する2種以上の核酸断片とともに、異なる反復数を有する各分離ピークにおいて単一ピークを形成するステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップであって、該被験核酸断片は該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片とは異なる標識物質を用いて標識されているステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、電気泳動による分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該被験核酸断片における対象となる一塩基多型を判定するステップ
を含む、上記方法。 - 前記核酸断片がDNA断片である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記核酸領域がゲノム領域である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子型判定マーカー中の各核酸断片が、前記対象となる一塩基反復中の反復数において1ずつ異なる配列を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記電気泳動による分離処理をキャピラリー電気泳動により行う、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子型判定マーカー中の核酸断片が、1種類の標識物質を用いて標識されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識が蛍光標識である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸領域が細菌のゲノム領域である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌がヨーネ菌である、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸領域が配列番号1又は2に示される配列又は該配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 対象となる一塩基反復多型が生じ得ることが知られている核酸領域、又は一塩基反復とともにPCR増幅され、且つ対象となる一塩基多型が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する、標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカー、及び該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する核酸領域を増幅するためのプライマーペアを少なくとも含む、一塩基反復多型中の反復数又は一塩基多型を解析するためのキットであって、該遺伝子型判定マーカーは、それに含まれる核酸断片と同じ標識物質で標識された、該一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有する2種以上の核酸断片とともに、異なる反復数を有する各分離ピークにおいて単一ピークを形成する遺伝子型判定マーカーである、上記キット。
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