CN109477139B - 使用长ssDNA多核苷酸作为PCR测定中的引物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种执行PCR测定的方法,其包括以下步骤:a.获得核酸样品;b.使核酸样品与一对或多对引物杂交,其中至少一种引物由60个以上核苷酸长的单链DNA多核苷酸组成;c.对所述核酸样品进行PCR,其中反应混合物介质含有所述引物中的至少一种;和d.检测扩增的产物的长度。扩增的核酸可以含有任何一个或多个STR(短串联重复)序列、在基因组上具有确定位置的基因或任何编码区。优选的待扩增的核酸样品是降解或片段化的核酸并且含有一种或多种遗传标志物。
Description
技术领域
本发明涉及使用长ssDNA多核苷酸作为单重和多重聚合酶链式反应(PCR)的引物的核酸扩增反应和测定,更具体地涉及无需扩增更长的靶外(off-target)序列而获得合适长度的PCR产物由此允许扩增短的、片段化和降解的核酸的方法。
背景技术
检测和鉴定个体和物种之间的DNA序列变化已提供了对进化关系、遗传病、获得性病症以及分子遗传学和医学的其它方面的深入认知。
在许多情形中,这些变化可能涉及从数个核苷酸到仅单个核苷酸的不同长度的DNA。特别是,检测短串联重复序列(STR)的数目变化是具挑战性的任务,其目标在于提供在分子生物学领域、尤其是遗传同一性领域的新进展。这在一些公开文献中有所描述:Litt和Luty(1989)Am J.Hum Genet 3(4):599-605;Tautz,D(1989)NAR17:6463-6471,Weber和May(1989)Am J Hum Genet 44:388-396;Edwards,A.等,(1991)Am.J.Hum.Genet.49:746-756,Hammond,H.A.等,(1994)Am.J.Hum.Genet.55:175-189,Fregeau,C.J.;和Fourney,R.M.(1993)Bio Techniques 15(1):100-119;Schumm,J.W.等,(1994),第四届国际人类鉴别论坛(The Fourth International Symposium on Human Identification)1993,177-187页;Edwards等,(1991)Nucleic Acids Res.19:4791;Chen等,(1993)Genomics 15(3):621-5,Harada等,(1994)Am.J.Hum.Genet.55:175-189,Comings等,(1995),Genomics 29(2):390-6,Utah Marker Development Group(1995),Am.J.Genet.57:619-628,Jurka和Pethiyagoda(1995)J.Mol.Evol.40:120-126);US 5,582,979,US 5,364,759,US 6,479,235 B1和德国专利DE 38 34 636 C2。
传统上,对STR变化的分析如下进行:对来自DNA样品的选定遗传标志物进行PCR扩增,然后使扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或毛细管电泳(CE)柱,以确定所存在的等位基因的不同长度。PCR扩增中所用的寡核苷酸引物通常用不同的染料进行荧光标记,以允许在CE柱中检测到扩增子。反应通常以涉及同时扩增和检测数个DNA靶标的多重形式进行。
基于DNA长度的这些方法的关键一点在于来自不同标志物的产物必须总是具有不同的尺寸,以避免在其检测期间有任何重叠。在使用不同的荧光染料时,对于用相同染料标记的产物也有同样的顾虑。由于能容易地使用和检测的荧光染料的数量有限,设计了多重方法中的PCR引物来针对每种荧光染料获得具有不同的非重叠尺寸的数种产物。然而,这需要扩增额外的更长的靶外DNA区域来而获得所需的长度,由此影响了常见于DNA样品中的短的、片段化和降解的DNA模板的扩增。
对于在法医学、组织相容性、亲缘关系研究和DNA数据库方面的STR应用,目前可获得若干种商业和非商业的试剂和试剂盒。在这些和其它系统中的一部分中使用的引物和扩增子描述于John M.Butler和Dennis J.Reeder建立的NIST短串联重复DNA互联网数据库中(NIST Short Tandem Repeat DNA Internet Database,John M.Butler和DennisJ.Reeder创建,http://www.cstl.nist.gov/strbase/index.htm),而一些其它的专有序列则未公开。当前,主要的制造商(Promega Corp.,Madison,Wisconsin and Thermo FisherScientific Inc.,Waltham,Massachusetts)所使用的大多数技术依赖于扩增数个更长的靶外序列以获得有序分布的扩增子,其通常在80至450碱基对范围内。
DNA样品的降解和片段化影响生物分子测定的完整性和灵敏度。专利文献US2016/0168644A1教导了通过确定给定DNA样品的长与短PCR扩增产物量之比来对这种核酸片段化/降解及其“可扩增性(amplificability)”进行定量分析的方法。
Whitaker JP等(Whitaker JP,Clayton TM,Urquhart AJ等,(BioTechniques(1995);18:670-677))和Butler JM等(Butler JM,Shen Y,McCord BR.(J Forensic Sci(2003);48))已描述了使用小型STR来减少DNA扩增的延伸并由此改善降解的DNA样品中PCR产率。在该方法中,小型(mini)STR引物靶向与重复序列邻接的区域,以减小扩增所需重复序列时所必需的完整DNA长度。然而,这总是造成约100bp的短DNA扩增子,由此因其在电泳凝胶或CE电泳图中的重叠而限制了能用在多重测定中的可能的小型STR的数目。
专利US 6,743,905B2教导了合成和使用连接至序列特异性核碱基聚合物的迁移率改性聚合物的方法。通过将有机链引入引物内,该迁移率改性聚合物能够提供更大的DNA扩增子而无需将该DNA等价物实际扩增至其长度,从而减小了扩增程度。由于迁移率改性聚合物是无法扩增的,为了检测该增加的扩增子尺寸,通常将该聚合物连接至检测分子(例如,荧光染料)以在并入迁移率改性剂时检测DNA链。这将该聚合物的长度限制为仅短尺寸,以避免迁移率改变的聚合物引物与带标记的PCR产物的重叠。迁移率改性剂目前用于某些遗传标志物,例如商业试剂盒IdentifilerTM(Thermo Fisher Scientific Inc)中的CSF1PO(John M.Butler和Dennis J.Reeder建立的NIST短串联重复DNA互联网数据库(http://www.cstl.nist.gov/strbase/index.htm))。
传统上在PCR中使用18至25个核苷酸的DNA寡核苷酸引物。在某些应用中,也可以使用更长的引物来将标签、接头序列或其他所需序列引入所得的扩增产物中。在这些情形中,通常将约10至20个核苷酸的侧翼非互补序列添加至互补序列上,从而产生至多约45个核苷酸长的引物。例如,专利文献US 2013/0115605A1描述了通过使用短于70个核苷酸的接头序列和70个核苷酸以上的长延伸引物进行PCR来产生长DNA片段以构建基因的方法。Trichas G.等已通过扩增用于在转基因小鼠中进行双顺反子表达的靶序列来在质粒构建中使用了106个核苷酸的长反向引物(Trichas G.,Begbie J.,Srnivas S.,BCM Biology,(2008)6:40)。此外,长ssDNA多核苷酸(由DNA制造商IDT(Integrated DNA Technologies,Coralville,Iowa)商业命名为UltramersTM)已用在PCR中,多数是作为定量PCR(ViljoenCD.,Thompson G.G.,Sreenivasan S.,Gene,(2013)Mar 1;516(1):143-5)、基因构建(Gibson D.,Nucleic Acids Res,(2009)37(20):6984-6990)和诱变(Sabel,J.,Mutagenesis Application Guide,(2011),Integrated DNA Technologies)中的拷贝数标准物。
因此,便利的是存在一种无须扩增更长的靶外序列而获得合适长度的PCR产物的方法,然后专注于仅扩增特定的和具有信息的靶序列。
发明内容
本发明的目的在于提供长单链DNA(ssDNA)多核苷酸代替通常的更短的DNA寡核苷酸作为引物的用途,由此无需实际扩增额外的DNA区域而产生更大的扩增子。由于减少了给定的引物对之间所需的模板长度,PCR测定的性能得到极大提升,特别是在降解的DNA样品中,如此前使用小型STR所显示出的。
本发明的另一个目的在于提供一种执行聚合酶链式反应(PCR)的方法,该方法包括以下步骤:
a.提供核酸样品;
b.使所述核酸样品与一对或多对引物杂交,其中,至少一种引物由60个以上核苷酸长的单链DNA多核苷酸组成;
c.对所述核酸样品进行PCR,其中反应混合物介质含有所述引物中的至少一种;和
d.检测扩增产物的长度。
本发明的再一个目的在于提供一种执行聚合酶链式反应(PCR)的方法,其中靶序列可以从适于PCR技术的任何核酸扩增,例如,基因组DNA、线粒体DNA、质粒DNA、病毒DNA或RNA、循环胞外游离DNA、合成DNA和信使RNA。优选的待扩增样品是降解的或片段化的编码遗传标志物序列的核酸。该方法允许获得合适尺寸的扩增子以便在模板中存在降解的或片段化的靶序列时检测这些扩增子。
本发明的又一个目的在于提供一种执行聚合酶链式反应(PCR)的方法,其中至少一个引物的长度为60至300个核苷酸。对于任何本领域技术人员可能显而易见的是,长于300个核苷酸的引物也可以用在所描述的方法中,这些引物也计入本发明的方法中。长ssDNA引物与靶序列可以完全互补或可以不完全互补,例如,虽然具有与靶互补的3'-引发(priming)序列,其可能在5'端区域具有异源的非互补序列。反应中存在的引物中的一种或一些可以通过若干种手段来标记,例如附接荧光染料、发光部分、抗原、半抗原或任何其它产生信号的标签。
本发明的再一个目的在于提供一种执行聚合酶链式反应(PCR)的方法,其中所述方法可以涉及同时扩增若干种不同的核酸靶序列的若干对引物的杂交,其中每种靶序列是遗传标志物;且其中引物和靶序列在同一反应混合物中。因此,所述方法可以用在采用不同的引物对数量的不同PCR形式中,如在单重、双重、三重和多重测定中。
本发明的又一个目的在于提供一种通过聚合酶链式反应(PCR)在降解的核酸样品中检测遗传标志物的方法,该方法包括以下步骤:
a.提供含有一种或多种遗传标志物的核酸样品;
b.使所述核酸样品与一对或多对引物杂交,其中,至少一种引物由60个以上核苷酸长的单链DNA多核苷酸组成;
c.对所述核酸样品进行PCR,其中反应混合物介质含有所述引物中的至少一种;和
d.检测扩增产物的长度。
本发明的另一个目的在于提供包含一对或多对引物的PCR试剂盒,其中,至少一种引物的长度为60个核苷酸以上。
本发明的再一个目的在于提供一种PCR试剂盒,其包含一种或多种DNA聚合酶、dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷酸)、缓冲剂、盐、对照模板、尺寸标准物以及扩增和检测PCR产物所需的所有其它成分。
附图说明
视为发明的主题在说明书的结尾部分特别指出并明确要求保护。然而,参考以下附图可以最好地理解本发明与其目的、特征和优点,其中:
图1显示了待扩增的DNA区上的不同引物的位置。在序列表中包括了每个所描述的引物的序列。
图2:图2A显示了琼脂糖凝胶电泳中的对2800M DNA(Promega)的CSF1PO基因座进行扩增的结果:泳道1:100bp Ladder(Promega);泳道2:采用16HS引物CSFFW2416HSJ/CSFRV2216HS的345bp条带;泳道3:采用16HS引物CSFFW2416HSJ/CSFRV2216HS的NTC;泳道4:采用引物CSFFW2416HS/CSFRV60J的370bp条带;泳道5:采用引物CSFFW2416HS/CSFRV60J的NTC;泳道6:采用引物CSFFW120/CSFRV60J的370bp条带;泳道7:采用引物CSFFW120/CSFRV60J的NTC;泳道8:采用引物CSFFW200/CSFRV60J的370bp条带;泳道9:采用引物CSFFW200/CSFRV60J的NTC;泳道10:100bp Ladder(Promega)。图2B显示了采用引物CSFFW2416HSJ/CSFRV2216HS和CSFFW200(200nt)/CSFRV60J(60nt)进行的CSF1PO扩增的图。
图3A显示了CE电泳图中的采用不同DNA模板对基因座CSF1PO进行扩增的结果。电泳图#1:采用引物CSFFW120/CSFRV60J时的2800M DNA;电泳图#2:采用引物CSFFW120/CSFRV60J时的9947A DNA;电泳图#3:采用引物CSFFW120/CSFRV60J时的9948DNA;电泳图#4:采用引物CSFFW120/CSFRV60J时的K562DNA;电泳图#5:采用引物CSFFW200/CSFRV60J时的NTC对照;电泳图#6:采用引物CSFFW200/CSFRV60J时的2800M DNA;电泳图#7:采用引物CSFFW200/CSFRV60J时的9947DNA;电泳图#8:采用引物CSFFW200/CSFRV60J时的9948 DNA;电泳图#9:采用引物CSFFW200/CSFRV60J时的K562DNA;电泳图#10:采用引物CSFFW200/CSFRV60J时的NTC对照。B:来自电泳图#3和#8的CSF1PO三重峰谱的细节。
图4.图4A:在2800M DNA上对标志物CSF1PO、Penta E和DYS391进行单重、双重和三重扩增后的琼脂糖凝胶电泳,其中,泳道1:100bp Ladder(Promega);泳道2:采用引物CSFFW120/CSFRV60J的CSF1PO单重;泳道3:采用引物PEFW120/PERV60F的Penta E单重;泳道4:采用引物DYS391F2/DYSRV120的DYS391单重;泳道5:采用引物CSFFW120/CSFRV60J+PEFW120/PERV60F的CSF1PO/Penta E双重;泳道6:采用引物CSFFW120/CSFRV60J+DYS391F2/DYSRV120的CSF1PO/DYS391双重;泳道7:采用引物PEFW120/PERV60F+DYS391F2/DYSRV120的Penta E/DYS391双重;泳道8:采用引物CSFFW120/CSFRV60J+PEFW120/PERV60F+DYS391F2/DYSRV120的CSF1PO/Penta E/DYS391三重;图4B:用于扩增CSF1PO、Penta E和DYS391的引物设计。
图5显示了采用引物CSFFW120/CSFRV60J、PEFW120/PERV60F和DYS391F2/DYSRV120对2800M DNA上的CSF1PO(JOE通道)、Penta E(FAM通道)和DYS391(FAM通道)进行的三重PCR的毛细管电泳图。
图6显示了琼脂糖凝胶电泳中的对2800M DNA(Promega)上的基因座DYS391进行扩增的结果:泳道1:100bp Ladder(Promega);泳道2:采用引物DYS391F2/DYSRV60的148bp条带;泳道3:采用引物DYS391F2/DYSRV60的NTC;泳道4:采用引物DYS391F2/DYSRV120的208bp条带;泳道5:采用引物DYS391F2/DYSRV120的NTC;泳道6:采用引物DYS391F2/DYSRV200的288bp条带;泳道7:采用引物DYS391F2/DYSRV200的NTC;泳道8:采用引物DYS391F2/DYSRV23+M13的148bp条带;泳道9:采用引物DYS391F2/DYSRV23+M13的NTC;泳道10:采用引物DYS391F2/DYSRV120+M13的288bp条带;泳道11:采用引物DYS391F2/DYSRV120+M13的NTC;泳道12:100bp Ladder(Promega)。
图7:图7A显示了添加至21(Promega)的DYS391引物的布局。图7B显示了添加至21的DYS391的毛细管电泳图,其中电泳图#1:没有额外引物的2800MDNA;电泳图#2:采用引物DYS391F2/DYSRV120(FAM通道)的2800M DNA;电泳图#3:采用引物DYS391F2/DYSRV200(FAM通道)的2800M DNA。
图8显示了在95℃下降解不同时间的2800M DNA(Promega)的基因座CSF1PO的qPCR图谱。样品1(黑色,实线):0分钟,采用引物CSFFW2416HSJ/CSFRV2216HS;样品2(黑色,虚线):10分钟,采用引物CSFFW2416HS J/CSFRV2216HS;样品3(黑色,点线):30分钟,采用引物CSFFW2416HSJ/CSFRV2216HS;样品4(黑色,细线):NTC,采用引物CSFFW2416HSJ/CSFRV2216HS;样品5(灰色,实线):0分钟,采用引物CSFFW200/CSFRV60J;样品6(灰色,虚线):10分钟,采用引物CSFFW200/CSFRV60J;样品7(灰色,点线):30分钟,采用引物CSFFW200/CSFRV60J;样品8(灰色,细线):NTC,采用引物CSFFW200/CSFRV60J。
图9:图9A显示了使用引物对CSFFW200/CSFRV60J对在95℃下加热了0、10、30、45和60分钟的2800M DNA(Promega)进行qPCR的图谱。样品1(黑色,实线):0分钟;样品2(黑色,虚线):10分钟;样品3(黑色,点线):30分钟;样品4(灰色,实线):45分钟;样品5(灰色,虚线):60分钟;样品6(灰色,点线):NTC(无模板对照)。图9B:被加热了0、30和60分钟的DNA样品与NTC(无模板对照)一同使用,以在目前的CODIS(组合DNA索引系统,FBI)商业试剂盒中展示超引物的优点。为此目的,将0.8μΜ(终浓度)的CSFFW200/CSFRV60J对的每个引物添加至Fusion 6C反应混合物中,该混合物已含有扩增27个基因座的54种引物。CE电泳图显示,随着DNA被更多地降解,峰信号减少或消失(尤其是对于更长的扩增子),而对应于CSFFW200/CSFRV60J对的峰对于降解最多的DNA在JOE通道中仍然可见。
图10:图10A显示了琼脂糖凝胶电泳中的极长引物CSFFW260(260nt)和CSFFW300(300nt)对2800M DNA(Promega)上的基因座CSF1PO的扩增结果:泳道1:100bp Ladder(Promega);泳道2:采用引物CSFFW200/CSFRV60J的370bp条带;泳道3:采用引物CSFFW200/CSFRV60J的NTC;泳道4:采用引物CSFFW260/CSFRV60J的370bp条带;泳道5:采用引物CSFFW260/CSFRV60J的NTC;泳道6:采用引物CSFFW300/CSFRV60J的410bp条带;泳道7:采用引物CSFFW300/CSFRV60J的NTC;泳道8:100bp Ladder(Promega)。图10B显示了采用引物CSFFW200(200nt)/CSFRV60J(60nt)、CSFFW260(260nt)/CSFRV60J(60nt)和CSFFW300(300nt)/CSFRV60J(60nt)进行的CSF1PO扩增的布局。
具体实施方式
遗传标志物被理解为在基因组上位置已知的基因或DNA序列,其可用于鉴定与给定的性状或表型相关、与遗传病相关、以及与个体和物种的鉴别相关的区域。术语“基因座”有时用于表达同一概念。
靶序列是指使用序列特异性引物选择性扩增的所关注的核酸区段。
引物是能够与互补核酸区段杂交以允许DNA聚合酶启动复制的寡核苷酸或多核苷酸。
出于本说明书的目的,术语“超引物(superprimer)”是指60个以上核苷酸、更优选60至300个核苷酸的单链DNA(ssDNA)多核苷酸引物。
使用长的单链DNA(ssDNA)多核苷酸而不是通常的更短的DNA寡核苷酸作为引物,产生了更大的扩增子而无需实际扩增额外的DNA区。由于减少了引物对之间的所需模板长度,PCR测定的性能在降解的DNA样品中得到极大的提升。
60至数百个核苷酸的单链DNA多核苷酸(其远比通常用作PCR引物的含有几个核苷酸的更小寡核苷酸长)能够最佳地用作替代引物,而无需特别关注其复性温度或者对特殊PCR条件的需要。虽然优选热启动PCR选项,但也可以利用非热启动PCR。长ssDNA引物的使用允许获得较大的DNA扩增子而无需实际扩增DNA模板的较大部分。
本发明的目标是增加PCR测定的灵敏度,这通过减少扩增所需的可用完整DNA模板的必需长度、同时获得适合于在CE分析和采用其它相关方法的分析中进行尺寸区分的更大DNA扩增子来实现。为此目的,添加长ssDNA多核苷酸作为引物或超引物,允许聚合特定的小的DNA区段,同时产生适于其便利检测的产物尺寸。
本发明的方法基于以下方面:随着PCR引物对的相互远离,在降解的DNA的存在下聚合酶的延伸效率降低。本发明的方法可用于在法医学调查工作中常见的降解或片段化的DNA样品以及陈旧样品中检测基因型。
该方法表明,长ssDNA引物可以容易地用于单重或多重形式的PCR测定。虽然优选热启动PCR,但也可使用非热启动酶。实际上,除了使用高度纯化的长ssDNA多核苷酸(超引物)作为引发试剂外,无需特殊的PCR条件或引物设计来达成该目标。而且,我们已经展示出,这些引物可以应用于扩增降解的DNA模板,具有与小型STR相同的有益效果,而同时产生更适于尺寸区分测定的更大的长度灵活的DNA扩增子。
与模板序列完全互补或仅在其3'引发区互补的引物都成功地得到扩增。使用非同源序列可能对于在设计用若干引物进行的多重反应时提供灵活性而言是重要的。此外,带有长的5'非同源序列的引物可以考虑用于进行诱变以及复性、分子结合和标记策略。
本发明的方法适于PCR测定以及适于检测涉及序列和长度多态性的变化。其可适用于目前采用的方法,后者依赖于不同的扩增长度来辨别核酸序列的变化。其还可以用在用于鉴别个体和物种以及医学诊断的多重试剂盒的设计中。
本发明的方法通过减少扩增所需的可用完整DNA模板的必需长度、同时获得适合于在CE分析和采用其它相关方法的分析中进行尺寸区分的更大的尺寸灵活的DNA扩增子来增加PCR测定的灵敏度。为此目的,使用长ssDNA多核苷酸作为引物(超引物)允许酶促聚合特定的小的DNA靶区,同时产生适于其便利检测的产物尺寸。
本发明通过减少完整DNA模板的必需长度、同时获得适合于尺寸区分的更大的DNA扩增子来增加PCR测定的灵敏度。
本发明的方法可用于获得合适长度的PCR产物而无需扩增靶外序列以达成该目的,由此通过减少所扩增的核苷酸的数目而增加了对短的片段化或降解的DNA样品的测定灵敏度。另外,通过允许使用具有大的非同源序列的引物,在PCR测定的设计中提供了更大的多样性。
PCR引物的设计基于由John M.Butler和Dennis J.Reeder创建的NIST短串联重复DNA互联网数据库(NIST Short Tandem Repeat DNA Internet Database,John M.Butler和Dennis J.Reeder创建,http://www.cstl.nist.gov/strbase/index.htm)提供的信息和来自GenBank(GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)的公开基因组序列。
所有DNA引物均由Integrated DNA Technologies Inc.(IDT)合成。带荧光染料6-FAM(荧光素)和JOE(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素,NHS酯)标记的引物通过HPLC来纯化。120和200个核苷酸的引物(UltramersTM)经PAGE纯化。260和300个核苷酸的引物(MegamersTM)经克隆纯化。所有其它引物都脱盐。
图1显示了实施例中所用的扩增的DNA区上的不同引物的位置。
引物序列为:
CSFRV2216HS:SEQ ID NO:1
CSFFW2416HS:SEQ ID NO:2
CSFFW2416HSJ:SEQ ID NO:3(与SEQ ID NO:2相同,但在5'端具有荧光JOE染料)
CSFFW120:SEQ ID NO:4
CSFFW200:SEQ ID NO:5
CSFRV60J:SEQ ID NO:6(可以在5'端具有荧光JOE染料)
PEFW120:SEQ ID NO:7
PERV60F:SEQ ID NO:8.(可以在5'端具有荧光6-FAM染料)
DYS391F2:SEQ ID NO:9(可以在5'端具有荧光6-FAM染料)
DYSRV60:SEQ ID NO:10
DYS391RV120:SEQ ID NO:11
DYS391RV200:SEQ ID NO:12
DYSRV120+M13:SEQ ID NO:13
DYSRV23+M13:SEQ ID NO:14
CSFFW260:SEQ ID NO:15
CSFFW300:SEQ ID NO:16。
长ssDNA引物以与更短的寡核苷酸引物相似的方式产生净PCR产物,没有任何伪条带或乱真条带。图2A显示了使用120个核苷酸的ssDNA多核苷酸(CSFFW120)或200个核苷酸的ssDNA多核苷酸(CSFFW200)作为正向引物和60个核苷酸的引物(CSFRV60J)作为反向引物对基因分型基因座CSF1PO(5q33.1;CSF-1受体基因的人c-fms原癌基因,第6内含子,GenBank登记号X14720)的370bp区的PCR扩增。还使用了具有与商业试剂盒16HS(Promega)中相同的序列的24个核苷酸的第三正向引物(CSFFW2416HS)。
由于3个正向引物共享相同的5'序列,其均产生相同的370bp产物。还采用16HS(Promega)引物CSFFW2416HSJ/CSFRV2216HS对345bp进行了对照扩增。在所有反应中使用标准DNA 2800M(Promega)作为模板。
针对参照细胞系中的不同基因型,验证了用长ssDNA引物生成的DNA谱的品质。DNA模板2800M(基因型12,12)、9947A(基因型10,12)、9948(基因型10,11,12)和K562(基因型9,10)的CSF1PO区采用正向引物CSFFW120(120nt)或CSFFW200(200nt)和反向引物CSFRV60J(60nt,JOE标记)进行扩增,然后通过毛细管电泳进行分析(图3A)。
所有谱均与在文献中描述的这些细胞类型的谱相符(James,R.New Control DNAfor Systems.Promega公司网页,http://worldwide.promega.com/resources/profiles-in-dna/2011/new-control-dna-for-powerplex-systems/,2011年更新;National Institute of Standards&Technology Certificate of AnalysisStandard Reference2391b PCR-Based DNA Profiling Standard and AmericaType Culture Collection:ATCC STR Data for Human Cell Lines www.atcc.org/STR%20Database.aspx)。而且,它们显示出存在于细胞系K562(显性10)和9948(显性10)中的特征性杂合子失衡。在细胞系9948中还存在一个小峰(图3B),其可能代表相对强度小于显性等位基因10的10%的CSF1PO等位基因12三重体(America Type Culture Collection:ATCCSTR Data for Human Cell Lines www.atcc.org/STR%20Database.aspx,和ForensicDNA Typing,Biology,Technology and Genetics of STR Markers,第2版(2005),John,M.Butler,Elsevier Academic Press)。
使用长ssDNA引物(超引物)可以成功地扩增其他常用的STR标志物(例如,DYS391和Penta E)并将其在多重形式中组合。图4A显示了使用以下引物对的组对2800M DNA上的基因座CSF1PO、Penta E和DYS391进行扩增的产物:CSFFW120/CSFRV60J、PEFW120/PERV60F和DYS391F2/DYSRV120(图4B)。这些引物对被依次成功组合以产生所有可能的双重组合和三重体。图5显示了具有DYS391和Penta E(FAM通道)和CSF1PO(JOE通道)的预期峰谱的三重测定的CE谱。
也可以成功地利用具有部分非互补序列的长ssDNA引物(超引物)。图6显示了采用正向引物DYS391F2和60个核苷酸(DYSRV60)、120个核苷酸(DYSRV120)或200个核苷酸(DYSRV200)的反向引物进行的DYS391STR区扩增。这3个反向引物共享相同的3'序列并且与DYS391区完全互补。为了验证非互补序列也可以成功地使用,将反向引物DYSRV23+M13(60nt)和DYSRV120+M13(200nt)包括在内,这两者与其它反向引物共享相同的同源3'引发序列,但在其5'端区具有非互补的M13噬菌体序列标签。
与模板完全互补的引物以及仅在3'引发区互补的引物均在STR DYS391区成功地扩增,产生了预期尺寸的产物。使用具有5'区非互补序列(在引发时其无需与模板复性)的引物因允许使用任何序列选择而可能对于在采用数种引物的多重反应的设计中提供灵活性是重要的。具有长的5'非同源序列的引物可用于诱变、基因建构和其它应用。
如所示的,可以容易地使用在其5'端与靶序列不完全互补的超引物,只要其3'端序列显示出与引发区的同源性即可。
长ssDNA引物(超引物)与更复杂的PCR多重测定是相容的。为了了解长ssDNA片段(超引物)是否可能在某种程度上干扰使用数个引物的测定,将引物对DYS391F2/DYSRV120和DYS391F2/DYSRV200(图7A)添加到已含有42种引物的商业试剂盒(21,Promega,具有用于扩增21个基因座的42种引物)中。图7B显示,所有21种标志物的2800MDNA谱并未因添加所述长引物而改变,而在FAM通道中鉴定出对应于DYS391的峰,其具有对应于这两对引物的预期尺寸。添加至现有试剂盒中的超引物提供了预期的结果且不干扰数个基因座的多重检测。本发明的方法可以用在复杂的多重PCR测定中。
长ssDNA引物(超引物)可用于扩增降解的DNA。为了证明对片段化或降解的DNA样品使用长引物的优点,通过在95℃下进行递增时长的加热,对基因组DNA进行受控降解。使用标准16HS引物或更长的ssDNA引物(超引物)对CSFFW200(200nt)/CSFRV60J(60nt)对所产生的降解DNA进行qPCR扩增(图2B)。图8显示出,对于更大程度降解的DNA,采用长ssDNA引物的反应中的Ct(循环阈值)变得低于采用标准16HS引物的反应中的Ct,表明其更适于扩增降解的DNA。
在DNA样品降解时,长ssDNA引物有助于在涉及数十种引物的复杂多重测定中检测遗传标志物。例如,可以在含有FBI(联邦调查局)数据库的CODIS(组合DNA索引系统)标志物的现有试剂盒中使用超引物,以扩增原本可能依旧检测不到的基因座,尤其是那些具有大扩增子尺寸的基因座。图9A显示了在95℃下进行递增时长的加热然后使用引物CSFFW200(200nt)和JOE标记的CSFRV60J(60nt)扩增的2800M DNA的qPCR谱。尽管更长时间的加热温育使DNA更多地降解,但引物对CSFFW200/CSFRV60J在所有时间点都生成了PCR产物。降解的DNA和NTC(无模板对照)一起用来证明在目前的CODIS(组合DNA索引系统,FBI)商业试剂盒中使用超引物的优点。为此目的,将CSFFW200/CSFRV60J对添加至Fusion 6C反应混合物中,该混合物已含有扩增27个基因座的54种引物。峰信号随着DNA被更多地降解而减少,尤其是对于更长的扩增子而言(图9B)。相反,用长ssDNA引物CSFFW200/CSFRV60J扩增的降解样品在JOE通道中仍显示出CSF1PO标志物的有用的基因分型峰。这证明了在降解的DNA样品的存在下进行复杂CODIS多重测定时使用超引物的优点。
DNA降解地更多,更长的引物在扩增所产生的片段化DNA模板时会更高效,因为正向和反向引物的3'端之间的扩增跨度更短。这是与小型STR中所见的效果相同的效果(Advanced Topics in Forensic DNA Typing:Methodology,第1版(2011),John,M.Butler,Elsevier Academic Press),但具有产生适于多重测定的更大且长度更灵活的PCR产物的额外益处。
虽然使用了至多300个核苷酸的长引物,但明显的是即使更长的引物也可成功用于所描述的方法中。这可以从120个核苷酸和200个核苷酸的引物之间的产物产率的可忽略的差异推测出,如基因座DYS391的扩增所示(图7B)。CE电泳图中的DYSRV200(200nt)的峰面积仅比DYSRV120(120nt)的峰面积小20%。利用120、200、260和300个核苷酸的引物也可以容易地扩增基因座CSF1PO(图10A)。由此,可以安全地外推出比300个核苷酸更长的引物也可以用于PCR而不会显著损害最终产率。
本发明通过以下实施例而得到最佳的说明,不能在任何意义上将所述实施例解释为对本发明范围的限制。相反,必须明确理解,在不背离本发明的主旨和所包括的权利要求的范围的情况下,本领域技术人员在阅读本说明书后可以得到其它版本、修改和适用方式的启示。
实施例1
使用长ssDNA引物的终点PCR
使用120个核苷酸(CSFFW120)或200个核苷酸(CSFFW200)的ssDNA多核苷酸作为正向引物和60个核苷酸的引物(CSFRV60J)作为反向引物,对基因分型基因座CSF1PO的370bp区进行PCR扩增。还使用了具有与商业试剂盒16HS(Promega)中序列相同的24个核苷酸的第三正向引物(CSFFW2416HS)。还包括了采用16HS引物CSFFW2416HSJ/CSFRV2216HS对345bp进行的对照扩增。在所有反应中使用标准DNA2800M(Promega)作为模板。
在MultiGeneTM Gradient热循环仪(Labnet)上在20μL反应体积中进行终点PCR扩增,所述反应体积含有:包含1.5mM MgCl2的1X Colorless反应缓冲液(Promega)、200μM的每种三磷酸脱氧核糖核苷酸(Promega)、1U热启动DNA聚合酶(Promega)、500nM的每种引物(IDT)和500pg基因组DNA标准物2800M(Promega)。循环条件包括:在94℃进行2分钟的初始变性步骤,随后进行35次94℃下10秒、59℃下60秒和72℃下45秒的循环,最终在60℃下温育10分钟。使PCR产物在100伏恒定电压下电泳通过1X TBE缓冲液中的2%琼脂糖凝胶,并用溴乙锭可视化。在每个孔内加载3μL样品或DNA尺寸标准物(100bpLadder,Promega)。
凝胶电泳显示长ssDNA引物以与更短的寡核苷酸引物相似的方式产生了净PCR产物,没有任何伪条带或乱真条带(图2A)。
实施例2
使用长ssDNA引物时不同DNA基因型的毛细管电泳(CE)谱
用正向引物CSFFW120(120nt)或CSFFW200(200nt)和反向引物CSFRV60J(60nt,JOE标记)扩增DNA模板2800M(基因型12,12)、9947A(基因型10,12)、9948(基因型10,11)和K562(基因型9,10)的CSF1PO区,然后通过毛细管电泳进行分析(图3A)。
在MultiGeneTMGradient热循环仪(Labnet)上在20μL反应体积中进行PCR扩增,所述反应体积含有:包含1.5mM MgCl2的1X Colorless 反应缓冲液(Promega)、200μM的每种三磷酸脱氧核糖核苷酸(Promega)、1U热启动DNA聚合酶(Promega)、500nM的每种引物(IDT)和500pg基因组DNA模板。循环条件包括:在94℃进行2分钟的初始变性步骤,随后进行35次94℃下10秒、59℃下60秒和72℃下45秒的循环,最终在60℃下温育10分钟。采用50cm毛细管柱和POP7树脂在ABI 3500测序仪(Applied Biosystems)中运行PCR产物的稀释样品。注射时间为5秒。样品体积为0.5μL或1μL,甲酰胺9.0μL,CC5泳道内标(ILS)(Promega)0.5μL。软件为ID-X 1.2。
所有谱均与文献中描述的这些细胞类型的谱相符。而且,其显示出细胞系K562(9,10中的显性10)和9948(10,11中的显性10)中存在的特征性杂合子失衡。在细胞系9948中还存在一个小峰(图3B),其可能代表相对强度小于显性等位基因10的10%的CSF1PO等位基因12三重体。
实施例3
STR基因座在多重形式中的扩增
图4A显示了使用以下引物对的组对2800M DNA上的基因座CSF1PO、Penta E和DYS391进行扩增的产物:CSFFW120/CSFRV60J、PEFW120/PERV60F和DYS391F2/DYSRV120(图4B)。这些引物对被依次成功地组合以产生所有的双重组合和三重体。
在MultiGeneTM Gradient热循环仪(Labnet)上在20μL反应体积中进行终点PCR扩增,所述反应体积含有:包含1.5mM MgCl2的1X Colorless反应缓冲液(Promega)、200μM的每种三磷酸脱氧核糖核苷酸(Promega)、1U热启动DNA聚合酶(Promega)、500nM的每种引物(IDT)和500pg基因组DNA标准物2800M(Promega)。循环条件包括:在94℃进行2分钟的初始变性步骤,随后进行35次94℃下10秒、59℃下60秒和72℃下45秒的循环,最终在60℃下温育10分钟。使PCR产物在100伏恒定电压下电泳通过1X TBE缓冲液中的2%琼脂糖凝胶,并用溴乙锭可视化。在每个孔内加载3μL样品或DNA尺寸标准物(100bpLadder,Promega)。
图5显示了具有DYS391和Penta E(FAM通道)和CSF1PO(JOE通道)的预期峰谱的三重测定的CE谱。采用50cm毛细管柱和POP7树脂在ABI 3500测序仪(Applied Biosystems)中运行PCR产物的稀释样品。注射时间为5秒。样品体积为0.5μL或1μL,甲酰胺9.0μL,CC5泳道内标(Promega)(ILS)0.5μL。软件为ID-X 1.2。
使用长ssDNA引物成功地扩增了常用的STR基因座DYS391、Penta E和CSF1PO,并将其在几种多重形式中进行了组合。
实施例4
使用具有部分非互补序列的长ssDNA引物的PCR扩增
图6显示了用正向引物DYS391F2和60个核苷酸(DYSRV60)、120个核苷酸(DYSRV120)或200个核苷酸(DYSRV200)的反向引物对DYS391STR区进行的扩增。这三个反向引物共享相同的3’序列且与DYS391区完全互补。为了验证非互补序列也可以成功地使用,还将反向引物DYSRV23+M13(60nt)和DYSRV120+M13(200nt)包括在内,它们和其它反向引物共享相同的同源3’引发序列,但在其5’端区域分别具有37nt和80nt的非互补M13标签。
在MultiGeneTM Gradient热循环仪(Labnet)上在20μL反应体积中进行终点PCR扩增,所述反应体积含有:包含1.5mM MgCl2的1X Colorless反应缓冲液(Promega)、200μM的每种三磷酸脱氧核糖核苷酸(Promega)、1U热启动DNA聚合酶(Promega)、500nM的每种引物(IDT)和500pg基因组DNA标准物2800M(Promega)。循环条件包括:在94℃进行2分钟的初始变性步骤,随后进行35次94℃下10秒、59℃下60秒和72℃下45秒的循环,最终在60℃下温育10分钟。使PCR产物在100伏恒定电压下电泳通过1X TBE缓冲液中的2%琼脂糖凝胶,并用溴乙锭可视化。在每个孔内加载3μL样品或DNA尺寸标准物(100bpLadder,Promega)。
仅在3’引发区与靶序列互补的长ssDNA引物成功地在STR DYS391区扩增,产生了预期尺寸的产物。
实施例5
在复杂多重PCR测定中添加长ssDNA引物
为了了解长ssDNA多核苷酸是否可能在某种程度上干扰采用若干种引物的测定,将引物对DYS391F2/DYSRV120(各0.8μΜ终浓度)和DYS391F2/DYSRV200(各0.8μΜ终浓度)(图7A)添加至已包含42种引物的商业试剂盒(21,Promega)中。根据制造商的说明在ABI 9700热循环仪(Applied Biosystems Inc.)中进行了21(Promega)PCR反应,不同之处在于反应最终体积为12.5μL。采用50cm毛细管柱和POP7树脂在ABI 3500测序仪(Applied Biosystems)中运行PCR产物的稀释样品。注射时间为5秒。样品体积为0.5μL或1μL,甲酰胺9.0μL,CC5泳道内标(ILS)(Promega)0.5μL。软件为ID-X1.2。
图7B显示,添加所述长引物完全没有改变21种标志物的2800M DNA谱,而在FAM通道中鉴定出了对应于DYS391的峰,其具有对应于这两对引物的预期尺寸。扩增DYSRV200(200nt)时的次级峰可能是由于引物的不完全n-1PAGE合成后纯化所致。长ssDNA引物因而与更复杂的多重PCR测定完全相容。
实施例6
采用长ssDNA引物对降解的DNA进行PCR扩增
为了展示对片段化或降解的DNA样品使用长引物的优点,对基因组DNA进行受控降解。将4ng的2800M DNA(Promega)在95℃下于40μL无核酸酶的水中温育0、10和30分钟。在每个时间点后将样品立即冷却。在每个时间点的500pg DNA上,使用引物对CSFFW2416HSJ/CSFRV2216HS对CSF1PO基因座区进行qPCR扩增,从而通过比较不同的Ct值来评估降解程度。使用来自16HS的CSF1PO引物CSFFW2416HSJ/CSFRV2216HS或更长的ssDNA引物对CSFFW200(200nt)和JOE标记的CSFRV60J(60nt)对所得的降解DNA进行qPCR扩增(图2B)。
在Rotor-Gene RG-6000循环仪(Qiagen)上在含有1X qPCRqPCR MasterMix(Promega)、500nM的每种引物(IDT)和500pg的经热处理的2800M基因组DNA(Promega)的20μL反应体积中进行定量PCR。循环条件包括:在94℃进行2分钟的初始变性步骤,随后进行38次94℃下10秒、59℃下60秒和72℃下45秒的循环,最终在60℃下温育10分钟。在470nm激发波长/510nm发射波长下检测荧光读数。
图8显示了采用两对引物和经不同时长处理的DNA的qPCR谱。更短的16HS引物与完整的DNA给出了更低的初始Ct(循环阈值)值(时间0)。然而,热处理了仅10分钟的DNA模板在这两对引物下已经显示出相似的Ct。对于更大程度降解的DNA,采用ssDNA长引物的反应中的Ct比使用更短的商业引物时更低。
qPCR谱显示出,长ssDNA引物对于扩增降解的DNA是有利的。
实施例7
在含有CODIS标志物的复杂多重PCR测定中使用长ssDNA引物对降解的DNA进行扩增
为了显示在复杂的多重PCR测定中对片段化或降解的DNA样品使用长ssDNA引物的优点,对基因组DNA进行不同时长的受控降解,然后用已含有54种引物的商业试剂盒Fusion 6C(Promega)在存在或不存在长引物对CSFFW200/CSFRV60J时对其进行扩增。将2800M DNA(4ng)在95℃下在40μL无核酸酶的水中温育0、10、30、45和60分钟。在每个时间点后将样品立即冷却。在每个时间点的500pg经处理的DNA上,使用引物对CSFFW200/CSFRV60J对CSF1PO基因座区进行qPCR扩增,从而通过比较不同的Ct值来评估降解程度(图9A)。在Rotor-Gene RG-6000循环仪(Qiagen)上在含有1X qPCRqPCRMaster Mix(Promega)、500nM的每种引物(IDT)和500pg的经热处理的2800M基因组DNA(Promega)的20μL反应体积中进行定量PCR。循环条件包括:在94℃进行2分钟的初始变性步骤,随后进行35次94℃下10秒、59℃下60秒和72℃下45秒的循环,最终在60℃下温育10分钟。在470nm激发波长/510nm发射波长下检测荧光读数。
使用商业试剂盒Fusion 6C在存在或不存在长引物对CSFFW200/CSFRV60J(各0.8μΜ终浓度)时进行0、30和60分钟时间点以及NTC(无模板对照)的扩增。根据制造商的说明在ABI 9700热循环仪(Applied Biosystems Inc.)中进行Fusion 6C PCR反应,不同之处在于反应最终体积为12.5μL。采用50cm毛细管柱和POP7树脂在ABI 3500测序仪(Applied Biosystems)中运行PCR产物的稀释样品。注射时间为5秒。样品体积为0.5μL或1μL,甲酰胺9.0μL,WEN泳道内标(ILS)(Promega)0.5μL。软件为ID-X 1.2。
图9B显示出,仅在使用长引物对CSFFW200/CSFRV60J(JOE通道)时,在60分钟时间点处检测到CSF1PO标志物。该实施例证明了在降解的DNA样品的存在下进行含CODIS标志物的复杂多重测定时使用超引物的优点。
实施例8
使用260至300核苷酸的极长引物进行终点PCR
使用260核苷酸(CSFFW260)或300核苷酸(CSFFW300)的极长ssDNA多核苷酸作为正向引物和60核苷酸(CSFRV60J)引物作为反向引物进行基因座CSF1PO的PCR扩增。包含了使用引物CSFFW200/CSFRV60J进行的对照扩增(370bp)(图10B)。
在MultiGeneTM Gradient热循环仪(Labnet)上在20μL反应体积中进行终点PCR扩增,所述反应体积含有:包含1.5mM MgCl2的1X Colorless反应缓冲液(Promega)、0.625mM额外补充的MgCl2(Promega)、200μM的每种三磷酸脱氧核糖核苷酸(Promega)、2.5U热启动DNA聚合酶(Promega)、250nM的每种引物(IDT)和1ng基因组DNA标准物2800M(Promega)。循环条件包括:在94℃进行2分钟的初始变性步骤,随后进行35次94℃下10秒、59℃下60秒和72℃下45秒的循环,最终在60℃下温育10分钟。使PCR产物在100伏恒定电压下电泳通过1X TBE缓冲液中的2%琼脂糖凝胶,并用溴乙锭可视化。在每个孔内加载3μL样品或DNA尺寸标准物(100bp Ladder,Promega)。
凝胶电泳显示260和300核苷酸的极长ssDNA引物分别产生了370bp和410bp的预期PCR产物,而没有显示出任何显著的伪条带或乱真条带(图10A)。
在上文描述中,出于解释说明的目的,阐述了许多细节以便提供对本公开的透彻理解。然而,本领域技术人员显而易见,这些具体细节不是实施本公开所必须的。虽然描述了特定的尺寸和材料以实施所公开的实例实施方式,但可以在本公开的范围内使用其它合适的尺寸和/或材料。所有这些修改和变化(包括技术上的所有合适的当前和未来的变化)被认为落在本公开的界限和范围内。所提及的所有参考文献在此通过援引以其整体并入。
Claims (11)
1.一种通过聚合酶链式反应在核酸样品中同时检测多种遗传标志物的方法,该方法包括以下步骤:
a. 提供包含核酸的样品;
b. 使所述核酸与多对引物杂交,由此形成杂交的核酸,其中,所述多对引物各自扩增不同的DNA区域;所述多对引物中的至少一种引物是60至300个核苷酸长的单链DNA多核苷酸;
c. 对所述杂交的核酸进行聚合酶链式反应,由此产生多个扩增产物;和
d. 检测所述多个扩增产物,以确定所述多个扩增产物的多个长度或所述多个扩增产物的多个尺寸。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述核酸包括基因组DNA、线粒体DNA、质粒DNA、病毒DNA、病毒RNA、循环胞外游离DNA、合成DNA或信使RNA。
3.如权利要求1所述的方法,其中,所述核酸是基因组DNA。
4.如权利要求1所述的方法,其中,所述多种遗传标志物包括多种基因、多种鉴别标志物和多种遗传病标志物。
5. 如权利要求1所述的方法,其中,所述多种遗传标志物包括多种短串联重复遗传标志物,且所述多种短串联重复遗传标志物选自由CSF1PO、DYS391和Penta E及其组合组成的组。
6.如权利要求1所述的方法,其中,所述单链DNA多核苷酸的序列与靶序列完全互补。
7.如权利要求1所述的方法,其中,所述单链DNA多核苷酸在5'端具有非同源序列,而其3'引发区与靶序列互补。
8.如权利要求1所述的方法,其中,所述单链DNA多核苷酸标记有由荧光染料、发光部分、酶、半抗原或抗原。
9.如权利要求1所述的方法,其中,所述聚合酶链式反应包括双重、三重、多重、终点、实时、热启动和非热启动聚合酶链式反应。
10.如权利要求1所述的方法,其中,所述核酸是降解的或片段化的核酸。
11. 如权利要求4所述的方法,其中,所述多种遗传标志物是多种短串联重复遗传标志物,且所述多种短串联重复遗传标志物选自由CSF1PO、DYS391和Penta E及其组合组成的组。
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EP3815091A4 (en) * | 2018-06-29 | 2022-03-23 | Rady Children's Hospital Research Center | PROCEDURE AND SYSTEM TO ENSURE IDENTITY OF SAMPLES |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3834636A1 (de) | 1988-10-11 | 1990-04-19 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichen |
US5582979A (en) | 1989-04-21 | 1996-12-10 | Marshfield Clinic | Length polymorphisms in (dC-dA)n.(dG-dT)n sequences and method of using the same |
US5364759B2 (en) | 1991-01-31 | 1999-07-20 | Baylor College Medicine | Dna typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats |
US6479235B1 (en) | 1994-09-30 | 2002-11-12 | Promega Corporation | Multiplex amplification of short tandem repeat loci |
DE10113265B4 (de) * | 2001-03-16 | 2018-03-08 | Qiagen Gmbh | Verwendung einer stabilisierten Nukleinsäure zur Herstellung eines Proteins |
US6743905B2 (en) | 2001-04-16 | 2004-06-01 | Applera Corporation | Mobility-modified nucleobase polymers and methods of using same |
CN101341258A (zh) * | 2004-11-03 | 2009-01-07 | 第三次浪潮技术公司 | 单步检测测定法 |
CN101210240B (zh) * | 2007-12-25 | 2011-11-16 | 天津大学 | 大引物pcr进行定点突变的方法 |
CN101818192B (zh) * | 2009-08-27 | 2013-03-20 | 基点认知技术(北京)有限公司 | 20个短串联重复序列的复合扩增试剂盒 |
WO2014012107A2 (en) * | 2012-07-13 | 2014-01-16 | Life Technologies Corporation | Human identifiation using a panel of snps |
US9556482B2 (en) * | 2013-07-03 | 2017-01-31 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Commerce | Mouse cell line authentication |
EP2860262A1 (en) | 2013-10-09 | 2015-04-15 | Universität Heidelberg | Method for the quantitative analysis of nucleic acid fragmentation and amplifiability |
RU2752700C2 (ru) * | 2014-02-18 | 2021-07-30 | Иллумина, Инк. | Способы и композиции для днк-профилирования |
-
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