KR20080073321A

KR20080073321A - 핵산 혼성화에서 Ｃｏｔ-1 ＤＮＡ 왜곡의 완화

Info

Publication number: KR20080073321A
Application number: KR1020087013583A
Authority: KR
Inventors: 피터 케이. 로간; 존 크놀; 헤이더 엘. 뉴커크
Original assignee: 더 칠드런스 머시 호스피탈
Priority date: 2005-11-18
Filing date: 2006-11-17
Publication date: 2008-08-08
Also published as: WO2007073523A2; MX2008007626A; US7833713B2; EP1979490A4; AU2006327111A1; WO2007073523A3; JP2009518004A; BRPI0618721A2; EP1979490A2; WO2007073523A8; US20080050728A1; US20110077165A1; CA2630416A1

Abstract

복수의 반복 요소를 보유하지만 적은 사본 서열과 단일 사본 서열을 피하도록 합성된 DNA를 이용하여, 핵산 프로브 내에 존재하는 반복 요소와 표적 핵산 내에 존재하는 상응하는 반복 요소 사이에 비-특이적 교차-혼성화(cross-hybridization)를 억제하는 신규한 방법.

교차-혼성화

Description

핵산 혼성화에서 Ｃｏｔ-1 ＤＮＡ 왜곡의 완화{MITIGATION OF Cot-1 DNA DISTORTION IN NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION}

관련된 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2005년 11월 18일자 제출된 U.S. 가출원 No. No. 60/737,986에 우선권을 주장한다.

서열 목록

본 명세서에 참조로서 편입되는 인쇄된 서열 목록은 본 출원에 동반되고, U.S.P.T.O의 전자 출원 시스템에서 컴퓨터-판독가능 ASCII 파일 형태로 동일한 내용이 제출되었다.

본 발명의 기술 분야

본 발명은 표적 게놈 또는 전사체(transcriptome) 내에 존재하는 반복 요소와 핵산 프로브 내에 존재하는 상응하는 반복 요소 사이에 비-특이적 교차-혼성화를 억제하면서 상기 프로브 내에 단일 사본 서열과 억제 DNA 내에 우발적인 단일 사본 서열 사이에 우발적인 혼성화를 피하기 위한 물질과 방법에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 단일 사본 요소가 실질적으로 부재하는 억제성 합성 반복 DNA의 개발과 이용과 함께, 반복 서열이 실질적으로 부재하는 프로브의 개발과 이용에 관계한다. 이보다 더욱 구체적으로, 이런 반복 DNA는 하나이상의 대표적인 게 놈 영역 내에서 단일 사본 요소에 인접하는 중간 내지 높은 사본 반복 요소에 상응하는 반복 서열을 포함한다.

유전자 발현과 좌위 사본수(copy number)의 게놈-범위 분석은 마이크로어레이와 어레이-기초된 비교 게놈 혼성화에 의해 용이하다. 이들 기술의 재현성(reproducibility)에 관련된 지속적인 문제점이 상이한 연구소에서 교차-검증 연구에 의해 제기되고 있다(1~5). 복제 연구(replicate study)에서 획득된 결과에서 변이성(variability)을 완화시키는 전략은 표준화 기술 인자(standardizing technical factor), 예를 들면, 어레이 생산(array production), RNA 합성, 표지화(labeling), 혼성화, 스캐닝(scanning), 데이터 분석(date analysis)에 집중되고 있다(6~8). Zakharkin 등(9)은 표본 간에 생물학적 차이가 이런 변이성의 최대 근원이고, 이들 다른 인자가 다소 덜한 정도로 기여한다고 제안한다.

혼성화 프로브를 이용하여 DNA를 분석할 때, 표적 DNA 내에 반복 서열은 전형적으로, 프로브 내에 반복 요소와 표적 내에 상동한 반복 요소 사이에 높은 배경 혼성화(background hybridization)를 피하기 위하여, 프로브의 표적에 대한 혼성화에 앞서 차단되어야 한다.

반복 서열(repeat sequence)은 반수체(haploid) 게놈 내에 복수 사본에서 나타난다. 사본의 수는 두 개에서부터 수십만 개까지 변할 수 있는데, 여기서 반복 DNA의 Alu 집단은 후자의 다양한 변종(variety)의 전형이다. 반복의 사본은 집합되거나, 또는 전체 게놈에 산재된다. 반복은 게놈 내에서 하나이상의 좌위에 집합된 다(가령, 각 크로모좀(chromosome)의 중심립(centromere) 인근에 나타나는 반복 서열 및 가변 연속 반복(variable number tandem repeat, VNTR) Nakamura et al, Science, 235: 1616 (1987); 또는, 반복은 단일 염색체에서 분산된다(가령, Bardoni et al. Cytogenet Cell Genet., 46; 575 (1987)에 기술된 바와 같이 X 염색체에서만 관찰되는 반복); 또는, 반복은 모든 염색체에서 분산된다(가령, Alu 계통의 반복 서열).

낮은 복잡성(complexity)의 단일 반복이 유전자 내에서 관찰될 수 있긴 하지만 비-코딩 서열 내에서 더욱 빈번하게 관찰된다. 이들 반복된 요소는 직렬 단위(tandem unit)로 정렬된 모노-, 디-, 트리-, 테트라-, 또는 펜타-뉴클레오티드 코어 서열 요소로 구성된다. 종종, 이들 반복된 서열을 포함하는 직렬 단위의 총수는 상이한 개체로부터 유래된 게놈 간에 동일한 위치에서 변이한다. 이들 반복 요소는 게놈 서열 내에서 코어 서열 요소의 연속 작업(consecutive run)을 검색함으로써 발견될 수 있다.

억제 혼성화(suppression hybridization)로 알려져 있는 경쟁 혼성화(competition hybridization)는 잠재적으로 과도한 반복 DNA 신호를 차단하는 수단을 제공한다. 표지되지 않은 경쟁자 또는 억제자 DNA는 표적 내에 상동한 반복 요소에 결합하는 반복 요소의 높은 발생률(high incident)을 보유하고, 따라서 표지된 프로브의 반복 부분이 표적 내에 이런 반복 요소에 결합하는 것을 예방하고 프로브가 표적된, 전형적으로 비-반복 서열에 실질적으로 혼성화되는 가능성을 증가시킨다.

프로브 내에 존재하는 반복 요소 사이에서 게놈(또는 전사체) 내에 다른 위치와의 비-특이적 교차 혼성화를 억제하거나 차단하는 반복 서열-풍부한(Cot-1) DNA의 이용은 대부분의 마이크로어레이 혼성화 연구를 위한 공통적인 필요사항이다. FISH에 앞서 표적 DNA에 Cot-1과 같은 억제자 DNA의 혼성화는 배경, 다시 말하면, 비-특이적 혼성화를 피하기 위하여 선행 기술에 통상적으로 수행된다. 인간에서, Cot-1 분획(fraction)은 산재된 반복 요소, 예를 들면, 짧고 긴 산재된 반복 요소, SINEs와 LINEs(10, 11)의 집단에서 고도로 축적된다. Cot-1 DNA 제조를 위한 상업적인 절차는 게놈 DNA의 변성(denaturation)과 재-어닐링(re-annealing)을 되풀이하고, Alu 요소(정상적인 게놈에서 상응하는 수준보다 3배 초과)와 Ll 요소(정상적인 게놈에서 상응하는 수준보다 4배 초과)에 대한 축적(enrichment)으로 모니터된다. 현재의 품질 제어 절차(quality control procedure)는 Cot-1 DNA의 정확한 조성이나 서열을 결정하지 못한다.

이러한 Cot-1 분획이 프로브의 반복 요소와 표적 DNA의 상응하는 또는 상동한 반복 요소 사이의 비-특이적 혼성화를 억제하는 것으로 보이긴 하지만, 이는 또한, 실험적 소음(experimental noise)(12)을 증가시킨다(도 1). 이런 이유로, Cot-1 조성에서 차이가 게놈 혼성화 연구로부터 결과에서 변이성의 주요 근원이 될 수 있는 지를 조사하였다. 게놈 혼성화에서 Cot-1의 역할은 서열-정의된, 게놈 단일 사본(sc) 프로브(14) 및 연속 sc와 반복 게놈 서열로 구성되는 프로브를 이용한 정량적 미소구 혼성화(QMH)(13,20)에 의해 설명되었다. Cot-1은 종종, 프로브에 무관한 인접한 파라로거스(paralogous) 반복 서열을 보유하는 안정적인 이중나선(Cot-1 DNA 내에 단일 사본 서열에 혼성화된 프로브 서열 내에 단일 사본 서열)의 형성을 촉진하고, 따라서 단일 사본 서열 혼성화의 정확한 정량을 방해하는 것으로 확인되었다. 프로브 내에 상동성 단일 사본 요소에 혼성화된 Cot-1 내에 단일 사본 요소의 발생은 프로브 신호를 왜곡한다(가성 증폭한다).

도 1에서는 게놈 DNA 표적(100)에 Cot-1(105)의 혼성화가 표적(100) 내에 반복 요소(115)가 프로브(110) 내에 파라로거스 반복 요소(120)와의 혼성화에 이용되는 것을 억제하거나 차단한다는 것을 증명한다. 반복 요소(115)는 Cot-1 DNA(105) 내에서 억제성 반복 요소(117)에 대하여 병렬로 도시되고, 따라서 요소(115와 117)의 혼성화를 지시한다. 선행 기술에서 전형인 바와 같이, 프로브(110)는 단일 사본 요소(135)와 우발적인 반복 요소(120)를 모두 포함하는데, 단일 사본 요소(135)는 표적(100) 내에 상동한 단일 사본 요소(140)에 선택적으로 혼성화되도록 선택되고 합성된다. 예시된 바와 같이, 프로브(110)는 프로브(110) 탐지와 정량에 이용되는 미소구(145)에 공액된다. 프로브(110)는 이러한 연구 설계에서 예상된 바와 같이, 표적(100)에 혼성화되는 것으로 나타난다. 하지만, Cot-1(105) 내에 단일 사본 요소(130)는 표적(115) 내에 반복 요소에 혼성화될 뿐만 아니라 프로브(125) 내에 상동한 단일 사본 요소(135)에도 혼성화되고, 따라서 프로브 신호를 3배 증가시킨다.

2006년 8월 16일자 제출된 특허 출원 PCT/US2006/032693 "Quantification of Microsphere Suspension Hybridization and Uses Thereof"에서는 세포분석법(flow cytometry)을 이용한 전체 게놈 DNA(또는 RNA)의 직접적인 분석을 가능하게 하는 적은 또는 단일 사본 게놈 혼성화 프로브를 활용하는 미소구 현탁 혼성화 측정검사 법을 기술하고, 본 명세서에 참고로서 편입된다.

따라서, 당분야에는 핵산 프로브의 Cot-1 DNA 내에 존재하는 요소에 혼성화에 의해 유발되는 신호 왜곡을 억제하는 방법; 프로브의 표적 DNA에 비-특이적 혼성화를 억제하는 방법; 억제 또는 경쟁 DNA의 표적 내에서와 프로브 내에서 단일 사본 서열에 혼성화를 억제하는 방법; 억제성 반복 DNA를 확인하고 합성하는 방법; 억제자 DNA로서 이용에 유용한 합성된 반복 DNA 산물; 반복 요소가 실질적으로 부재하는 단일 사본 프로브와의 조합으로 이런 합성된 억제성 DNA를 활용하는 핵산 혼성화 시스템이 필요하다.

본 발명의 요약

본 발명은 앞서 언급된 문제점을 극복하고, 반복 요소가 풍부하지만 단일 또는 적은 사본 요소가 실질적으로 부재하도록 합성된 억제성 핵산으로 Cot-1의 대체를 통하여 Cot-1 DNA의 결과-왜곡 효과를 억제하는 신규한 방법과 산물을 제공한다. 일반적으로 말하면, 본 발명의 방법은 합성 억제 DNA를 제조하는 단계; 및 프로브와 표적의 혼성화에 앞서 표적 내에서 반복 서열을 차단하기 위하여 상기 억제 DNA를 표적 게놈 DNA에 혼성화시키는 단계를 포함한다. 적절하게는, 프로브는 반복 요소가 부재하거나 실질적으로 부재하고, 억제 DNA는 단일 또는 적은 사본 DNA 스트레치가 부재하거나 실질적으로 부재한다. 일부 바람직한 형태에서, 상기 방법은 선택된, 적은 사본, 합성 DNA 서열에 스펙트럼-인코딩된 폴리스티렌 미소구를 결함시킴으로써 혼성화 프로브를 제조하는 단계; 표적 게놈 DNA를 본 발명의 합성, 억제성 또는 차단성 DNA와 사전 혼성화(pre-hybridization)시키는 단계: 상기 프로브를 표적 게놈 DNA에 혼성화시키는 단계; 혼성화 산물을 유세포분석법으로 탐지하는 단계를 포함한다. 결과로써, 혼성화 측정검사에서 Cot-1에 의해 유발되는 입증된 신호 왜곡은 단일 사본 서열이 부재하거나 실질적으로 부재하고, 바람직하게는, 적은 사본 서열이 부재하거나 실질적으로 부재하는 합성 반복 요소에 표적의 사전 혼성화를 통하여 교차-혼성화를 억제함으로써 완화되었다.

현재의 혼성화 측정검사와 달리, 본 발명에 따른 측정검사는 경쟁 단일(적은) 사본 요소를 보유하지 않으면서 선택된 반복 요소를 보유하도록 개발된 합성 DNA로 Cot-1 억제성 DNA를 치환한다. 적절하게는, 본 발명의 합성 DNA는 목적하는 단일(또는 적은) 사본 서열과 혼성화되도록 설계된 단일(또는 적은) 사본 혼성화 프로브의 서열에 상응하거나, 또는 이러한 서열과 상동한 목적하는 단일(또는 적은) 사본 서열에 접하는 표적 DNA의 반복 영역과의 상동성(homology)으로 인하여 선택된다.

본 발명의 방법과 산물은 (1) 억제 DNA 내에 반복 요소와 프로브 내에 상동성 요소 사이에, (2) 프로브 내에 단일 또는 적은 사본 요소와 억제 DNA 내에 상동성 단일(또는 적은) 사본 요소 사이에, (3) 프로브 내에 반복 요소와 표적 게놈 서열 내에 상동성 요소 사이에 우발적인 교차-혼성화의 완화에 유용하다. 적절하게는, 본 발명에 따라, 단일 또는 적은 사본 프로브는 반복 요소가 실질적으로, 더욱 바람직하게는, 완전히 부재하고, 억제 DNA는 단일 또는 적은 사본 요소가 실질적으로, 더욱 바람직하게는, 완전히 부재하도록 합성된다.

도 2에서는 표적 내에서 반복 요소(215)를 억제하거나 차단하기 위하여 게놈 DNA 표적(200)에 합성 억제성 DNA(205)의 혼성화를 도시한다. 도시된 바와 같이, 상기 합성 억제성 DNA(205)는 프로브(210) 내에 단일 또는 적은 사본 요소(235) 또는 표적(200) 내에 단일 또는 적은 사본 요소(240)와 혼성화되는 우발적인 단일 또는 적은 사본 요소를 나타내지 않고, 따라서 이러한 측정검사에서 단일 또는 적은 사본 요소의 교차-혼성화를 현저하게 감소시킨다. 적절하게는, 프로브(210)는 하나이상의 단일 또는 적은 사본 요소(235)를 포함하지만 억제성 DNA(205) 또는 표적(200) 내에 상동한 반복에 혼성화될 수도 있는 반복 요소가 부재하도록 합성된다. 도 2에서. 프로브 신호는 표적(200) 내에 단일 또는 적은 사본 요소(240)와 직접적으로 1:1 대응한다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 핵산 프로브 내에 존재하는 반복 서열과 표적 게놈 핵산 내에 존재하는 상동한 반복 서열 사이에 비-특이적 교차-혼성화를 억제하는 방법을 제시한다. 일반적으로, 상기 방법은 대표적인 게놈 영역 내에서 반복 서열을 확인하는 단계, 확인된 반복 서열로부터 유래된 억제성 핵산을 합성하는 단계, 억제성 핵산과 표적 핵산을 반응시키는 단계를 포함한다. 적절하게는, 억제성 핵산은 짧은 산재된 요소, 긴 산재된 요소, 긴 말단 반복, Alu 요소, L1 요소, 또는 DNA 트랜스포손(transposon)에서 선택되는 하나이상의 서열-정의된 PCR 산물을 포함한다. 이러한 반응은 억제성 핵산 내에 반복 서열이 표적 핵산 내에 상동한 반복 서열에 혼성화되도록 하여 표적 핵산 내에 반복 서열이 차후에 반응되는 핵산 프로브 내에 상동한 반복 서열과 혼성화되는 것을 실질적으로 차단하고, 결과로써, 프로브 내에 반복 서열과 표적 핵산 내에 상동한 반복 서열 사이에 비-특이적인 교차-혼성화를 억제한다. 이러한 억제 작용은 확인된 반복 서열로 실질적으로 구성되지만 적은 사본 서열이 실질적으로 부재하는 억제성 핵산을 보유함으로써 현저하게 강화된다. 적절하게는, 억제성 핵산은 적은 사본 서열이 완전히 부재하도록 합성된다. 바람직한 형태에서, 표적 핵산은 적은 사본 서열을 포함한다. 적절하게는, 억제성 핵산은 하나이상의 대표적인 게놈 영역 내에서 적은 사본 서열에 인접하는 것으로 밝혀진 반복 서열에 상응하게 선택되는 복수의 반복 서열을 보유하도록 합성된다. 일부 바람직한 형태에서, 상기 방법은 표적 내에 적은 사본 서열에 상동한 적은 사본 서열을 보유하는 하나이상의 프로브와 표적 핵산을 혼성화시키는 단계가 추가로 포함된다. 바람직한 형태에서, 프로브는 반복 서열이 실질적으로, 더욱 바람직하게는, 완전히 부재한다. 다른 바람직한 형태에서, 상기 방법은 스펙트럼-인코딩된 폴리스티렌 미소구에 프로브를 공액하는 단계가 추가로 포함된다. 적절하게는, 프로브는 유용성(utility)을 강화시키기 위하여 탐지가능 모이어티(moiety)로 표지된다. 일부 바람직한 탐지가능 모이어티는 형광단(fluorophore), 효소 공액체, 형광단-태그된 뉴클레오티드, 항원-보유 뉴클레오티드에 결합된 형광-표지된 항체, 비오틴-dUTP, 디곡시제닌-dUTP, 또는 이들의 조합이다. 본 명세서에 기술되고 교시된 방법은 마이크로어레이 혼성화 측정검사, 형광 in situ 혼성화 측정검사, 또는 미소구 혼성화 측정검사에서 선택되는 측정검사를 비롯하여, Cot-1 DNA가 이용되었거나 이용될 수 있는 임의의 절차에서 이용될 수 있다.

다른 측면은 억제 핵산을 합성하는 방법을 제시한다. 이런 방법은 일반적으로, 대표적인 게놈 영역 내에서 반복 서열을 확인하는 단계; 상기 확인된 반복 서열과 혼성화되지만 대표적인 게놈 영역 내외에서 적은 사본 서열과 혼성화되지 않는 핵산 서열을 합성함으로써 억제성 핵산을 합성하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 합성된 억제 핵산은 적은 사본 서열이 실질적으로 부재한다. 일부 바람직한 형태에서, 상기 방법은 목적하는 적은 사본 서열에 대한 근접성(proximity)에 기초하여, 억제 핵산으로서 합성을 위한 특정의 확인된 반복 서열을 선택하는 단계가 추가로 포함될 수 있다. 적절하게는, 이런 특정의 확인된 반복 서열은 목적하는 적은 사본 서열에 가장 근접하는 서열이다. 적절하게는, 합성된 억제 핵산은 목적하는 적은 사본 서열과 혼성화되는 서열이 부재한다. 물론, 본 발명에 따른 합성된 억제성 핵산은 혼성화 측정검사, 특히, Cot-1 또는 차단성 DNA를 이용할 수 있는 혼성화 측정검사에 이용될 수 있다. 일부 바람직한 혼성화 측정검사는 형광 in situ 혼성화 측정검사, 마이크로어레이 측정검사, 또는 미소구 혼성화 측정검사다.

본 발명의 다른 측면은 적은 사본수 핵산 프로브와 표적 핵산 내에 상동성 영역 사이에 혼성화 특이성(hybridization specificity)을 증가시키는 신규한 방법을 제시한다. 일반적으로, 이런 방법은 아래의 단계를 포함한다: 표적 핵산 내에 반복 요소를 억제성 핵산 내에 상동한 반복 요소와 혼성화시키는 단계, 여기서 상기 억제성 핵산은 복수의 반복 요소를 포함하고 적은 사본수 요소가 실질적으로, 더욱 바람직하게는, 완전히 부재하며; 상기 표적 핵산 내에 적은 사본수 요소를 하나이상의 핵산 프로브 내에 상동한 적은 사본수 요소와 혼성화시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 억제성 핵산 내에 반복 요소는 하나이상의 대표적인 게놈 영역 내에 적은 사본 요소에 접하는 반복 요소에 실질적인 상동성을 갖도록 선택된다. 더욱 적절하게는, 측면 반복 요소는 중간 내지 높은 사본수를 갖고, 적은 사본 요소는 단일 사본 요소를 포함한다. 이보다 더욱 적절하게는, 프로브는 반복 요소가 실질적으로 부재한다.

본 발명의 다른 측면은 핵산 서열 사본수를 정확하게 정량하는 방법을 제시한다. 일반적으로, 이런 방법은 아래의 단계를 포함한다: 일차 스펙트럼 주소(spectral address)를 갖는 일차, 스펙트럼-인코딩된 형광 미소구 및 이차 스펙트럼 주소를 갖는 이차, 스펙트럼-인코딩된 형광 미소구를 제조하는 단계; 목적하는 서열이 위치하는 것으로 의심되는 표적 핵산 서열을 각 뉴클레오티드 서열별로 확정함으로써 표적 게놈 핵산 프로브 서열을 확인하는 단계; 상기 확인된 표적 게놈 핵산 프로브 서열로부터 유래된 적은 사본 표적 프로브를 합성하는 단계, 상기 표적 프로브는 최소한 하나의 적은 사본 요소를 포함하고 반복 요소가 실질적으로 부재하며; 상기 표적 프로브를 상기 일차 미소구에 공액하는 단계; 상기 표적 핵산 서열의 참고 핵산 서열에 혼성화되도록 선택되는 참고 프로브를 합성하는 단계; 상기 참고 프로브를 이차 스펙트럼 주소를 갖는 미소구에 공액하는 단계; 대표적인 게놈 영역 내에서 반복 서열을 확인하는 단계; 억제성 핵산을 합성하는 단계, 상기 억제성 핵산은 상기 확인된 반복 서열에 혼성화될 만큼 충분히 상동한 서열을 포함하고, 상기 억제성 핵산은 반복 요소를 실질적으로 포함하고 적은 사본 요소가 실질적으로 부재하며; 상기 억제성 핵산을 염색체 표적 서열과 반응시켜, 상기 억제성 핵산 내에 반복 요소가 상기 염색체 표적 서열 내에 상동한 반복 요소와 혼성화되도록 하는 단계; 상기 표적 프로브를 상기 염색체 표적 서열에 반응시켜, 상기 표적 프로브 내에 적은 사본 요소가 상기 염색체 표적 서열 내에 상동한 적은 사본 요소에 혼성화되도록 하는 단계; 상기 억제성 핵산을 상기 염색체 표적 서열을 보유하는 염색체 참고 서열과 반응시켜, 상기 억제성 핵산 내에 반복 요소가 상기 염색체 참고 서열 내에 상동한 반복 요소에 혼성화되도록 하는 단계; 상기 참고 프로브를 상기 염색체 참고 서열과 반응시켜, 상기 참고 프로브가 상기 염색체 참고 서열에 혼성화되도록 하는 단계; 일차 스펙트럼 주소를 통하여 혼성화된 표적 프로브를 탐지하는 단계; 이차 스펙트럼 주소를 통하여 혼성화된 참고 프로브를 탐지하는 단계; 탐지된 혼성화된 표적 프로브의 반응을 탐지된 혼성화된 참고 프로브의 반응과 비교함으로써 탐지된 표적 프로브를 정량하는 단계. 바람직한 형태에서, 억제성 DNA는 반복 요소를 포함하고, 상기 반복 요소는 표적 내에 적은 사본 요소에 인접한 게놈 반복 요소에 상응한다.

본 발명의 다른 측면에서, 핵산 프로브 내에 존재하는 반복 요소와 표적 핵산 내에 존재하는 상동한 반복 요소 사이에 비-특이적 교차-혼성화를 억제하는 방법이 제시된다. 일반적으로, 상기 방법은 억제성 핵산을 하나이상의 적은 사본 요소를 보유하는 표적 핵산 내에 상동한 반복 요소와 혼성화시키는 단계를 포함한다. 적절하게는, 상기 억제성 핵산은 중간 내지 높은 사본수 반복 요소에 인접한 단일 사본 영역을 보유하는 하나이상의 대표적인 게놈 영역에 상응하게 선택된 복수의 반복 요소를 보유하고 적은 사본 요소가 실질적으로 부재하도록 합성되거나 선택된다. 이후, 상기 표적 핵산은 표적 내에 적은 사본 요소에 상동한 적은 사본 요소를 보유하는 하나이상의 프로브와 혼성화되고, 상기 프로브는 반복 서열이 실질적으로 부재한다.

본 발명의 다른 측면에서, 억제성 핵산 내에 존재하는 적은 사본 요소와 핵산 프로브 또는 표적 핵산 내에 존재하는 상동한 적은 사본 요소 사이에 비-특이적 교차-혼성화를 억제하는 방법이 제시된다. 일반적으로, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: 상기 표적 핵산 내외에서 반복 요소와 적은 사본 요소를 확인하는 단계; 합성 과정 동안 적은 사본 서열의 포함을 실질적으로 피하면서 상기 억제성 핵산 내에 포함을 위한 상기 표적 핵산으로부터 반복 서열을 선택함으로써 억제성 핵산 서열을 합성하는 단계; 상기 합성된 억제성 핵산을 상기 표적 핵산과 반응시켜, 개별 상동성 억제성 핵산과 표적 핵산 요소가 서로 혼성화되도록 하는 단계.

본 발명은 또한, 억제성 또는 차단성 DNA(가령, Cot-1 DNA)를 이용하여 측정검사의 정확도와 재현성을 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: 복수의 반복 요소를 보유하지만 적은 사본 서열이 실질적으로 부재하는 억제 핵산을 선택하거나 합성하는 단계; 및 상기 선택된 또는 합성된 억제 핵산을 Cot-1 DNA 대신으로 이용하는 단계.

본 발명의 다른 측면에서, 핵산 프로브로 게놈 표적 핵산의 우발적인 혼성화를 억제하는 방법이 제시된다. 일반적으로, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: 목적하는 서열에 상응하는 게놈 내에서 서열을 선택함으로써 혼성화를 위한 게놈 표적 핵산을 제조하는 단계; 목적하는 표적 서열 내에서 적은 사본 서열을 확인하는 단계; 상기 확인된 적은 사본 표적 서열에 상동한 적은 사본 프로브를 합성하는 단계, 상기 적은 사본 프로브는 반복 서열이 실질적으로 부재하고; 상기 표적 적은 사본 서열에 인접한 반복 서열을 확인하는 단계; 상기 표적 반복 서열에 상동한 억제 DNA를 합성하는 단계, 상기 억제 DNA는 반복 요소를 실질적으로 포함하고; 상기 표적 핵산을 상기 억제 DNA와 반응시켜, 억제 DNA 내에 상기 반복 요소가 표적 핵산 내에 상동한 반복 요소에 혼성화되도록 하는 단계; 상기 표적 핵산을 상기 적은 사본 프로브와 반응시켜, 상기 프로브 내에 적은 사본 요소가 상기 표적 핵산 내에 상동한 적은 사본 요소에 혼성화되도록 하는 단계; 상기 적은 사본 프로브를 탐지하여 상기 프로브의 상기 표적에 대한 혼성화를 정량하는 단계, 여기서, 상기 표적 핵산 내에서 적은 사본 요소의 사례가 확정될 수 있다.

정의

달리 명시하지 않는 경우에, 본 명세서에 이용되는 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에 평균적인 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 인용되는 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원과 다른 간행물 및 GenBank와 다른 데이터베이스로부터 서열은 순전히 참조로서 편입된다. 본 섹션에서 열거된 정의가 본 명세서에서 인용되는 출원, 공개된 출원과 다른 간행물 및 GenBank와 다른 데이터베이스로부터 서열에서 열거된 정의와 상반되거나 불일치하는 경우에, 본 섹션에서 열거된 정의가 본 명세서에 참조로서 편입되는 정의보다 우선한다.

본 명세서에서, "하나"는 표현은 "최소한 하나" 또는 "하나이상"을 의미한다.

본 명세서에서, "핵산"은 특히, 단일-가닥, 이중나선, 삼중나선, 선형과 원형 형태를 비롯한 임의 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 및/또는 리보핵산(RNA)을 지칭한다.

본 명세서에서, "서열"은 핵산 서열을 지칭한다.

본 명세서에서, "참고 프로브"는 2개 이외의 다른 사본수에서 매우 해롭고 치명적인, 게놈 내에서 가급적 상염색체 서열로부터 좌위에 특이적인 프로브를 의미한다. 이러한 참고 프로브는 환자 표본 내에서 정상적인 염색체 보체를 포함한다면, 낮은 또는 단일 사본 염색체 좌위로부터 유래될 수 있다. 선천성 질환의 진단을 위한 게놈 사본수의 결정에서, 참고 프로브는 전형적으로, 정상적인 발달 동안 2개의 대립유전자로부터 발현되어야 하는 하나이상의 유전자로부터 상염색체 기원일 것이다. 신생물 질환의 진단을 위한 게놈 사본수의 결정에서, 참고 프로브는 종양유전자가 없고 정상적인 염색체 보체를 포함하는 염색체 도메인으로부터 선택된다.

본 명세서에서, "라벨"은 탐지가능한 물리적 특성을 갖는 화학적 기 또는 모이어티, 또는 화학적 기 또는 모이어티가 탐지가능한 물리적 특성을 나타내도록 할 수 있는 임의의 화합물, 예를 들면, 기질의 탐지가능 산물로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다. "라벨"은 또한, 특정한 물리적 특성의 발현을 저해하는 화합물을 포괄한다. "라벨"은 결합 쌍의 한 구성원인 화합물일 수도 있는데, 이의 다른 구성원은 탐지가능한 물리적 특성을 갖는다. 전형적인 라벨에는 질량 기(mass group), 금속, 형광 기, 발광 기, 화학발광 기, 광학 기, 전하 기(charge group), 극성 기, 물감(colors), 합텐(hapten), 단백질 결합 리간드, 뉴클레오티드 서열, 방사성 기, 효소, 미립자 입자, 이들의 조합이 포함된다.

본 명세서에서, "표본"은 분석되는 표적 핵산을 포함하는 존재를 지칭한다. 표본은 생물학적 표본, 예를 들면, 생물학적 유체 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 실례에는 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액(cerebral spinal fluid), 눈물, 점액, 양수(amniotic fluid) 등이 포함된다. 생물학적 조직은 연결 조직, 상피 조직, 피부 조직, 근육 조직, 신경 조직을 비롯하여, 인간, 동물, 식물, 세균, 진균, 또는 바이러스 구조의 구조적 재료 중에서 하나를 형성하는 세포내 물질(intercellular substance)과 함께, 통상적으로 특정 종류의 세포 집합체이다. 생물학적 조직의 실례에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 예로써, 혈장, 혈액 또는 소변으로부터 분리되거나, 또는 고형 조직(solid tissue)의 콜라게나아제(collagenase) 처리에 의한 개별 세포의 집합 역시 포함된다.

본 명세서에서, "증폭"은 측정검사 민감성을 개선하기 위하여 표본 내에서 표적 분석물 핵산을 기하급수적으로 복제하는 방법을 지칭한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 핵산을 증폭하는 여러 상이한 방법이 당분야에 공지되어 있다.

본 명세서에서, "세트"는 단일 Ic 프로브 또는 Ic 프로브의 집합으로 공액된 동일한 스펙트럼 주소를 보유하는 미소구의 집합을 지칭한다.

본 명세서에서, "적은 사본" 또는 "Ic"는 게놈 내에 표적 핵산 또는 위치에서 10개 또는 그 이하의 서열 구간에 혼성화되는 서열을 지칭한다. 사본수는 바람직하게는, 10개 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는, 7개 또는 그 이하, 이보다 더욱 바람직하게는, 5개 또는 그 이하, 가장 바람직하게는, 3개 또는 그 이하다.

본 명세서에서, "단일 사본" 또는 "sc"는 게놈 내에 표적 핵산 또는 위치에서 3개 또는 그 이하의 서열 구간에 혼성화되는 핵산 서열을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 엄격하게 특이한 서열(즉, 상응하는 게놈 내에서 하나의 서열에만 상보성인 서열) 및 두플리콘(duplicon)과 트리플리콘(triplicon)을 포괄한다.

본 명세서에서, "고도로 반복되는"은 1000개 이상의 사본에 존재한다는 것을 의미한다.

본 명세서에서, "서열 동일성(sequence identity)"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 다시 말하면, 참고 서열(reference sequence) 및 참고 서열과 비교되는 특정 서열 사이의 상관관계를 의미한다. 서열 동일성은 최대의 서열 유사성(sequence similarity)이 달성되도록 특정 서열과 참고 서열을 최적으로 정렬한 이후, 이들 두 서열을 비교함으로써 결정된다, 예를 들면, 연속된 이들 서열 사이의 정합(match)으로 결정된다. 이런 정렬이후, 서열 동일성은 위치별( position-by-position) 기초에서 확인된다, 예를 들면, 이들 서열은 특정 위치에서 뉴클레오티드가 동일하면 상기 위치에서 "동일"하다. 이후, 이런 위치의 총수는 참고 서열에서 뉴클레오티드 또는 잔기의 총수로 나눗셈함으로써 서열 동일성 %를 제공한다. 서열 동일성은 Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)에 기술된 것들을 비롯한 공지된 방법으로 편의하게 산정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하는데 선호되는 방법은 검사되는 서열 사이에 최대의 정합을 제공하도록 설계된다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 특정 서열 사이의 서열 동일성을 결정하는 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화된다. 이러한 프로그램의 실례에는 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403410 (1990) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 출처(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI, NLM, NIH, Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990))로부터 공객적으로 입수가능하다. 이들 프로그램은 특정 서열과 참고 서열 사이에 최대 수준의 서열 동일성이 달성되도록 하기 위하여 디폴트 갭 중량(default gap weight)을 이용하여 서열을 최적으로 정렬한다. 예로써, 참고 뉴클레오티드 서열과 최소한 95% "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드는 특정 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참고 뉴클레오티드 서열의 각 100개의 뉴클레오티드 마다 최대 5개의 차이를 보유한다는 점을 제외하고 참고 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 다시 말하면, 참고 뉴클레오티드 서열에 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드에, 참고 서열의 전체 뉴클레오티드 중에서 최대 5%의 뉴클레오티드가 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환되고, 또는 참고 서열의 전체 뉴클레오티드의 최대 5% 비율까지 뉴클레오티드가 참고 서열에 삽입된다. 한쪽 서열에서 반전(inversion)은 상동성 검사 서열의 안티센스 가닥(antisense strand)에 대한 참고 서열의 유사성에 기초하여 이들 컴퓨터 프로그램에 의해 탐지된다. 참고 서열의 이들 변이체는 참고 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 종결 위치(terminal position)에서 또는 이들 종결 위치 사이의 임의의 위치에서 발생하고, 참고 서열에서 뉴클레오티드 사이에 개별적으로 또는 참고 서열 내에서 하나이상의 연속 그룹으로 산재된다.

본 명세서에서. "반복 서열"은 표적 DNA를 일부로서 포함하는 게놈 내에서 반복적으로 나타나는 서열인데, 반복 사이에 서열 동일성은 최소한 60%, 더욱 바람직하게는, 최소한 80%이고, 상기 반복 서열은 표적 DNA에 대한 프로브의 원하는 특이적인 혼성화를 간섭할 만큼 충분한 길이 또는 다른 특성을 갖는다, 다시 말하면, 상기 프로브는 반복 서열의 복수 사본과 혼성화된다. 일반적으로, 반복 서열은 게놈 내에서 최소한 10회 나타나고 1개 뉴클레오티드 내지 수백개 뉴클레오티드 범위의 반복 크기(repeat size)를 보유하며, 이러한 반복 단위(repeat unit)는 최소한 10개 뉴클레오티드 내지 수천개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 반복 서열은 임의의 다양한 반복 서열, 예를 들면, 직렬 반복 서열, 산재된 반복 서열, 팰린드롬(palindromic) 반복 서열 또는 공유된 반복 서열(일부 사본은 표적 영역 내에, 일부는 게놈 내에 다른 부위에)일 수 있고, 염색체의 중심립(centromere) 인근에 나타나거나, 단일 염색체 전체에 분산되거나, 또는 일부 또는 모든 염색체 전체에 분산될 수 있다. 정상적으로, 극소수를 제외하고, 반복 서열은 생리학적으로 유용한 단백질을 발현하지 않는다. "반복 서열"은 "반복 요소"로 지칭될 수도 있다.

본 명세서에서, SINE로 지칭되는 "짧은 산재된 요소"는 75 bp 내지 500 bp 길이 범위의 반복 단위를 포함하는 RNA 중합효소 III 전사체로부터 유래되는 고도 반복성 산재된 전위가능 요소를 의미한다. 가장 풍부한 종류의 SINE 요소는 Alu 집단이다. Alu 서열은 대략 300 bp 길이이고, 인간 게놈에서 대략 500,000개의 사본 내에 존재한다.

본 명세서에서, LINE으로 지칭되는 "긴 산재된 요소"는 RNA 중합효소 I 전사체로부터 최대 7000 bp의 반복 단위를 포함하는 고도 반복성 산재된 전위가능 요소를 의미한다.

본 명세서에서, LTR로 지칭되는 "긴 말단 반복"은 전형적으로 200-500 bp 길이의 말단 직접 반복을 보유하는 대형 종류의 전위가능 요소를 의미한다.

본 명세서에서, "MIR" 반복은 최소한 260bp의 반복 단위 길이(repeat unit length)를 보유하고 인간 게놈에서 대략 105개 사본 내에서 발견되는 포유동물 산재된 반복 요소를 의미한다.

본 명세서에서, "MER" 반복은 인간 게놈에서 100 여개 내지 1000 여개 범위의 사본수를 갖는 불명 기원의 적당히 산재된 인간 반복 요소를 의미한다.

본 명세서에서, 적당한 반복성 DNA는 인간 게놈에서 균일하게 분포하고, 10개 내지 1000 사본 내에 존재하며, 150 내지 300 bp의 반복 길이를 보유하는 반복 서열을 의미한다. 한 가지 실례는 Alu 집단이다.

본 명세서에서, 고도 반복성 DNA는 인간 게놈에서 최대 10⁵ 사본 내에 존재하는 5 내지 300 bp 길이의 짧은 반복 서열을 의미한다. 한 가지 실례는 위성 DNA이다.

본 명세서에서, "DNA 트랜스포손" 또는 "트랜스포손"은 게놈 내에서 한 위치에서 다른 위치로 이동할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 이들 서열은 또한, "이동 유전 요소(mobile genetic element)"로 지칭된다. 트랜스포손의 이동은 전형적으로, 전위(transposition)로 지칭된다.

도 1은 Cot-1 DNA 내에서 단일 사본 요소에 프로브의 혼성화를 예시하는 다이어그램이다.

도 2는 표적 핵산 내에서 반복 서열에 억제 DNA의 혼성화를 예시하는 다이어그램이다.

도 3은 Cot-1 DNA의 존재 하에 QMH 혼성화에서 산출된 잠재적 구조를 예시하는 다이어그램이다.

도 4는 합성 반복 산물 및 게놈 주형에 대한 교차-혼성화의 억제에 이용되는 프로브를 예시하는 다이어그램이다.

아래의 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 기술한다. 이들 구체예에서는 반복 요소를 보유하지만 단일 또는 적은 사본 요소를 보유하지 않는 합성 DNA에 사전 혼성화된 게놈 표적에 단일(또는 적은) 사본 프로브의 혼성화를 설명한다. 하지만, 이들 실시예는 예시를 목적으로 하고, 본 발명의 범위를 결코 한정하지 않는다.

실시예

재료와 방법

정량적 미소구 혼성화(QMM)

프로브 선택, 합성 및 미소구 공액.

프로브는 표적 서열에 대한 혼성화가 탐지될 수 있는 표지된 핵산 단편 또는 표지된 핵산 단편의 집합 형태로 존재한다. 표지된 프로브는 이들 프로브 내에서 서열에 상동한 서열을 보유하는 임의의 핵산 표적과 함께 이용된다. 이들 표적 서열에는 염색체 또는 정제된 핵 DNA, 이종핵(heteronuclear) RNA, 또는 전사체의 내부 요소(integral component)로서 단일 사본 서열을 보유하는 mRNA 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 아래의 상세한 설명에서, DNA 표적 서열과 DNA 프로브의 통상적인 사례가 논의된다; 하지만, 당업자가 인지하는 바와 같이, 이러한 논의는 다른 핵산 종(nucleic acid species)에도 균등하게 적용된다(표적 서열과 프로브의 특성에 기인한 당분야에 인정된 차이를 갖는다).

본 발명의 바람직한 프로브의 중요한 특징은 목적하는 표적 DNA 영역의 최소한 일부분에 상보적이고 표적 영역을 일부로서 포함하는 게놈 내에서 반복 서열에 상보적인 서열이 본질적으로 부재하는 "적은 사본", "단일 사본", 또는 "특이한" DNA 서열로 이들이 구성된다는 점이다. 따라서, 단일 사본 또는 특이한 서열로 구성되는 프로브는 가급적, 상응하는 게놈 내에서 3개 또는 그 이하 서열, 바람직하게는 1개의 서열에만 상보적이다.

적은 사본, 또는 혼합된 적은 사본과 반복성, 서열 프로브는 앞서 기술된 바와 같이 설계되었다(14,15,16,20). 바람직한 형태에서, 본 발명에서는 높은 특이성으로, 반수체 게놈 서열 내에 특이한 좌위에 혼성화되도록 특수하게 설계된 적은 또는 단일 사본 혼성화 프로브를 이용한다. 프로브 선별과 합성을 위한 방법은 U.S. Patent No. 6,828,097과 7,014,997에서 기술되는데, 이들의 교시와 내용은 본 명세서에 참조로서 편입된다. 이들 최초 단계는 인간 게놈 프로젝트와 관련된 생물정보학 연구로 인하여 더욱 가용해진, 표적과 게놈 반복 모두의 서열에 관한 지식을 필요로 한다. 적은, 바람직하게는, 단일 사본 서열을 유도하기 위하여 용이하게 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어가 이용되었다.

본 발명에 따라 프로브를 개발하기 위하여, 표적 DNA 영역의 서열이 공지되어야 한다. 표적 영역은 전체 염색체 또는 재정렬(rearrangement)이 확인된 이의 일부분일 수 있다. 이러한 서열 지식으로, 표적 영역 내에서 단일 사본 또는 특이한 서열의 경계를 결정하는 것을 목적한다. 적절하게는, 이는 표적 영역 내에서 반복 서열의 위치로부터 추론(inference)에 의해 달성된다. 정상적으로, 표적 영역의 서열은 가용한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 상응하는 게놈으로부터 공지된 반복 서열과 비교하였다. 표적 영역 내에 반복 서열이 확인되면, 개재 서열(intervening sequence)서열은 적은 또는 단일 사본(즉, 인접한 반복 서열 사이에 서열)인 것으 로 추론된다. 비교를 위한 표적 서열과 반복 서열의 최적 정렬은 Smith et a;., Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘(local homology algorithm)에 의해, 또는 Needleman et al., J. MoI. Biol., 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘(homology alignment algorithm)에 의해 수행될 수 있다.

적절하게는, 최소한 2개의 상이한 프로브 서열이 선택되고 합성된다. 비정상(abnormality)이 존재하는 특정 핵산 서열의 인식을 위한 최소한 한 세트의 프로브(검사 프로브)가 선택되고 합성되며, 참고 서열의 인식을 위한 다른 세트의 프로브(참고 프로브)가 선택되고 합성된다. 적은 사본 프로브는 최소한 60개 염기쌍 및 일반적으로, 2500개 이하의 염기쌍 길이를 갖는다. 적절하게는, 프로브는 60개 내지 1000개 염기쌍, 더욱 바람직하게는, 대략 80개 내지 500개 염기쌍, 가장 바람직하게는, 대략 90개 내지 110개 염기쌍을 갖는다. 대략 100개 염기쌍의 적은 사본 프로브에 공액된 미소구는 충분히 정의된 평균 형광 분포(mean fluorescence distribution) 및 일관되게 더욱 높은 이차 형광색소 평균 형광 강도(fluorochrome mean fluorescence intensity) 수치를 산출하고, 따라서, 실제 사본수를 더욱 정확하게 반영하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 더욱 짧은 프로브 공액체는 더욱 안정하고, 가급적 어둠 하에 대략 4℃에서 적절하게 보관되면, 공액후 2개월 이상동안 혼성화 반응에 이용될 수 있다. 이는 표지된 미소구 근원(stock)에서 더욱 적은 로트간 편차(lot-to-lot variation)를 유발하고, 따라서, 프로브-공액된 미소구를 공액하고 정량하고 정성하는데 요구되는 노력을 감소시킨다. 더욱 긴 공액된 프로브는 공액후 2주 이내에 감소된 혼성화 효율을 나타냈다.

본 실시예에 이용되는 프로브에는 sc 간격을 보유하는 프로브: (i) 분기하는 AluJo/Sx/L2 반복을 보유하는 ABL1a(May 2004. chr9:130623551-130625854), (ii) 기존 문헌(13,14)에서 설계되고 검증된, ABL1 내로부터 분기하는 AluJo 반복을 보유하는 ABL1b(chr9: 130627353-130628735), (iii) Alu/MER1 반복 서열, ABL1 AluMER1을 보유하는 1823bp 염색체 9 프로브(chr9: 130621702-130623525), (iv) TEKT3 인트론의 98bp sc 분절(chr17: 15149108-15149206), (v) PMP22 인트론의 lO1bp sc 분절(Chr17: 15073475-15073576), (vi) HOXB1 인트론의 93bp sc 분절(Chr17: 43964237-43964330)가 포함된다. 게놈 재구성 실험을 위한 프로브에는 (vii) HOXB1b(chr17: 43963396-43965681)와 (viii) C1QTNF7(chr4: l5141452-1514150G)이 포함된다. 프로브 내에서 발견되는 반복 서열은 공통 계통 구성원(consensus family member)에 상대적인 서열 차이 비율(>12%), 결실 비율(>4%) 및/또는 삽입 비율(>4%)에 기초하여, 분기하는 것으로 정의되었다(girinst.org).

미소구에 프로브의 커플링

프로브는 기존 문헌(13,20)에서 기술된 바와 같이 합성하고 미소구에 결합시켰다. 합성 동안, 이들 프로브는 스펙트럼-상이한 미소구에 공액을 위하여, 특정 공액 반응(conjugation reaction)에 따라 아민-태그될 수 있다. 적절하게는, 프로브는 변형된 카르보디이미드 반응(carbodiimide reaction)을 통하여 미소구에 공액된다.

각각 별개의 스펙트럼 주소(spectral address)(L1-L9로 지정됨; Duke Scientific, Palo Aito, CA)를 가지고 대략 200,000개 카르복시-부위로 코팅된 형 광 미소구는 상이한 Ic 프로브에 개별적으로 공액하였다. 정제된 아미노-변형된 Ic 프로브는 변형된 카르보디이미드 결합 절차를 통하여 카르복실화된 미소구에 결합시켰다(Donbar et al, 2003; Fulton et al, 1997). 각 프로브는 초기에 가열 변성시키고, 이후 얼음 위에서 순간 냉각시켰다. 동일한 스펙트럼 특징을 갖는 대략 3.125x10⁵개 미소구는 1.5 ㎖의 마이크로원심분리 튜브(USA Scientific, Ocala, Florida) 내로 피펫하고, 10,000 g에서 2분 동안 원심분리하고, 상층액을 배수하였다. 150 ㎕의 0.1 M MES 완충액(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산) pH 45를 각 튜브에 추가하고, 미소구는 짧게 와동(vortexing)하고 10,000 g에서 2분 동안 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 미소구는 80 ㎕의 0.1 M MES에서 와동함으로써 재현탁시켰다. 단일 Ic 프로브(0.5 nmol)를 각 튜브에 추가하고 와동으로 혼합하였다. 1.25 ㎕ 부피의 새로운 10 ㎎/㎖ 1-에틸-3-3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드하이드로클로라이드(EDC) 용액을 추가하고, 반응물은 짧게 와동시키고 주기적으로 혼합하면서 어둠 하에 30분 동안 항온처리하였다. EDC의 혼합과 항온처리(incubation)는 1.25 ㎕의 새로 제조된 EDC 용액을 각각 이용하여 2회 반복하였다. 반응은 500 ㎕ 0.02% Tween20을 추가하고, 이후 와동하고 10,000 g에서 2분 동안 원심분리하여 중단시켰다. 상층액의 제거후, 250 ㎕의 0.1% SDS를 각 튜브에 추가하고, 와동시키고, 이후 10,000 g에서 2분 동안 원심분리하였다. 상층액은 조심스럽게 제거하고 25 ㎕의 0.1 M MES pH4.5를 추가하고, 상기 튜브는 와동하고 어둠 하에 4℃에서 보관하였다. 결합된 미소구 농도는 1 ㎕의 각 미소구를 100 ㎕의 1X PBS에 추가하고, 아래에 제시된 조건을 이용하여 FACSCalibur 유세포분석기(flow cytometer)(Becton Dickinson, San Jose, California)에서 분석함으로써 정량하였다.

이러한 방법에 필적하는, 핵산을 미소구에 결합하는 다른 방법이 개발되고 있다. DNA를 미소구에 공액하는 다른 통상적인 방법은 5' 말단에서 비오틴 모이어티를 갖는 변형된 뉴클레오티드를 보유하는 프로브에 스트렙타비딘-코팅된 비드를 결합시키는 것이다. U.S. Patent No, 6,361,944에서 금 나노입자가 티올-변형된 핵산에 공액되었다. U.S. Patent No. 6,468,546; 6,838,243; 6,833,246; 6,828,146; 6,828,142에서 단백질-핵산이 비드에 공액되었다. 미소구에 올리고뉴클레오티드의 공액은 또한, 친전자성 사슬(electrophilic tether), 다시 말하면, N-클로로아세트아미도헥실 포스포르아미디트(chloroacetamidohexyl phosphoramidite) 반응물을 통하여 수행되었다(Guzaev. et al, Bioorg Med Chem Lett 1998 Dec 15; 8(24):3671-6). DNA는 또한, 반도체 나노결정성 입자에 공액되었다(Taylor, J.R,, Fang, M.M., & Nie, S.M. Probing specific sequences on single DNA molecules with bioconjugated fluorescent nanoparticles. Anal. Chem, 72, 1979-1986; 2000; W, Z, Guo., J. J. Li, Y. A. Wang, X. G. Peng. Conjugation chemistry and bioappli cations of semiconductor box nanocrystals prepared via dendrimer bridging. Chem. Mater. 15, 3125-3133 (2003); U.S. Patent No. 6,630,307). 바람직한 구체예에서, 미소구는 다양한 스펙트럼 주소를 갖는 내부 염색된 형광 폴리스티렌 비드이고, 적은 사본 프로브에 공액되어 적은 사본 프로브-공액된 비드의 다양한 조합이 산출되는데, 여기서 참고 프로브는 상이한 스펙트럼 주소로 지정된다. 상이한 스펙트럼 주소는 유세포분석기에 의해 인식되고, 상이한 미소구 세트에 부착된 다양한 적은 사본 프로브와의 복합된 반응을 가능하게 한다.

게놈 표적 준비

게놈 주형(표적 핵산 서열)은 기존 문헌(13,20)에서 기술된 바와 같이 골수 표본의 세포유전학적 제조물(cytogenetic preparation)로부터 유래된 메탄올-아세트산 고정된 세포 펠릿을 이용하여 준비하였다. 다른 방법과 달리, 표적 서열은 사전-선택되거나 증폭되지 않는다. 이런 이유로, 본 발명에서 게놈(또는 전사체)의 전체 사본이 분석을 위하여 혼성화될 수 있다. 표본의 공급원과 상태에 따라, DNA(또는 RNA)가 세포로부터 추출되고, 필요한 경우에, 임의의 통상적인 방법을 이용하여 시험관내에서 복제될 수 있다. 적절하게는, 핵산은 1 ng 이하의 표본 핵산을 활용하고 20분 이하의 핸드-온 시간(hand-on time)을 필요로 하는 GenomiPhi 키트(Qiagen, Valencia. CA)를 이용하여 시험관내 복제된다. 이후, DNA는 임의의 통상적인 수단으로, 바람직하게는, 시험관내 복제 동안 직접적인 라벨링 단계에 의해, 또는 라벨 및 상기 라벨에 친화성을 갖는 리포터 분자로 구성되는 간접적인 라벨링 시스템에 의해 표지된다. 핵산 표적은 형광단; 효소 공액체; 또는 비오틴, 또는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 특이적 항체에 의해 인식되는 모이어티로 구성되는 군으로부터 선택되는 라벨과 같은 확인 라벨(identifying label)로 표지된다. 여러 유형의 비-동위원소 확인 라벨이 존재한다. 한 유형은 핵산 표적에 화학적으로 결합되고 직접적인 확인을 위한 수단으로서 기능하는 라벨이다. 이의 실례는 형광색소 모이어티인데, 이는 적절한 파장의 방사선의 적용이후, 높은 에너지 상태로 여 기되고 형광을 방출한다. 직접적으로 표지된 형광 뉴클레오티드, 예를 들면, Cy3-dUTP는 당분야에 공지되어 있고 본 발명에 이용되는 경우에 표적 DNA의 적절한 라벨링 형태일 것이다. DNA의 다른 직접적인 라벨링 방법 역시 적합한데(한 가지 실례는 Ulysses 방법(Kreateck Netherlands)으로 시판되는 아미노-알릴 라벨링이다), 이런 경우에, 게놈 DNA는 프로브 공액된 미소구에 표지된 표적의 추가에 앞서 혼성화를 위한 적절한 크기로 단편화된다(초음파처리, DNAse I, 전단, 또는 다른 효소적 절단에 의해). 바람직한 구체예에서, 핵산은 비오틴-dUTP 또는 디곡시제닌-dUTP를 이용한 시험관내 복제동안 직접적으로 표지되고, 생성된 표지된 표본은 초음파처리되어 ~300 bp 내지 1 kbp 길이의 단편을 산출한다. 핵산 표적은 또한, dUTP 또는 dATP와 같은 뉴클레오티드에 공액된 선택의 확인 표지(이에 국한되지 않음)를 포함하는 반응물을 이용한 통상적인 방식으로, 변형된 또는 직접적으로 표지된 뉴클레오티드를 이용한 절단수선복제(nick translation)로 표지될 수 있다(Rigby et al, J. MaL Biol., 113:237-251. 1977). 이들 단편은 형광단-태그된 뉴클레오티드로 직접적으로 표지되거나, 또는 아래에 기술된 바와 같이 단편 내로 통합되는 변형된 뉴클레오티드를 인식하는 형광-표지된 항체에 표지된 이중나선을 결합시킴으로써 간접적으로 표지된다. 절단수선복제(100 ㎕)에는 엔도뉴클레아제(endonuclease)-없는 DNA 중합효소 I(Roche Molecular Biochemicals)과 DNase I(Worthington Chemical)이 이용된다. 각 단편은 DNA 중합효소 I(4 unit/㎍ DNA), DNase(0.01-3 ㎍/100 ㎕ 반응), 표지된 뉴클레오티드(0.05 ㎜ 최종), 절단수선복제 완충액과 합쳐진다. 반응은 15℃에서 60분간 수행되고, ~300 내지 1000 bp 크기 범 위의 상이한 뉴클레오티드 크기의 다양한 표지된 프로브 단편을 산출한다. 대안으로, 비오틴-dUTP 또는 디곡시제닌-dUTP는 시험관내 복제 절차 동안 편입될 수 있고, 생성된 표지된 표본은 DNAse I로 처리되거나, 또는 일부 다른 방법으로 전단되어 ~300bp 내지 1kb 길이의 단편을 산출할 수 있다. 핵산을 표지하고 탐지하는데 통상적으로 이용되는 다른 방법이 본 발명의 적은 사본 DNA 공액된 미소구의 탐지에 적용될 수도 있다. 이들에는 형광색소 표지와 형광 조성물, 예를 들면, 에너지 전달 기(energy transfer group), 공액된 단백질, 항체, 또는 항원이 포함된다.

더욱 구체적으로, 1 ㎍의 게놈 DNA과 pUC19 DNA는 비오틴-16 dUTP로 절단수선복제하여 각각, 100bp-350bp와 50bp~300bp 산물을 획득하였다(17). 1 ㎍의 각 Cot-1 DNA(제조업체 I과 R로부터)는 디곡시제닌-11 dUTP로 절단수선복제하여 50bp~300bp 산물을 획득하였다.

혼성화 반응과 유세포분석

표지된 DNA(50 ng)는 10,000개의 프로브-결합된 미소구를 포함하는 40 ㎕ 1.5 X TMAC 혼성화 완충액(3-mol/ℓ 테트라메틸암모늄 염화물, 50 mmol/ℓ Tris-HCl, pH 8,0, 1 g/ℓ 사르코실(sarkosyl))에서 희석하였다. 반응물은 표 1에 열거된 성분과 조합되었다.

^R 기존 혼성화 측정검사로부터 회수된 산물

^* 비오틴-16dUTP를 이용하여 절단수선복제되고 FL2에서 반응당 50 ng SPE를 이용하여 탐지됨

반응물의 혼성화와 탐지는 기존 문헌(13,20)에서 기술된 바와 같이 수행되었다. 혼성화 반응을 위한 조건은 특정 뉴클레오티드 조성 및 개별 적은 사본 프로브의 길이에 좌우되고, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 혼성화를 위하여, 표본 서열은 적은 사본 프로브-공액된 미소구를 포함하는 혼성화 완충액 내에서 희석된다. 이용되는 프로브-공액된 미소구의 양은 검사된 표본의 양에 좌우된다. 적절하게는, 대략 5 pg 내지 1 ㎍의 표본, 더욱 바람직하게는, 대략 25-100 ng의 표본, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 30-70 ng, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 40-60 ng의 표본, 가장 바람직하게는, 대략 50 ng의 표본이 각 혼성화 반응물에서 분석된다. 따라서, 완충액은 혼성화되는 각 세트에 대해 바람직하게는, 대략 2,000-10,000개의 프로브-공액된 미소구, 더욱 바람직하게는, 2,000-6,000개의 프로브-공액된 미소구, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 4,500-5,500개의 프로브-공액된 미소구, 가장 바람직하게는, 대략 5,000개의 프로브-공액된 미소구를 포함한다. 희석된 혼성화 반응물은 가급적, 대략 95℃에서 열 변성되고, 이후 프로브 뉴클레오티드 조성과 길이에 따라 적절한 혼성화 온도, 바람직하게는, 대략 45 내지 51℃에서 하룻밤동안 혼성화된다. 혼성화된 미소구는 혼성화되지 않은 표적 서열을 제거하기 위하여 세척되고 원심분리된다.

상층액은 제거되고, 혼성화된 표본은 적은 사본 프로브- 공액된 미소구에 혼성화된 표지된 표본을 탐지하기 위하여 일정량의 변형된 리포터 분자 또는 다른 적절한 라벨, 바람직하게는, 이차 형광색소로서 기능하는 라벨로 염색되거나 표지된다. 바람직한 리포터 분자는 피코에리트린-표지된 스트렙타비딘 또는 항-디곡시제닌 플루오레세인(anti-digoxigenin fluorescein)인데, 이는 선호되는 표적 서열 라벨: 각각, 비오틴과 디곡시제닌을 탐지하고 이들에 결합한다. 혼성화되고 표지된/염색된 표본은 리포터 분자가 표지된 표적 서열을 탐지하고 상기 서열에 결합할 만큼 충분한 기간 동안 혼성화 반응에 이용된 동일한 온도에서 항온처리된다. 이후, 표본은 잔류 염료를 제거하기 위하여 세척된다. 이들 표본은 원심분리되고, 상층액은 제거되고, 염색된 혼성화된 미소구는 일정량의 혼성화 완충액에 재현탁된다.

유세포분석법에 의한 분석에 앞서, 혼성화된 표본은 유세포분석기 제조업체의 사용설명서에 따라 희석될 수 있다. 적절하게는, 각 세트에서 대략 2,000-6,000개의 미소구, 더욱 바람직하게는, 대략 4,500-5,500개의 미소구, 가장 바람직하게는, 대략 5,000개의 미소구가 각 반응마다 분석된다. 하지만, 분석되는 표본의 양은 분석에 이용되는 특정 유세포분석기에 좌우된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 유세포분석기에 대한 보정(calibration)과 작동 설정(operating setting)은 특정 혼성화 검사물을 측정하기 위한 최적 범위를 결정하기 위하여 과도한 실험 없이, 당업자에 의해 다수의 방식으로 변형될 수 있다. 이들 파라미터는 분석에 이용되는 소프트웨어에도 좌우된다. 형광 비드 기준은 폭넓게 입수가능하고, 유세포분석기의 상이한 형광색소 탐지 채널의 강도를 교정하는데 이용될 수 있다. 상기 장치는 등가의 가용성 형광색소 분자(equivalent soluble fluorochrome, MESF) 단위의 분자에서 교정된 표면-표지된 비드에 기초한 형광 참고 기준(fluorescent reference standard)으로 교정될 수도 있다. 전방 산란(forward scatter), 측면 산란(side scatter), 유속(flow rate), 다양한 탐지 채널에 대한 광전증폭관(photomultiplier tube) 전압 설정과 역치(threshold)는 정상적인 유전형(genotype)을 갖는 단일 환자 표본에 혼성화된 2가지 상이한 프로브의 형광 강도(fluorescence intensity) 사이에 차이를 최소화하기 위하여 가급적 최적화되어야 한다. 비-최적 전압 파라미터는 용이하게 식별되고 광범위한 형광 피크(fluorescence peak) 또는 비-선형 데이터(non-linear data)를 결과하는 반면, 최적 파라미터는 측면 산란 플롯(side scatter plot)을 이용하여 시각화되는 경우에 상이한 스펙트럼 주소를 갖는 조밀하게 밀집된 미소구를 결과한다. 적절하게는, 이들 설정은 산술 평균(arithmetic mean), 기하 평균(geometric mean), 중간과 피크 채널의 추론된 형광 치수로부터 결정된다.

반응물은 3분 동안 변성시키고 50℃에서 하룻밤동안 혼성화시켰다. 혼성화된 미소구는 세척하고 리포터 분자, 스트렙타비딘-피코에리트린(SPE; Molecular Probes) 및/또는 항-디곡시제닌 플루오레세인 이소티오시아네이트(anti-digoxigenin fluorescein isothiocyanate, FITC; Molecular Probes)로 염색하였다. 이후, 혼성화된 표본은 이중 레이저 탐지(dual laser detection)를 이용한 유세포분석법(FACSCalibur. Becton Dickinson, San lose, California)으로 분석하였는데, 여기서 세포분석기는 혼성화된 프로브를 확인하고 정량하기 위하여, 미소구 및 표본 서열에 결합된 이차 형광색소의 스펙트럼 주소를 동시-탐지한다. 상보성 프로브-공액된 미소구에 혼성화된 각 표본 서열의 신호는 표본 서열에 부착된 이차 형광색소의 형광 강도를 정량함으로써 결정된다. 결합되지 않은 2차 형광색소(리포터 분자)의 방출 파장(emission wavelength)과의 중복을 최소화시키기 위하여 적합성 미소구 스펙트럼 주소가 선택된다. 이는 동일한 공액되지 않고 혼성화되지 않은 미소구로부터 획득된 결과를 비교하여 확증될 수 있다. 2차 형광색소 탐지 채널에서 배경 형광(background fluorescence)을 결정하기 위하여 표본 핵산을 제외하고 모든 성분을 포함하는 반응 튜브를 이용하여 음성 대조(negative control) 역시 유지될 수 있다. 적절하게는, 상기 시스템은 임의의 잔류하는 미소구를 제거하기 위하여 작업(run) 사이에 증류수로 세척된다.

반응당 대략 5,000개의 미소구가 분석되었다. 혼성화는 프로브에 의해 결합된 게놈 표적(FL2)과 Cot-1 DNA(FL1)의 양에 상응하는 SPE 및/또는 FITC 평균 형광 강도(각각, 채널 FL2 및/또는 FL1)로부터 정량되었다. 공액된 프로브 및 동일한 서열을 보유하는 표지된 표적으로 보정 연구는 평균 형광 강도에서 변화가 혼성화된 표적의 양에 선형으로 관련된다는 것을 입증하였다. FL1과 FL2 채널 배경 형광은 표적 DNA를 제외하고 모든 반응 성분을 포함하는 음성 대조(negative control)를 이용한 각 혼성화 실험에서 개별적으로 측정되었다.

최적 PMT 전압은 앞서 기술된 바와 같이 설정되었다; 데이터 수집과 분석은 제조업체-공급된 CellQuest 소프트웨어로 수행하였다(13,20). 최적 광전증폭관 전압 설정은 정상적인 유전형을 나타내는 단일 환자 DNA 표본에 혼성화된 2개의 상이한 프로브의 형광 강도 사이에 차이를 최소화하는 광전증폭관 전압 설정을 선택함으로써 결정되었다. 이들 설정은 산술 평균(arithmetic mean), 기하 평균(geometric mean), 중간과 피크 채널의 장치-유래된 형광 치수(CellQuest; Becton Dickinson)로부터 결정하였다. FACSCalibur 장치에 대한 전형적인 광전증폭관 전압 설정은 FSC(전방 산란) = EOO(신호 증폭 없음), SSC(측면 산란) = 344 V, FL1= 727 V, FL2 = 640 V, FL3 = 300 V, FL4 = 500 V. FSC, FL1, FL2, FL3에 대한 역치는 52 V의 디폴트(default)로 설정되었다. FSC 역치는 일차 파라미터로서 선택되고 52 V의 수치를 보유하고, 이차 파라미터는 SSC로 설정되고 125 V의 수치를 보유하였다. 유속은 낮게 설정되고, 이용된 외피 유체(sheath fluid)는 FACsFlow(Becton Dickinson)이었다. 상기 시스템은 임의의 잔류하는 미소구체를 제거하기 위하여 2-5 ㎖의 증류수로 작업(run) 사이에 세척하였다. CellQuest가 데이터 수집과 분석에 이용되었다. 데이터 분석은 WinMDI2.8 유세포분석법 패키지(WinMDI; J. Trotter, SaIk Institute, La JoIIa, California)를 이용하여 수행하였다.

프로브-혼성화된 DNA 단편의 회수

ABL1a(표 1: 반응물 19와 20)로 게놈 혼성화의 분량(35 ㎕)은 250 ㎕ O.1 X SSC 1% SDS로 세척하고, 원심분리(13,000 xg)로 펠릿하고, 2회 반복하였다. 혼성화된 게놈 서열은 95℃에서 5분 동안 열 변성하고 순간 냉각하고, 이후 4℃에서 3분 동안 원심분리(13,OOO xg)하였다. 회수된 서열은 QPCR 및 미소구-결합된 ABL1AluMHR1에 혼성화를 위한 표적으로 이용되었다(표 1: 반응물 21과 22).

합성 반복성 DNA

합성 반복성 DNA는 그들 내에 포함된 반복 서열의 집단에 기초하여 선택된 게놈 영역으로부터 제조되었는데, 그 이유는 이들 각각이 Cot-1 제조 과정에서 풍부하기 때문이다. 하지만, 중간 내지 높은 사본수 반복 요소에 인접한 sc 영역을 보유하는 대표적인 게놈 영역이 이용될 수도 있다. 게놈 프로브 내에서 반복 요소가 바람직한 표적 간격을 초과하는 위치에서 억제될 수 있는 지를 확인하기 위하여, C1QTNF7 유전자의 상류에 위치한 염색체 4p(chr4: 15139704-15141581) 상에서 2개의 400bp sc 영역 사이에 중심하는 1.1kb LTR 요소를 보유하는 프로브를 제조하였다(도 4A). 이후, 이러한 반복 요소를 차단하기 위한 ABLa 프로브 영역 내에 위치한 반복 서열을 합성하였다; 염색체 9로부터 ABL1은 280bp AluJo 반복, 300bp AluSx 반복, 830bp L2 요소 분절(도 4C). 306bp AluSx 반복과 154bp L1 절두된 서열을 보유하는 HOXB1의 5'에 위치한 염색체 17q 상에서 2286bp 분절(chr 17: 43963396-43965681) 역시 프로브로서 이용되었다(도 4B). 이들 반복 요소에 바로 접하는 특이한 서열을 증폭하는 프라이머(표 2; HOXBlAluL1과 C1QTNF7LTR)가 각 반복 서열과 표적 산물의 PCR 증폭을 위하여 개발되었다(표 2: HOXB1b와 C1QTNF7). 게놈 DNA(Promega) 프로브는 Pfx(Invitrogen)를 이용하여 증폭하였다. 증폭 산물은 이후, 전기영동하고 마이크로-스핀 칼럼 원심분리(micro-spin column centrifugation)로 추출하였다. 프로브는 기존 문헌(13,20)에서 기술된 바와 같이, 변형된 카르보디이미드 반응을 통하여 미소구에 공액하였다. 혼성화 반응물(표 1: 반응물 23-33)은 Cot-1 DNA의 존부 하에, 상동성 PCR 산물 및/또는 게놈 DNA에 혼성화된 합성 반복성 PCR 산물의 효과를 평가하였다. 반응물은 혼성화시키고, 세척하고, SPE로 염색하고, 이후 유세포분석법으로 분석하였다.

정량적 PCR

QPCR과 데이터 분석은 Chromo4 정량적 PCR 시스템(Bio-Rad Laboratories. Hercules, California)을 이용하여 수행하였다. 프라이머와 증폭된 간격은 BLAT(18)(genome.ucsc.edu /cgi~bin/hgBlat)와 BLAST(표 2)를 이용하여 특이한 게놈 표현(genomic representation)을 검증하였다. BLAT는 질의된 서열에 상동할 가능성이 있는 인간 게놈 내에서 영역을 확인하기 위하여 서열 정렬 알고리즘과 척추동물 서열의 인덱스를 포함하는 컴퓨터 소프트웨어 도구이다. BLAT는 BLAST와 유사하지만 상이하게 구성된 정렬 도구인데, BLAT는 전체 게놈의 인덱스를 기억에 유지함으로써 작동하는 반면, BLAST의 표적 데이터베이스는 Genbank 서열 집합을 포함한다. 각 50 ㎕ 반응물은 0.5 μM의 각 프라이머, 50 ng Cot-1 주형 또는 양성 대조 인간 게놈 DNA(Promega), 25 ㎕ 2XQTSybrG 마스터 믹스(Qiagen)를 포함하였다. 게놈 DNA는 DNAse를 이용하여 새김눈을 발생시켜 50bp-3Q0bp의 단편을 산출하고, 음성 대조는 DNA를 제외하고 모든 반응 요소를 포함하였다. 열 사이클링(thermal cycling) 조건은 95℃에서 15분; 45회 증폭(94℃에서 15초, 61℃에서 30초(데이터 획득), 72℃에서 30초), 이후 72℃에서 5초이었는데, 온도는 용융 곡선(melt curve)의 산출을 위하여 매초 20℃씩 감소하였다. 회수된 게놈 주형 내에서 입력 표적 서열의 양을 결정하는데 이용되는 보정 곡선(calibration curve)은 정상적인 게놈 주형의 양(1 ng, 2 ng, 4 ng, 1O ng, 20 ng)을 변화시키고 각 반응에 대한 C_T 값을 결정함으로써 산출하였다.

ABL1a 산물 혼성화(1 ㎕; 표 1: 반응물 21과 22)로부터 회수된 서열의 조성은 QPCR로 결정하였다. 프라이머 세트는 ABL1 영역 내로부터 여러 개의 증폭된 서열(ABL1a와 ABL1c(chr9: 130709665-130711469), ABL1d(chr9: 130699324-130700596)를 비롯한 이들 서열은 프로브에 반드시 상동성일 필요는 없다) 및 다른 무관한 게놈 영역에 특이적인 프라이머, 예를 들면, DNAJ3 유전자의 5'에 위치한 Alu 반복, TEKT3, HQXB1을 보유하는 DNJA3Alu(chrl6; 4421138-4421200)을 이용하였다(표 2). 반응은 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다. 양성 대조(인간 게놈 DNA)는 QMH 반응물(50 ng)에 초기에 추가된 게놈 DNA의 최초량을 나타내기 위하여 각 프라이머 세트에 포함되었다. QMH로부터 회수된 표적 서열의 몰 비율은 Cot-1 DNA의 존부 하에 검사 표본 내에서 최초 주형의 양으로부터 결정되었다(표준 보정 곡선에 대하여 교차-참조된 C_T 값으로부터 외삽(interpolation)).

형광 in situ 혼성화(FISH)

본 발명의 방법은 형광 in situ 혼성화(FISH) 실험에도 이용될 수 있다. FISH 프로브에 대한 표적 영역은 전체 염색체 또는 이의 일부분일 수 있다. 프로브 합성과 라벨링(15,16) 이후, FISH 혼성화 프로브는 슬라이드에 고정된 염색체에 혼성화에 앞서, Cot-1 DNA 대신에 반복 억제를 위한 합성 반복성 DNA와 함께 항온처리될 수 있다. 종종, Cot-1 DNA를 이용한 프로브 사전-혼성화과 함께 또는 이런 혼성화 없이 제조된 비교 실험은 상이한 프로브 혼성화 신호를 나타낸다(14). Cot-1 DNA 프로브 사전 혼성화 없는 FISH는 Cot-1 DNA 사전 혼성화 없는 FISH 실험과 비교하여 염색체 상에서 더욱 약한 프로브 신호를 나타낸다(14). 더욱 약한 신호는 Cot-1 DNA 내에 존재하는 단일 사본 서열에 프로브 내에 존재하는 단일 사본 서열의 혼성화로부터 기인한다. 이는 염색체 상에 표적 서열에 대한 혼성화에 가용한 프로브의 양을 감소시키고, 따라서 더욱 약한 신호를 발생시킨다. 하지만, 결과적으로, 프로브 신호 강도가 더욱 명확하지만 Cot-1 DNA 사전 혼성화 없는 실험은 전형적으로, 분석에 더욱 높은 노동 집중이 요구되는 더욱 높은 배경 수준(background level)을 유발하는 더욱 많은 가양성(false positive) 프로브 혼성화를 보인다. 프로브를 단일 사본 서열이 존재하지 않는 순수한 합성 반복성 DNA 분획과 사전 혼성화함으로써, 프로브 내에서 관찰되는 임의의 반복 서열이 효과적으로 억제되고 단일 사본 서열이 염색체에 대한 혼성화에 가용하게 된다. 따라서, 염색체 상에서 프로브 신호 강도는 약화되지 않고 배경(가양성 혼성화 신호)이 효과적으로 최소화된다.

결과

Cot-1 DNA와의 정량적 미소구 혼성화

분기하는 AluJo/Sx/L2 반복(chr9: 130623551-130625854)을 보유하는 ABL1 유전자의 IVS1b의 5' 말단으로부터 FISH-검증되고, 혼합된 sc와 반복 서열 프로브, ABL1a는 비오틴-표지된 게놈 DNA와 혼성화되었다(13,20). 상업적으로 제조된 Cot-1 DNA가 비오틴-표지된 게놈 DNA와 ABL1a의 복제 혼성화(replicate hybridization)에서 반복 서열 혼성화를 억제할 것으로 예상되었지만, 표지된 게놈 표적의 평균 형광(또는 혼성화) 강도는 Cot-1이 절단수선복제된 게놈 DNA와 ABL1a의 복제 혼성화에 포함될 때 일관되고 현저하게, 2.2 배 증가하였다(표 1: 반응물 1과 2). 염색체 17 유전자로부터 유래된 sc 프로브, PMP22(Chr17: 15073475-15073576)와 TEKT3(Chr 17: 15149108-15149206)은 Cot-1 DNA의 존재 하에 혼성화 강도에서 1.08과 1.14 배의 작지만 재현가능한 증가를 보였다(표 1. 반응물 3-6). 이들 실험은 Cot-1에 기인한 효과가 이들 sc 간격을 둘러싸는 반복 서열의 조성에 관련된다는 것을 암시하였다. HOXB1로부터 sc 프로브(Chr17: 43964237-43964330)는 Cot-1 DNA가 추가되면 혼성화 강도에서 약간의 감소를 일관되게 나타내는데(표 1. 반응물 7-32), 검사된 게놈 표본에서 혼성화 강도는 0.84-0.92 배 감소하였다. HOXB1 간격은 반복 서열이 실질적으로 부재한다(UCSC Genome Browser, May 2004). ABL1a를 외접하는 영역은 고도로 밀집되고 보존되며 풍부한 산재된 SINE(AluJo, AluSx)와 LlNE(L2) 요소를 보유한다. TEKT3과 PMP22 간격은 더욱 짧고 덜 풍부하고 더욱 분기하는 종류의 반복 요소(MIR, MER, L2)를 보유한다.

Cot-1 DNA의 추가가 ABL1a 프로브에 표적 혼성화(target hybridization)을 변화시키는 정도는 비오틴-표지된 표적 DNA(FL2 채널 내에서 스트렙타비딘-피코에리트린[SPE]로 탐지됨), 비오틴-표지된 음성 대조 표적(pUC19 플라스미드), 디곡시제닌-표지된 Cot-1 DNA와 이들의 조합(FL1 채널에서 FITC-공액된 항-디곡시제닌에 의해 탐지됨)의 혼성화를 비교함으로써 결정하였다. Cot-1의 존재는 비오틴-표지된 상동성 게놈 표적 서열에 혼성화된 ABL1a에 대한 평균 형광 강도에서 2-배 증가를 결과하였다. 하지만, 결합된 표지된 Cot-1 서열의 양은 Cot-1 서열이 부재하는 반응물과 비교하여 강도에서 50배 증가에 기초하여 ABL1a 내에서 반복 서열의 억제에 필요한 양을 실질적으로 초과하였다(표 1: 반응물 13과 14). Cot-1 결합은 서열-특이적인 것으로 보이는데, 그 이유는 pUC19에 ABL1a의 혼성화가 Cot-1의 존재 여부와 상관없이, 배경 수준 신호(<1O^l)를 나타냈다(표 1, 반응물 15). 이들 조사 결과는 Cot-1 내에서 상동성 서열이 ABL1a 프로브에 직접적으로 결합한다는 것을 암시한다. ABL1a 서열이 Cot-1 표적의 극히 일부만을 대표하기 때문에, 이것만으로는 관찰된 혼성화에서 증가를 설명할 수 없다.

증가된 신호가 Cot-1 DNA의 양에 관련되는 지를 결정하기 위하여, 고정된 양(50 ng)의 비오틴-표지된 게놈 표적에 추가된 디곡시제닌-표지된 Cot-1 DNA의 가변량(varying amount)을 혼합된 sc와 반복 프로브인 ABL1b에 혼성화시켰다. ABL1b는 2개의 분기하는 AluJo 반복 서열(chr9: 130627353-130628735)을 보유한다. 반응물 내에서 Cot-1의 양을 50 ng에서 10O ng으로 2배 증가시킴으로써, Cot-1에 대한 프로브 혼성화가 1.8 배 증가하고, 상동성 표적에 대한 프로브 혼성화는 1.3 배 증가하였다(표 1: 반응물 16과 17). 유사하게, 150 ng의 표지된 Cot-1 DNA는 50 ng Cot-1과 비교하여 ABL1b에 혼성화를 3배 증가시키고, 표적 DNA에 혼성화를 1.5 배 증가시켰다(표 1; 반응물 17과 18). Cot-1 DNA의 화학량적 추가가 상동성 비오틴화된 표적을 2 내지 4 배 희석하지만, 상응하는 혼성화 강도가 예상치 않게, 1.5 배 증가한다.

Cot-1 농도와 혼성화 강도의 상관관계는 이러한 반응 요소가 프로브와 원하는 게놈 표적 이외에 다른 서열을 보유하는 이중나선 구조의 형성을 촉진한다는 것을 암시하였다. 프로브에 결합된 Cot-1 유래된 서열의 조성을 결정하기 위하여, 산물은 변성시키고 ABL1a-결합된 미소구에 혼성화이후 회수하였다(표 1, 반응물 19와 20). 이들 산물은 Alu 요소(AluJb, AluSq, Charlie1, AluSx) 및 ABL1a의 중심에서 2.3kb에 위치한 MER1 서열을 보유하는 비-반복 sc와 반복 미소구-공액된 프로브, ABL1AluMER1에 대한 후속 혼성화에서 표적 서열로서 이용되었다. ABL1AluMER1의 게놈 위치를 고려할 때, 이는 회수된 절단수선복제된 게놈 산물 내에 존재하지 않을 것으로 예상되었다. 하지만, 표지된 Cot-1 분획은 FL1 채널 내에서 평균 형광 강도에서 11 배 증가에 기초하여, 회수된 ABL1AluMER1 서열의 공급원인 것으로 밝혀졌다(표 1: 반응물 21과 22). Cot-1 DNA 내에서 혼성화된 ABL1a에 인접하는 반복 서열은 반복과 단일 사본 서열 요소의 네트워크를 형성함으로써 혼성화를 게놈 서열에 응집시키는 것으로 보인다(도 3: 패널 1과 2). 이러한 가능성은 회수된 혼성화 산물 내에 존재하는 서열의 정량적 PCR(QFCR) 분석으로 평가하였다.

정량적 PCR에 의한 혼성화된 서열의 분석

본 발명의 프로브에 상동한 Cot-1에서 sc 서열의 함량은 QPCR로 결정하였다. 본 연구에 이용되는 프로브와 프라이머는 표 2에서 확인된다. 분석의 결과는 표 3에 제시된다.

ABL1a의 100 bp sc 분절은 Cot-1 DNA와 대조 게놈 DNA의 500 ng 표본으로부터 증폭하였다(표 2). 개별 C_T 수치에 기초하여, 제조업체 I와 R로부터 Cot-1 분획은 정상적인 게놈 조성과 비교하여 혼성화된 ABL1a의 양에서 각각, 14 배와 2 배 증가(또는, 2.5와 1.7 몰 증가)를 나타냈다(표 3: 반응물 1-3). ABL1a 서열은 상기 프로브에 혼성화된 게놈 서열과 Cot-1 유래된 서열의 조성을 결정하기 위하여 혼성화후 회수하였다(표 1: 반응물 21과 22). ABL1a 서열은 표적과 Cot-1 DNA를 모두 보유하는 혼성화된 표본 내에서 128 배 증가하였다(표 3: 반응물 13과 14). Cot-1을 포함하는 혼성화로부터 ABL1AluMER1에 동일한 회수된 서열은 Cot-1이 부재하는 중복 반응물에서 관찰되는 것보다 139배 풍부하였다(표 3: 반응물 15와 16). ABL1AluMER1에 밀접하게 관련된 반복 서열 역시 회수된 혼성화 산물에서 탐지되었다. 92% 유사성을 갖는 Alu 요소, DNJA3Alu(DNJA3 유전자에 5': chr16: 4421138-4421200)는 Cot-1을 보유하는 혼성화 반응물 내에서 관찰되지만 Cot-1이 부재하는 반응물 내에서 관찰되지 않는데, 이는 Cot-1이 이러한 오염 서열의 공급원임을 지시한다(표 3: 반응물 17과 I8). 다른 sc 게놈 분절(즉, CMT1A, HOXB1 및 다른 ABL1 영역(ABL1c와 ABL1d))은 ABL1a 프로브에 혼성화로부터 회수된 산물에서 탐지되지 않았다.

Cot-1 유래된 서열은 ABL1(표 2)에 연결되고 상동성 sc와 반복 서열을 모두 보유하는 서열인 RRP4-1.6a에 혼성화되었다(이러한 단일 사본 프로브가 FISH(14)에 의해 검증되었음에도 불구하고). 중간 정도와 고도로 풍부한 MIR, L2, L1 반복 요소는 게놈 내에서 상기 서열을 둘러싼다. QPCR은 sc 간격 내로부터 유래된 짧은 RRP4-1,6a 산물과 비교하여 상류(5')와 하류(3') 앰플리콘으로부터 회수된 더욱 높은 농도의 반복 서열을 증명하였다(표 3; 반응물 4-12). C_T 수치의 비교는 게놈 반복과 접경하는 sc 서열(RRP4-1.6a5'와 RRP4-1.6a3')은 제조업체 R(및, 유사하게 제조업체 I)의 경우에 Cot-1 분획에서보다 게놈 DNA에서 6.8 배 풍부하였다. 예상된 바와 같이, 내부 sc RRP4-1.6a 서열은 Cot-1에서보다 게놈 DNA에서 훨씬 풍부하지만(24 배), 그럼에도 불구하고, 이는 Cot-1에서 여전히 탐지될 수 있다(표 3: 반응물 7-9). Cot-1 제조 동안 SINE와 LINE의 축적은 연결된 Ic 또는 sc 서열의 증대를 유도하는데, 이들 서열은 혼성화 동안, 공액된 프로브에, 또는 표지된 게놈 DNA 내에서 실제 sc 표적 서열에 잠재적으로 어닐링할 수 있다.

합성 반복성 DNA와의 교차-혼성화의 억제

Cot-1 DNA의 혼성화 효과는 sc 서열에 인접한 반복 요소로부터 특이적으로 제조된 과도한 정제된 합성 DNA를 치환함으로써 3개의 상이한 게놈 좌위에서 반전되었다(도 4). 염색체 4 상에서 ClQTNF7의 상류에서 LTR-유사 반복 요소와 단일 사본 서열을 포함하는 1.9 kb 증폭 산물이 합성되었다. 정제된 합성 LTR-유사 요소, ClQTNF7LTR의 추가는 결합된 미소구에 상기 산물의 자가-혼성화에 영향을 주지 않는 반면, Cot-1 DNA의 추가는 평균 형광을 1.2 배 증가시켰다(표 1: 반응물 23-25). C1QTNF7LTR이 Cot-1 DNA의 존부 하에 절단수선복제된 게놈 DNA에 반복 서열의 혼성화를 차단하는데 이용되었고 유사한 결과를 획득하였다(표 1: 반응물 26-28). AluSx와 Ll 반복 서열의 혼성화는 이들 서열을 보유하는 합성 PCR 산물, HOXB1AluL1을 이용하여, HOXB1 좌위(HOXB1b)의 상류에서 염색체 17 상에서 ~2.3kb 영역 내에서 억제되었다. HOXB1AluL1의 존재 하에 HOXB1b PCR 산물과 상응하는 미소구-결합된 프로브의 혼성화는 증폭된 표적 내에서 반복 서열을 효과적으로 차단하고, 아마도 표적 길이의 감소로 인하여 혼성화 강도를 실제로 0.3 배 감소시켰다(표 1: 반응물 32와 33). 반복 서열의 혼성화는 또한, 표적 영역 내로부터 합성 Alu와 L2 요소의 추가에 의해 미소구에 결합된 ABL1a에 대한 필적하는 게놈 혼성화에서 효과적으로 억제되었다(표 1: 반응물 29-31).

마이크로어레이 혼성화에서 Cot-1의 영향

공개된 혼성화 연구에서 반복 서열 억제를 위한 Cot-1의 거의 보편적인 포함은 상기 반응물이 발현 및/또는 게놈 사본수의 정량적 측정에 어떻게 영향을 주는 지에 관한 의문을 발생시킨다. 이중-라벨 혼성화 강도에서 변이성(variability)은 Cot-1을 이용하는 발현 연구에서 클론된 프로브의 어레이에 혼성화된 일단의 복제 표적 표본 전체에서 평가하였다(GEO 데이터베이스: ). 결과는 미소구 혼성화 측정검사에 이용되는 유전자의 cDNA 프로브(ABL1a, HOXB1, TEKT3)로부터 분석하고, 이후 반복 서열 조성에 의해 구별되는 게놈 환경, 다시 말하면, 반복 서열이 조밀하게 존재하는(표 4, 아래쪽) 또는 드물게 존재하는(표 4, 위쪽) 게놈 환경에 위치하는 여러 유전자 서열에 대한 혼성화 프로필(hybridization profile)을 분석하였다.

복제 Cy3/Cy5 강도 비율은 더욱 적은 더욱 분기하는 반복 서열을 보유하는 게놈 영역으로부터 유래된 프로브와 비교하여 반복-밀집 게놈 간격 내에서 발생하는 서열에 대하여 훨씬 가변성이다. 가령, ABL1은 미소구 공액된-ABL1a에서 관찰된 혼성화 왜곡과 유사하게, 상이한 복제물에서 동일한 검사 표본을 이용하면 증가된 발현과 감소된 발현을 모두 보이는 것으로 밝혀졌다(가령, 0.30의 표본 분산(sample variance)과 p=0.18을 제시하는 데이터베이스 기록 GDS751/20213; 표 4). 대조적으로, HOXB1은 동일한 검사 샘플을 이용한 복제 발현 어레이 연구 간에 로그 비율 강도(log ratio intensity)에서 거의 변이성을 보이지 않았는데(GDS223/31555; 표본 분산 = 0.001 및 p<0.0001), 이는 상기 좌위에서 본 발명의 결과와 일치한다. 이는 Cot-1 내에서 단일 사본 서열이 프로브에 혼성화되고, 표적 cDNA로부터 표지된 반복 서열을 포획하는 혼합된 sc와 반복 서열 네트워크의 형성을 응집한다는 것을 암시한다. 마이크로어레이 연구에서, Cot-1은 GMH에서 관찰되는 것과 유사한 방식으로 복잡한 혼성화 네트워크를 형성함으로써 산재된 반복 서열이 풍부한 클론된 프로브의 혼성화를 왜곡한다.

고찰

앞서 기술된 분석에서는 Cot-1 DNA 내에 존재하는 비-반복 서열이 상동성 프로브와의 혼성화 반응에서 탐지된 표지된 게놈 표적의 양을 현저하게 변화시킬 수 있음을 증명하였다. 교차-혼성화를 억제하는 대신에, Cot-1은 반복 서열을 보유하는 프로브에 대한 혼성화를 3 배 정도 강화시켰다. 이들 결과는 표지되지 않은 Cot-1 DNA 서열이 서열 특이적 프로브와 상보적인 표적 서열 내에서 Ic와 반복 서열을 가교한다는 것을 암시한다. Cot-1 분획 내에서 상동성 Ic 서열에 연결된 반복 서열은 게놈 표적 내에서 표지된 반복 서열의 후속 혼성화를 응집시킬 수 있다. 표지된 게놈 주형과의 프로브 혼성화에 Cot-1 DNA의 추가는 상기 게놈 내에서 프로브 및 다른 부위에 상동한 헤테로이중나선의 네트워크의 형성을 촉진한다(도 3, 실시예 2). Ic와 반복 서열을 모두 보유하는 "부분" 이중나선(도 3, 실시예 3)은 연결된 반복 요소에 Cot-1 DNA의 표지된 Ic 게놈 표적을 통한 추가에 의해 조장된다(도 3; 실시예 4). Ic 게놈 표적 DNA 서열에 연결된 표지된 반복 서열 역시 혼성화 강도를 변화시킬 수 있지만 Ic과 산재된 반복 서열 모두의 축적으로 인하여, Cot-1보다는 못하다.

마이크로어레이와 어레이 CGH 기술의 출현이후, 많은 연구자들이 실험적 재현성에 대한 우려를 제기해왔다(4,5). 아마도, 교차-혼성화와 관련하여 편차의 최대 원인은 반복 서열로부터 기인한다(7). 하지만, 많은 연구자들은 이러한 문제가 cDNA를 어레이에 혼성화시키기에 앞서 Cot-1 DNA로 반복 요소를 차단함으로써 해결된다고 믿고 있다(6,7). Dong 등(19)은 "비-반복 서열의 일부 영역이 인간 Cot-1 DNA 분획에 혼성화될 만큼 반복 서열에 충분히 상동성이다"라는 것을 밝히고, 이것이 마이크로어레이 결과에서 혼성화 강도를 왜곡하는 원인이라고 제안하였다. Cot-1은 프로브 및 무관한 표지된 게놈 표적 사이에 반복 서열 가교의 형성을 촉진함으로써 혼성화 측정검사의 재현성에 영향을 준다. 이는 또한, 프로브 부위에 대하여 표지된 표적과 경쟁하는 Ic와 sc 서열을 보유한다. 이와 같은 계통 오차(systematic error) 근원에 더욱 취약한 것으로 생각되는 다른 게놈 영역을 확인하기 위한 더욱 포괄적인 게놈-범위 분석이 보증된다.

Cot-1 DNA에서 반복 요소는 서열 조성에 기초하여 명시적으로 정의되기 보다는 재회합 동역학(reassociation kinetics)에 기초하여 분류된다. 이는 Ic 서열로 오염되지 않기 때문에, 서열-정의된 합성 반복 DNA는 파라로거스 반복 게놈 표적에 대한 프로브 내에 반복 서열에 의한 교차-혼성화를 차단하는데 더욱 효과적이다. 좌위-특이적 합성 반응물의 다른 이점은 반복 서열의 분기(divergence)로 인하여 Cot-1 DNA 분획에서 과소 표현되거나 표현되지 않는 반복 집단이 합성될 수 있고, 따라서, sc 서열이 없는 게놈 반복 서열의 더욱 정확하고 포괄적인 레퍼토리를 제공한다는 점이다.

그럼에도 불구하고, 전체 게놈에서 모든 공지된 반복 요소를 포괄적으로 표현하는 합성 반복 DNA 반응물로 Cot-1의 대체는 아마도, 이의 제조에 수반되는 비용과 수송의 어려움에 기초하여 제외된다. 존재하는 오염 sc 서열의 양을 제한하기 위하여, Cot-1을 더욱 가공하는 것이 필요할 수도 있다. Cot-1 내에 대부분의 이중-가닥 DNA를 포함하는 재-어닐링된 반복 서열은 단일 가닥 서열에 연결되는데, 이들 서열은 자체로써, 단일 사본과 비-중복 반복 요소로 구성된다. 강제로 전진하는 엑소뉴클레아제, 예를 들면, Mung Bean 뉴클레아제 또는 Lambda 엑소뉴클레아제로 이들 혼합된 이중나선과 단일 가닥 구조의 처리는 이중나선 DNA로부터 돌출하는 단일 가닥 서열을 절단할 것이다. 이들 효소는 동일한 반복 서열 집단의 관련된 구성원 간에, 염기 쌍 서열에 의해 분리되는 단일 가닥 갭 간격 내에서, 또는 이중나선 내에 새김눈(nick)에서 공통적인 부정합 뉴클레오티드를 절단하지 않는다. 이러한 절차는 단일 가닥 반복 서열과 단일 사본 간격을 절단할 것이다. 이는 특히, L1 레트로트랜스포손(retrotransposon)에서 관찰되는 바와 같이 5'(또는 3') 게놈 절두를 공통적으로 나타내는 반복 요소의 표현에 영향을 줄 것이다(11). 이들 서열의 상실은 상응하는 합성 DNA 반응물의 추가에 의해 완화될 수 있다. Cot-1 DNA의 이러한 처리는 sc 서열이 재-어닐링되는 가능성(비록, 이런 이중나선의 형성이 반응 동역학에 의해 선호되진 않지만)으로 인하여 모든 sc 서열을 완전히 제거하지는 못할 것이다.

상기한 내용에 비추어, Cot-1 DNA 대신에 정의된 반복 서열로 구성되는 부분적으로 또는 완전히 합성된 차단제(blocking reagent)의 치환은 발현 마이크로어레이와 어레이 비교 게놈 혼성화의 재현성을 개선할 것이다. 이는 궁극적으로, 이들 폭넓게 이용되는 절차에서 실험 조건의 표준화를 결과할 것이다.

참고문헌

아래의 참고문헌은 본 명세서에 참조로서 편입된다.

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SEQUENCE LISTING <110> The Children's Mercy Hospital Rogan, Peter Knoll, Joan Newkirk, Heather <120> MITIGATION OF Cot-1 DNA DISTORTION IN NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION <130> 36663-PCT <150> 60/737,986 <151> 2005-11-18 <160> 26 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtggcttatg cctgtaattt caca 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agagacaggg tcttcttatg ttgc 24 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atttggaaag attatatcca tctacttaat gc 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 acaaacctac ctacgtttca acactctctt 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gctttatgaa ctagctgatt tagtttgctc 30 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ctcaatctct cttttatctg ttttgtccat tg 32 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tagttaattt agaaggttta aatcacgaga a 31 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ctaattttta aatgtgtgaa tgcaatttt 29 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cagaggaagg aagacgtagt gaac 24 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gctgaaccaa gcagacacag 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 atgggagctt ggataagaga tg 22 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ctataccctg aggcgataat gttc 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 agcagatcag acatacaggt ccaa 24 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ggccaccgta agttacaaga cc 22 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 12 carbons and an amine are conjugated at the 5 prime end <400> 15 cctcttcggg gtagagtttc gctct 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ctcaggccct tgtcacactc ttgaa 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ctcctgtccg tgttctctgc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 aggctggtag tgacctgtgg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tcacccccat tgcatctatt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> biotin conjugated to the 3 prime end <400> 20 taggaagggg gtagggagtg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tcacccccat tgcatctatt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tcccaaagtg ctaggattgc 20 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tgcaattcaa aacagattga aaat 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> bioton conjugated to the 3 prime end <400> 24 ccaccatgtg agaagtttga ctac 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 aagtgtgaaa ggcatatttt agcc 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tacattttgg ggtcatttgt tatg 24

Claims

핵산 프로브 내에 존재하는 반복 서열과 표적 게놈 핵산 내에 존재하는 상동한 반복 서열 사이에 비-특이적 교차-혼성화를 억제하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 억제 방법:

대표적인 게놈 영역 내에서 반복 서열을 확인하는 단계;

상기 확인된 반복 서열로부터 유래된 억제성 핵산을 합성하는 단계, 상기 억제성 핵산은 상기 확인된 반복 서열을 실질적으로 포함하고 적은 사본 서열을 실질적으로 존재하지 않고;

상기 억제성 핵산을 표적 핵산과 반응시켜 상기 억제성 핵산 내에 반복 서열이 상기 표적 핵산 내에 상동한 반복 서열에 혼성화되도록 하는 단계;

여기서, 상기 표적 핵산 내에 상기 반복 서열은 차후에 반응된 핵산 프로브 내에 상동한 반복 서열과의 혼성화가 실질적으로 차단되고, 따라서, 상기 프로브 내에 상기 반복 서열과 상기 표적 핵산 내에 상동한 반복 서열 사이에 비-특이적 교차-혼성화를 억제한다.
청구항 1에 있어서, 표적 핵산은 적은 사본 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 억제성 핵산은 하나이상의 대표적인 게놈 영역 내에서 적은 사본 서열에 인접하는 것으로 밝혀진 반복 서열에 상응하게 선택된 복수의 반복 서열을 보유하도록 합성되는 것을 특징으로 하는 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 억제성 핵산은 적은 사본 서열이 완전히 부재하도록 합성되는 것을 특징으로 하는 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 표적 핵산을 표적 내에서 적은 사본 서열에 상동한 적은 사본 서열을 보유하는 하나이상의 프로브와 혼성화시키는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 프로브는 반복 서열이 실질적으로 부재하는 것을 특징으로 하는 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 프로브는 반복 서열이 완전히 부재하는 것을 특징으로 하는 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 프로브를 스펙트럼-인코딩된 폴리스티렌 미소구에 공액하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 프로브를 탐지가능 모이어티(moiety)로 표지하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 억제 방법.
청구항 9에 있어서, 모이어티는 형광단, 효소 공액체, 형광단-태그된 뉴클레오티드, 항원-보유 뉴클레오티드에 결합된 형광-표지된 항체, 비오틴-dUTP, 디곡시제닌-dUTP, 또는 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 억제성 핵산은 마이크로어레이 혼성화 측정검사, 형광 in situ 혼성화 측정검사, 또는 미소구 혼성화 측정검사에서 선택되는 측정검사에서 반복 서열을 차단하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 억제성 핵산은 짧은 산재된 요소, 긴 산재된 요소, 긴 말단, 반복, Alu 요소, Ll 요소, DNA 트랜스포손에서 선택되는 하나이상의 서열-정의된 PCR 산물을 포함하는 것을 특징으로 하는 억제 방법.
억제 핵산을 합성하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 방법:

대표적인 게놈 영역 내에서 반복 서열을 확인하는 단계;

상기 확인된 반복 서열과 혼성화되지만 상기 대표적인 게놈 영역 내외에서 적은 사본 서열과 혼성화되지 않는 핵산 서열을 합성함으로써 상기 억제 핵산을 합성하는 단계.
청구항 13에 있어서, 합성된 억제 핵산은 적은 사본 서열이 실질적으로 부재하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
청구항 13에 있어서, 목적하는 적은 사본 서열에 대한 근접성(proximity)에 기초하여, 억제 핵산으로서 합성을 위한 특정의 확인된 반복 서열을 선택하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
청구항 15에 있어서, 특정의 확인된 반복 서열은 목적하는 적은 사본 서열에 가장 근접하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
청구항 15에 있어서, 합성된 억제 핵산은 목적하는 적은 사본 서열과 혼성화되는 서열이 부재하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
청구항 13에 있어서, 합성된 억제성 핵산을 혼성화 측정검사에 이용하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
청구항 18에 있어서, 혼성화 측정검사는 형광 in situ 혼성화 측정검사, 마이크로어레이 측정검사, 또는 미소구 혼성화 측정검사에서 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
적은 사본수 핵산 프로브와 표적 핵산 내에 상동성 영역 사이에 혼성화 특이성(hybridization specificity)을 증가시키는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 증가 방법:

상기 표적 핵산 내에 반복 요소를 억제성 핵산 내에 상동한 반복 요소와 혼성화시키는 단계, 상기 억제성 핵산은 복수의 반복 요소를 포함하고 적은 사본수 요소가 실질적으로 부재하며;

상기 표적 핵산 내에 적은 사본수 요소를 하나이상의 핵산 프로브 내에 상동한 적은 사본수 요소와 혼성화시키는 단계.
청구항 20에 있어서, 억제성 핵산 내에서 반복 요소는 하나이상의 대표적인 게놈 영역 내에서 적은 사본 요소에 접하는 반복 요소에 실질적인 상동성을 갖도록 선택되는 것을 특징으로 하는 증가 방법.
청구항 21에 있어서, 측면 반복 요소는 중간 내지 높은 사본수를 갖는 것을 특징으로 하는 증가 방법.
청구항 20에 있어서, 적은 사본 요소는 단일 사본 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 증가 방법.
청구항 20에 있어서, 프로브는 반복 요소가 실질적으로 부재하는 것을 특징으로 하는 증가 방법.
핵산 서열 사본수를 정확하게 정량하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법:

일차 스펙트럼 주소(spectral address)를 갖는 일차, 스펙트럼-인코딩된 형광 미소구 및 이차 스펙트럼 주소를 갖는 이차, 스펙트럼-인코딩된 형광 미소구를 제조하는 단계;

목적하는 서열이 위치하는 것으로 의심되는 표적 핵산 서열을 각 뉴클레오티드 서열별로 확정함으로써 표적 게놈 핵산 프로브 서열을 확인하는 단계;

상기 확인된 표적 게놈 핵산 프로브 서열로부터 유래된 적은 사본 표적 프로브를 합성하는 단계, 상기 표적 프로브는 최소한 하나의 적은 사본 요소를 포함하고 반복 요소가 실질적으로 부재하며;

상기 표적 프로브를 상기 일차 미소구에 공액하는 단계;

상기 표적 핵산 서열의 참고 핵산 서열에 혼성화되도록 선택되는 참고 프로브를 합성하는 단계;

상기 참고 프로브를 이차 스펙트럼 주소를 갖는 미소구에 공액하는 단계;

대표적인 게놈 영역 내에서 반복 서열을 확인하는 단계;

억제성 핵산을 합성하는 단계, 상기 억제성 핵산은 상기 확인된 반복 서열에 혼성화될 만큼 충분히 상동한 서열을 포함하고, 상기 억제성 핵산은 반복 요소를 실질적으로 포함하고 적은 사본 요소가 실질적으로 부재하며;

상기 억제성 핵산을 염색체 표적 서열과 반응시켜, 상기 억제성 핵산 내에 반복 요소가 상기 염색체 표적 서열 내에 상동한 반복 요소와 혼성화되도록 하는 단계;

상기 표적 프로브를 상기 염색체 표적 서열에 반응시켜, 상기 표적 프로브 내에 적은 사본 요소가 상기 염색체 표적 서열 내에 상동한 적은 사본 요소에 혼성화되도록 하는 단계;

상기 억제성 핵산을 상기 염색체 표적 서열을 보유하는 염색체 참고 서열과 반응시켜, 상기 억제성 핵산 내에 반복 요소가 상기 염색체 참고 서열 내에 상동한 반복 요소에 혼성화되도록 하는 단계;

상기 참고 프로브를 상기 염색체 참고 서열과 반응시켜, 상기 참고 프로브가 상기 염색체 참고 서열에 혼성화되도록 하는 단계;

일차 스펙트럼 주소를 통하여 혼성화된 표적 프로브를 탐지하는 단계;

이차 스펙트럼 주소를 통하여 혼성화된 참고 프로브를 탐지하는 단계;

탐지된 혼성화된 표적 프로브의 반응을 탐지된 혼성화된 참고 프로브의 반응과 비교함으로써 탐지된 표적 프로브를 정량하는 단계.
청구항 25에 있어서, 억제성 DNA는 반복 요소를 포함하고, 상기 반복 요소는 표적 내에서 적은 사본 요소에 인접한 게놈 반복 요소에 상응하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
핵산 프로브 내에 존재하는 반복 요소와 표적 핵산 내에 존재하는 상동한 반복 요소 사이에 비-특이적 교차-혼성화를 억제하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 억제 방법:

억제성 핵산을 하나이상의 적은 사본 요소를 보유하는 표적 핵산 내에 상동한 반복 요소와 혼성화시키는 단계, 상기 억제성 핵산은 중간 내지 높은 사본수 반복 요소에 인접한 단일 사본 영역을 보유하는 하나이상의 대표적인 게놈 영역에 상응하게 선택된 복수의 반복 요소를 보유하도록 합성되고 적은 사본 요소가 실질적으로 부재하게 합성되며;

상기 표적 핵산을 상기 표적 내에서 적은 사본 요소에 상동한 적은 사본 요소를 보유하는 하나이상의 프로브와 더욱 혼성화시키는 단계, 상기 프로브는 반복 서열이 실질적으로 부재한다.
억제성 핵산 내에 존재하는 적은 사본 요소와 핵산 프로브 또는 표적 핵산 내에 존재하는 상동한 적은 사본 요소 사이에 비-특이적 교차-혼성화를 억제하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

상기 표적 핵산 내외에서 반복 요소와 적은 사본 요소를 확인하는 단계;

합성 과정 동안 적은 사본 서열의 포함을 실질적으로 피하면서 상기 억제성 핵산 내에 포함을 위한 상기 표적 핵산으로부터 반복 서열을 선택함으로써 억제성 핵산 서열을 합성하는 단계;

상기 합성된 억제성 핵산을 상기 표적 핵산과 반응시켜, 개별 상동성 억제성 핵산과 표적 핵산 요소가 서로 혼성화되도록 하는 단계.
Cot-1 DNA를 이용하여 측정검사의 정확도와 재현성을 증가시키는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 증가 방법:

복수의 반복 요소를 보유하지만 적은 사본 서열이 실질적으로 부재하는 억제 핵산을 선택하거나 합성하는 단계;

상기 선택된 또는 합성된 억제 핵산을 Cot-1 DNA 대신으로 이용하는 단계.
핵산 프로브로 게놈 표적 핵산의 우발적인 혼성화를 억제하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 억제 방법:

목적하는 서열에 상응하는 게놈 내에서 서열을 선택함으로써 혼성화를 위한 게놈 표적 핵산을 제조하는 단계;

목적하는 표적 서열 내에서 적은 사본 서열을 확인하는 단계;

상기 확인된 적은 사본 표적 서열에 상동한 적은 사본 프로브를 합성하는 단계, 상기 적은 사본 프로브는 반복 서열이 실질적으로 부재하고;

상기 표적 적은 사본 서열에 인접한 반복 서열을 확인하는 단계;

상기 표적 반복 서열에 상동한 억제 DNA를 합성하는 단계, 상기 억제 DNA는 반복 요소를 실질적으로 포함하고;

상기 표적 핵산을 상기 억제 DNA와 반응시켜, 억제 DNA 내에 상기 반복 요소 가 표적 핵산 내에 상동한 반복 요소에 혼성화되도록 하는 단계;

상기 표적 핵산을 상기 적은 사본 프로브와 반응시켜, 상기 프로브 내에 적은 사본 요소가 상기 표적 핵산 내에 상동한 적은 사본 요소에 혼성화되도록 하는 단계;

상기 적은 사본 프로브를 탐지하여 상기 프로브의 상기 표적에 대한 혼성화를 정량하는 단계,

여기서, 상기 표적 핵산 내에서 적은 사본 요소의 사례가 확정될 수 있다.