KR101762486B1 - 한국인 모계 계통 분석용 마커 조성물 - Google Patents

한국인 모계 계통 분석용 마커 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한국인 모계 계통 분석용 마커 조성물, 상기 조성물을 포함하는 한국인 모계 계통 분석 키트 및 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명은 한 반응으로 동시에 mtDNA 하플로그룹을 분석할 수 있으며, 이에 따라 한국인 모계 계통 분석 시 시간 및 비용을 절약할 수 있다.

Description

한국인 모계 계통 분석용 마커 조성물 {MARKER COMPOSITION FOR ANALYSIS OF MATERNAL LINEAGE IN KOREAN}
본 발명은 한국인 모계 계통 분석용 마커 조성물, 상기 조성물을 포함하는 한국인 모계 계통 분석 키트 및 분석 방법에 관한 것이다.
미토콘드리아 DNA(mtDNA) 하플로그룹(haplogroup)은 모계 계통을 반영하고 있으며, mtDNA의 코딩 부위(coding region)에 존재하는 단일염기다형(SNPs) 또는 삽입/결실 다형(InDels)과 같은 특이적인 변이에 의해 결정된다. mtDNA 하플로그룹은 지역 또는 집단에 따라서 다른 분포를 보이며, 한국인 집단에서 주로 분포하는 mtDNA의 상위-하플로그룹은 약 15~20개 정도이다. 따라서 한국인 모계 계통 분석을 위해, 최소 20개의 하플로그룹 변이를 동시에 증폭하고 분석할 필요가 있다.
하플로그룹의 특이적인 변이를 분석하기 위한 방법은 매우 다양하다. 예를 들어, 제한효소를 이용하는 방법 또는 변형된 PCR 기술을 이용하는 방법 등이 있다. 최근에는 스냅샷 멀티플렉스 키트(SNaPshot multiplex kit)를 이용하여 여러 개의 변이를 동시에 분석할 수 있는 방법이 이용되고 있다. 상기 스냅샷 멀티플렉스 키트는 single base extension이라고도 하며, 멀티플렉스(multiplex) 분석이 가능하여 기존 분석방법에 비해 시간과 비용적인 면에서 장점을 가진다. 따라서, 스냅샷 분석방법을 통한 모계 계통 분석 연구가 활발히 진행되고 있다. 일례로, [Lee et al., Electrophoresis 27: 4408-4418, 2006]에는 한국인 집단에 존재하는 하플로그룹에 특이적인 22개의 변이를 분석할 수 있는 프라이머 세트를 기재하고 있다. 그러나, 상기 문헌의 경우 하나의 세트에서 7~8개의 변이를 대상으로 증폭하기 때문에 한국인 집단에서 분포되는 20개의 하플로그룹을 동시에 수행할 수 없는 문제점이 있으며, 이에 따라 최소 2~3회의 분석을 반복해야만 모계 계통을 분석할 수 있다. 또한, 여러 번 나누어서 분석하게 되어 많은 시간과 비용을 초래할 뿐만 아니라, 시료의 오염 또는 섞임에 의해 분석 정확도가 떨어질 우려도 있다.
이에, 한번의 반응으로 동시에 mtDNA 하플로그룹을 분석하여 한국인 모계 계통을 분석할 수 있는 키트 및 표준화된 분석 방법이 요구되고 있다.
Lee et al., East Asian mtDNA haplogroup determination in Koreans: haplogroup-level coding region SNP analysis and subhaplogroup-level control region sequence analysis. Electrophoresis 27: 4408-4418, 2006.
상기 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 한번의 반응으로 한국인 모계 계통을 분석할 수 있는 한국인 모계 계통 분석용 마커 조성물, 상기 조성물을 포함하는 분석 키트 및 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 서열번호 1 내지 34의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트, 및 서열번호 35 내지 54의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 한국인 모계 계통 분석용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 34의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트, 및 서열번호 35 내지 54의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 한국인 모계 계통 분석 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 34의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭하는 단계에서 증폭된 산물의 염기서열을 서열번호 35 내지 54의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 분석하는 단계를 포함하는 한국인 모계 계통 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 (b) 단계의 표적 서열 증폭이 중합효소 연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction), real-time PCR, 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 및 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 의해 수행되는 것일 수 있다.
다른 일 구현예는 (c) 단계의 분석이 스냅샷(sNaPShot) 분석 방법, DNA 칩 방법, TaqMan 프로브 및 대립형질(allele) 특이적 혼성화 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 의해 수행되는 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 DNA는 인간의 미토콘드리아 DNA (mtDNA)인 것일 수 있다.
본 발명은 한 반응으로 동시에 mtDNA 하플로그룹을 분석할 수 있으며, 이에 따라 한국인 모계 계통 분석 시 시간 및 비용을 절약할 수 있다.
또한, 본 발명은 국제적인 가이드라인에 적합한 mtDNA 정보분석의 표준화된 실험기법에 따라 과학수사에 필요한 감정결과의 신뢰성 제고와 국제적인 신뢰성 확보에 기여할 수 있으며, 대량재난 및 재해 발생시 심하게 손상된 시료에 대한 개인식별 및 모계혈족 확인에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 보인다.
도 1은 한국인 집단에 주로 분포하는 20개의 mtDNA 하플로그룹(M, D, D4, D4a, D4b, D5, M7, M8, M9, M10, M11, G, N, N9, N9a, Y, A, F, B4`5, B5)을 나타낸 것이다.
도 2는 스냅샷 타이핑의 결과 화면을 나타낸 것이다.
본 발명은 한국인 모계 계통 분석용 마커 조성물, 상기 조성물을 포함하는 한국인 모계 계통 분석 키트 및 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명은 서열번호 1 내지 34의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트, 및 35 내지 54의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함함에 따라, 한국인에 주로 분포하는 mtDNA 하플로그룹 변이를 동시에 분석할 수 있는 것이 특징이다 (미토콘드리아는 어머니로부터 자녀에게만 전달되고, 아버지의 미토콘드리아는 자녀에게 전달되지 않기 때문에, 미토콘드리아 DNA가 전달되는 경우를 모계 유전된다고 하며, 하플로그룹은 mtDNA에서 나타나는 특정 계통을 의미하므로, 모계 계통 분석은 하플로그룹 분석을 의미한다).
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 34의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트, 및 서열번호 35 내지 54의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 한국인 모계 계통 분석용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "마커"란 한국인 모계 계통을 분석할 수 있는 물질로, 한국인에 주로 분포하는 하플로그룹과 관련된 핵산 (예: mRNA 등), 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 발명에서 "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 34의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트는 한국인에 주로 분포하는 하플로그룹 변이를 증폭할 수 있으며, 상기 하플로그룹은 M, D, D4, D4a, D4b, D5, M7, M8, M9, M10, M11, G, N, N9, N9a, Y, A, F, B4`5 및 B5일 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 35 내지 54의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트는 증폭된 상기 하플로그룹 변이를 특이적으로 결합할 수 있어 빠르고 정확하게 한국인 모계 계통 분석을 할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 34의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트, 및 서열번호 35 내지 54의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 한국인 모계 계통 분석 키트를 제공한다.
본 발명의 "키트"는 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출률이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 BSA이 추가로 포함될 수도 있다.
또한, 본 발명은 (a) 대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 34의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭하는 단계에서 증폭된 산물의 염기서열을 서열번호 35 내지 54의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 분석하는 단계를 포함하는 한국인 모계 계통 분석 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 DNA는 gDNA 및 cDNA를 모두 포함하며, 상기 DNA는 인간의 미토콘드리아 DNA (mtDNA)인 것일 수 있다.
상기 (a) 단계에서 DNA의 분리는 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl AmmoniumBromide)등을 이용하거나, 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수도 있으며 이에 제한되지 않는다. 만약 대상 시료가 mRNA일 경우, 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 총 RNA를 분리한 후, cDNA를 합성하여 이용한다.
상기 (b) 단계의 표적 서열 증폭은 중합효소 연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction), real-time PCR, 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 및 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 의해 수행되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 중합효소 연쇄반응에 의해 수행되는 것일 수 있다.
상기 (c) 단계의 분석은 스냅샷(sNaPShot) 분석 방법, DNA 칩 방법, TaqMan 프로브 및 대립형질(allele) 특이적 혼성화 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 의해 수행되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 스냅샷 분석 방법에 의해 수행되는 것일 수 있다. 스냅샷 분석 방법의 경우 멀티플렉스 분석이 가능하여 시간과 비용적인 면에서 장점을 가진다.
이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
[ 실시예 ]
한번의 반응으로 분석 가능하면서 한국인 집단의 하플로그룹을 최대한 모두 포함하기 위하여 20개를 선정하여 분석하였다.
구체적으로, 한국인 집단에 주로 분포하는 20개의 mtDNA 하플로그룹(M, D, D4, D4a, D4b, D5, M7, M8, M9, M10, M11, G, N, N9, N9a, Y, A, F, B4`5, B5) 대상으로 multiplex SNaPshot system을 구성하였다 (도 1).
실시예 1. PCR 증폭 프라이머 세트 제작
Phylotree.org를 참고하여 20개의 하플로그룹을 결정하기 위한 돌연변이 부위 (mutation sites(motifs))를 선정하고, 코팅 부위(coding region)의 각 변이를 증폭하고 타이핑하기 위해서 rCRS (revised Cambridge Reference Sequence)를 참고하여 프라이머를 설계하였다. 가까운 거리에 위치하고 있는 변이는 한 쌍의 프라이머로 두 개의 변이가 위치한 영역을 동시에 증폭하도록 설계하였으며, 증폭산물의 크기는 rCRS 기준으로 최소 84bp에서 최대 137bp가 되도록하여 심하게 손상된 시료에 대해서도 효과적으로 증폭할 수 있도록 하였다. 최종적으로 20개의 코딩 부위(coding region) 변이를 분석하기 위해서, PCR 증폭을 위한 17쌍의 프라이머 세트를 제작하였고, 이를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1에서 스타트는 5'의 첫 번째 염기번호(mtDNA는 rCRS라는 표준서열을 기준으로 그 표준서열의 염기번호를 나타냄)를 의미한다.
하플로그룹 스타트(start) 프라이머 앰플리콘 크기 (bp) 프라이머 농도
(pM)
염기서열 (5’-> 3’) 크기(bp)
M, D5 10358 AAGTCTGGCCTATGAGTGAC (서열번호 1) 20 128 0.80
10481 TGTAAATGAGGGGCATTTGG (서열번호 2) 20 0.80
F 10273 TTTTACCCCTACCATGAGCC (서열번호 3) 20 84 0.20
10356 GGGCTAGGATGATGATTAATAAGA (서열번호 4) 24 0.20
D, N9a
 5146 CGACCCTACTACTATCTCGC (서열번호 5) 20 135 0.70
5280 TGAATTCTTCGATAATGGCCC (서열번호 6) 21 0.70
D4
 2929 CTAGGGATAACAGCGCAATC (서열번호 7) 20 110 0.20
3038 AACGAACCTTTAATAGCGGC (서열번호 8) 20 0.20
M7
 9742 CAGAGTACTTCGAGTCTCCC (서열번호 9) 20 126 0.65
9867 GGATGAAGCAGATAGTGAGGA (서열번호 10) 21 0.65
M8
 15434 CTCGGCTTACTTCTCTTCCT (서열번호 11) 20 96 0.75
15529 GGGGTTGGCTAGGGTATAAT (서열번호 12) 20 0.75
M9
 4430 CCCATACCCCGAAAATGTTG (서열번호 13) 20 88 0.50
4517 GCCTGCAAAGATGGTAGAGT (서열번호 14) 20 0.50
M10, A
 8761 ATTGCCACAACTAACCTCCT (서열번호 15) 20 81 0.90
8841 GGCCATGGCTAGGTTTATAG (서열번호 16) 20 0.90
M11
 11893 ACTCTCTGTGCTAGTAACCAC (서열번호 17) 21 121 0.50
12013 TGAGCCCCATTGTGTTGTG (서열번호 18) 19 0.50
G
 4791 ATAGCCCCCTTTCACTTCTG (서열번호 19) 20 137 0.50
4927 AGGCTTACGTTTAGTGAGGG (서열번호 20) 20 0.50
N 10827 TTTGAATCAACACAACCACCC (서열번호 21) 21 99 0.50
10925 AGGTTGGGGAACAGCTAAAT (서열번호 22) 20 0.50
N9
 5352 CGCCTAATCTACTCCACCTC (서열번호 23) 20 91 0.25
5442 ATGGGGTGGGTTTTGTATGT (서열번호 24) 20 0.25
Y
 14156 CCCCGAGCAATCTCAATTAC (서열번호 25) 20 141 0.75
14296 TTATGAAGGAGAGGGGTCAG (서열번호 26) 20 0.75
B4'5
 8194 CCACAGTTTCATGCCCATC (서열번호 27) 19 117 0.50
8310 AGTTAGCTTTACAGTGGGCT (서열번호 28) 20 0.50
D4a
 14946 CCCACATCACTCGAGACG (서열번호 29) 18 119 0.60
15064 TGATCCGTAATATAGGCCTCG (서열번호 30) 21 0.60
D4b
 7922 TACGGCGGACTAATCTTCAA (서열번호 31) 20 120 0.50
8041 TATACGAATGGGGGCTTCAA (서열번호 32) 20 0.50
B5
 8531 ACGAAAATCTGTTCGCTTCA (서열번호 33) 20 98 0.20
8628 GGAGGTGGGGATCAATAGAG (서열번호 34) 20 0.20
실시예 2. 변이 분석을 위한 프라이머 세트 제작 ( SNaPshot multiplex kit )
rCRS를 기준으로 Primer 3 plus와 SBEprimer 프로그램을 이용하여 프라이머를Applied 제작하였는데, 구체적으로 AutoDimer를 이용하여 상호간의 프라이머 다이머와(primer dimer)와 헤어핀(hairpin) 형성여부를 확인함으로써, Biosystems의 SNaPshot multiplex kit를 이용하여 각 변이를 분석할 수 있는 20개의 프라이머 세트를 제작하였고, 이를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2에서 뉴트럴은 반응에는 작용하지 않고 스냅샷 결과에서 길이에 차이를 주기 위한 중립 서열을 의미하며, (c)10은 사이토신 염기가 10개 연속으로 나열되었다는 의미이고, (gact)4는 gactgactgactgact로 동일하게 4번 반복되어 있다는 의미이다.
또한, 표 2에서 결과는 해당 하플로그룹에 해당될 경우 나타나는 변이형을 의미하는데, 예를 들어 하플로그룹 B5에서 G > A로 표시되어 있는 것은 8543번째 염기가 G에서 A로 돌연변이되었을 경우 하플로그룹 B5에 해당한다는 의미이다.
하플로
그룹		 모티프 뉴트럴(Neutral) 프라이머 프라이머농도
(pM)		 결과(Result)
염기서열(5’-> 3’) 크기
(bp)
B5 G8584A none AATCCTAGGCCTACCCGCC (서열번호 35) 19 0.30 G > A
D4b G8020A none TATACGAATGGGGGCTTCAAT (서열번호 36) 21 0.30 C > T
N C10873T none ACAGCCTAATTATTAGCATCATCCC (서열번호 37) 25 0.20 C > T
M C10400T none TCGTTTTGTTTAAACTATATACCAATTC (서열번호 38) 28 0.30 G > A
D C5178a (C)10 ACTATCTCGCACCTGAAACAAG (서열번호 39) 32 0.50 C > A
N9 G5417A None CCCATATCTAACAACGTAAAAATAAAATGACA (서열번호 40) 32 0.20 G > A
D4a T14979C None CGAGACGTAAATTATGGCTGAA (서열번호 41) 34 0.40 T > C
N9a G5231A (gact)4cc CCTCTCCCTAGGAGGCCT (서열번호 42) 36 0.30 G > A
M10 T8793C (gact)4(C)4 CCCTCCTCGGACTCCTGCC (서열번호 43) 39 0.25 T > C
F G10310A (gact)4 ATGAGCCCTACAAACAACTAACCT (서열번호 44) 40 0.30 G > A
M9 G4491A (gact)5 CCTGCAAAGATGGTAGAGTAGATGA (서열번호 45) 45 0.50 C > T
G A4833G (gact)4(c)11 CCAGAGGTTACCCAAGGC (서열번호 46) 45 0.60 A > G
M8 A15487t (gact)5ga CTTAATGACATTAACACTATTCTCACC (서열번호 47) 49 0.60 A > T
B4'5 8281-8289d (gact)4(c)13 ACCCTATAGCACCCCCTCTA (서열번호 48) 49 0.45 C > G
D4 G3010A (gact)7gac CGATGTTGGATCAGGACATCCC (서열번호 49) 53 0.40 G > A
M7 T9824C (gact)9ga CCACAGGCTTCCACGGACT (서열번호 50) 57 0.55 T > C
A C8794T (gact)4(c)4(gact)4 GGGTGGTTGGTGTAAATGAGT (서열번호 51) 57 0.20 G > A
D5 A10397G (gact)9 AGTGACTACAAAAAGGATTAGACTG (서열번호 52) 61 0.70 A > G
Y T14178C (gact)9gac GTTGAACATTGTTTGTTGGTGTATAT (서열번호 53) 65 0.65 A > G
M11 G11969A (gact)11 TACAGGACTCAACATACTAGTCACA (서열번호 54) 69 0.30 G > A
실시예 3. MtDNA 하플로그룹 변이 분석을 위한 증폭 및 검출
3.1
PCR 증폭은 10㎕ PCR 반응 용액(1㎕ DNA, 상기 실시예 1(표 1)의 프라이머, 0.8mM dNTP, 40mM MgCl2, 1x Gold Buffer, 1U AmpliTaq Gold DNA polymerase)을 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler(Applied Biosystems, USA)에서 95℃에서 10분간 초기 변성(initial denaturation)시킨 후, 94℃에서 15초, 60℃에서 15초, 72℃에서 30초의 주기로 35회 반응하고, 70℃에서 10분간 마지막으로 신장(last extension)하였다. PCR 증폭여부는 2% 아가로스 겔에서 PCR 증폭산물 2㎕와 6x loading star(Dynebio, Korea) 0.5㎕를 혼합하여 각 웰(well)에 넣은 후 100V에서 30분간 전기영동하고, UV transilluminator에서 증폭산물을 확인하였다. 증폭여부가 확인된 PCR 증폭산물에는 Exo-SAP IT(Affymetrix, USA)을 1㎕ 첨가하였고, 37℃에서 1시간 반응하여 잔여 dNTPs와 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer)를 제거하였으며, 80℃에서 15분간 반응하여 효소들을 비활성화(inactivation) 시켰다.
3.2
SNaPshot 반응은 6㎕ PCR reaction 용액(1㎕ 상기 3.1의 PCR 증폭 산물, 상기 실시예 1(표 2)의 프라이머, 1㎕ SNaPshot reaction mix)을 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler(Applied Biosystems, USA)에서 96℃에서 2분간 초기 변성(initial denaturation)시킨 후, 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 30초의 주기로 25회 반응하였다. 반응이 완료된 반응산물에는 SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase; Affymetrix, USA) 1㎕를 첨가하였고, 37℃에서 1시간동안 반응하여 SNaPshot reaction mix의 잔여 ddNTPs를 제거하였으며, 65℃에서 15분간 첨가된 SAP 효소를 비활성화(inactivation) 시켰다.
SNaPshot 반응 결과는 LIZ 120 size standard(Applied Biosystems, USA)와 함께 ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)에서 모세관 전기영동을 수행한 후, GeneMapper v4.1 softwate(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 스냅샷 타이핑의 결과 화면으로, 각 피크는 하나의 하플로그룹 모티프를 의미하며, 색을 통해서 염기를 판단하여 변이가 있을 경우 해당 하플로그룹으로 결정하게 된다. 가로는 증폭산물의 크기(fragment size)이며 단위는 bp(base pair)이고, 세로는 RFU(relative fluorescence unit)으로 상대적인 형광의 양을 의미하며, 증폭산물의 양이 많을수록 피크의 높이가 높아지게 된다.
도 2에 나타난 바와 같이, 크기와 표지된 형광 염료(dye)의 색에 따라 피크(peak)로 각각의 코딩 부위(coding region) SNP 변이가 나타났고, GeneMapper에서 설정된 패널에 의해 피크의 사이즈를 분석하여 변이를 판정하여 하플로그룹을 분석하였다.
<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> MARKER COMPOSITION FOR ANALYSIS OF MATERNAL LINEAGE IN KOREAN <130> HY141186 <160> 54 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aagtctggcc tatgagtgac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgtaaatgag gggcatttgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttttacccct accatgagcc 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gggctaggat gatgattaat aaga 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgaccctact actatctcgc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgaattcttc gataatggcc c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctagggataa cagcgcaatc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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primer <400> 36 tatacgaatg ggggcttcaa t 21 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 acagcctaat tattagcatc atccc 25 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 tcgttttgtt taaactatat accaattc 28 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 actatctcgc acctgaaaca ag 22 <210> 40 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 cccatatcta acaacgtaaa aataaaatga ca 32 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cgagacgtaa attatggctg aa 22 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 cctctcccta ggaggcct 18 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 ccctcctcgg actcctgcc 19 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 atgagcccta caaacaacta acct 24 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 cctgcaaaga tggtagagta gatga 25 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 ccagaggtta cccaaggc 18 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 cttaatgaca ttaacactat tctcacc 27 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 accctatagc accccctcta 20 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 cgatgttgga tcaggacatc cc 22 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 ccacaggctt ccacggact 19 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gggtggttgg tgtaaatgag t 21 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 agtgactaca aaaaggatta gactg 25 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 gttgaacatt gtttgttggt gtatat 26 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 tacaggactc aacatactag tcaca 25

Claims (6)

  1. 서열번호 1 내지 34의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트, 및 서열번호 35 내지 54의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 한국인 모계 계통 분석용 마커 조성물.
  2. 서열번호 1 내지 34의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트, 및 서열번호 35 내지 54의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 한국인 모계 계통 분석 키트.
  3. (a) 대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 34의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭하는 단계에서 증폭된 산물의 염기서열을 서열번호 35 내지 54의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 분석하는 단계를 포함하는 한국인 모계 계통 분석 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 (b) 단계의 표적 서열 증폭은 중합효소 연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction), real-time PCR, 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 및 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 한국인 모계 계통 분석 방법.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 (c) 단계의 분석은 스냅샷(sNaPShot) 분석 방법, DNA 칩 방법, TaqMan 프로브 및 대립형질(allele) 특이적 혼성화 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 한국인 모계 계통 분석 방법.
  6. 청구항 3에 있어서,
    상기 DNA는 인간의 미토콘드리아 DNA (mtDNA)인 것인, 한국인 모계 계통 분석 방법.
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
<Genes & Genomics(구 한국유전학회지)> 13권2호 (1991), pp.83-96
김기범, '한국인 미토콘드리아 DNA D-loop 부위의 다형성과 법의학적 응용', 서울대학교대학원 박사학위논문 (2000)
김욱, '한국인 집단의 모계 집단구조 및 법유전학적 분석을 위한 계통기반 미토콘드리아 DNA 분석키트 개발' 국립과학수사연구원 (2013.12.)

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