JP2009247231A - 標的塩基判別方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】核酸試料中の核酸の標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、擬陽性の可能性が少なく、かつ明確に標的塩基を判別することができる標的塩基特異性プライマー、及び該標的塩基特異性プライマーを用いた標的塩基判別方法の提供。
【解決手段】 標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、前記標的塩基対応塩基の5’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、かつ、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の3’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が特定の塩基種であることを特徴とする標的塩基特異性プライマー、及び該標的塩基特異性プライマーを用いた標的塩基判別方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられる標的塩基特異性プライマー、及び該標的塩基特異性プライマーを用いた標的塩基判別方法に関する。
遺伝子多型は、癌等の特定の疾患に対する罹り易さや、薬物代謝能等の個体差の主要な一因と考えられている。特にSNP(一塩基多型)は、遺伝子多型の中で最も高頻度で現れる多型であり、ヒトゲノム中において約0.1%の頻度で現れると考えられている。実際に、これまでにヒトゲノムにおいて300万を超える数のSNPの存在が明らかになってきており、このことはSNPが遺伝子検査マーカーとして非常に有用であることを示している。これまでのSNPと疾病の関連付けの研究によって、薬剤感受性の予測や糖尿病や高血圧症等の疾病とSNPが深く関連していることが明らかになってきている。
SNPを判別する、すなわち、核酸試料中の核酸が、SNPの各塩基種のうち、いずれの塩基種であるかを判別する方法の一つに、アレル特異性プライマーを用いたプライマー伸長反応を利用する技術が知られている。ここで、アレル特異性プライマーとは、標的とするSNPの塩基種のうち、検出対象である特定の塩基種と相補的な塩基を有しており、鋳型となる核酸が有する標的SNPの塩基種に依存してプライマー伸長反応効率に著しい差が生じるプライマーのことを言う。具体的には、標的SNPとして、検出対象である塩基種を有するアレルを鋳型とした場合には、プライマー伸長反応効率が高くなり、その他の塩基種を有するアレルを鋳型とした場合には、プライマー伸長反応効率が低くなる。したがって、例えば、核酸試料中の核酸を鋳型とし、アレル特異性プライマーを用いてPCR(Polymerase Chain Reaction)を行い、得られたPCR産物量を解析することにより、標的SNPの塩基種を特定することができる。
つまり、アレル特異性プライマーを用いたSNP判別方法は、プライマー伸長反応の結果得られた伸長産物の量を解析することにより、簡単にSNPを判別し得ることから、他のSNP判別方法に比べて、コストや反応時間、操作の簡便性といった面において非常に有利である。例えば、アレル特異性プライマーとして、特に何も修飾されていない単なるオリゴヌクレオチドを用いた場合であっても、汎用されている電気泳動法を用いることにより、簡便に伸長産物量を解析することができる。なお、解析方法については、電気泳動法に限定されるものではなく、固相系の反応を行い、水晶発振子マイクロバランス(QCM)や表面プラズモン共鳴(SPR)現象を解析することによっても、検出することも可能である。さらに近年では、プライマー伸長反応の副産物であるPpi(ピロリン酸)を、ルシフェラーゼ反応を利用して検出する方法も開発されており、アレル特異性プライマーを用いたSNP判別方法の簡便化や迅速化は世界中において精力的に取り組まれている。特に、アレル特異性プライマーの配列設計は、そのSNP判別能において非常に重要なファクターであり、よりSNP判別能の高い優れたアレル特異性プライマーの開発が広く試みられている。
これまでに幾つかの新規アレル特異性プライマーが開発されている。まず、プライマー内の何れかの場所に多型塩基部位に対応する塩基を有するプライマーが提案された(例えば、特許文献1参照。)。ここで、「多型塩基部位に対応する塩基」とは、プライマー中の塩基であって、該プライマーが多型塩基部位を有する核酸とハイブリダイズする際に、該多型塩基部位と相互作用する塩基を意味する。その後、多型塩基部位がプライマーの3’末端に限定されたプライマー、すなわち予想される標的SNPの塩基種のいずれかに相補的な塩基を3’末端に有するプライマーが現れた(例えば、特許文献2参照。)。このような、3’末端塩基が標的SNP塩基に対応しており、それ以外の配列は標的塩基配列に対して完全に相補的であるプライマーが、現在の最も典型的なアレル特異性プライマーである。
しかしながら、特許文献1や2に記載のアレル特異性プライマーは、SNP判別能が十分ではなく、プライマー伸長反応の反応時間や温度、あるいは反応に用いるdNTPs濃度、またはPCR法を用いるのであればサイクル数等の反応条件を厳密に規定しなければ、アレル特異性プライマーの検出対象である塩基種以外の塩基種を有する核酸を鋳型とした場合であっても、プライマー伸長反応効率が高くなり、擬陽性の問題が生じてしまう。
このような擬陽性の問題を解決するために、人為的にミスマッチを導入することにより特許文献2記載のプライマーを改良した新規アレル特異性プライマーが開発されている。このようなプライマーとして、例えば、(1)3’末端塩基が標的SNP塩基に対応しており、3’末端から2番目の塩基にミスマッチを導入したアレル特異性プライマー(例えば、特許文献3参照。)や、(2)3’末端塩基が標的SNP塩基に対応しており、3’末端から2番目及び3番目の塩基に、特定の塩基種の組合せからなるミスマッチを導入したアレル特異性プライマー(例えば、特許文献4参照。)等がある。特に特許文献4記載のアレル特異性プライマーでは、2塩基の組合せを全て吟味し、特に特異性が高く出るような塩基種の組合せを選出し、ミスマッチとして導入している。
また、標的SNP塩基に対応する塩基が、プライマーの3’末端塩基に限定されないものとして、例えば、(3)標的SNP塩基に対応する塩基に隣接する塩基を、DNA型塩基またはRNA型塩基と相互作用のない置換基に置換することによりミスマッチを導入したアレル特異性プライマー(例えば、特許文献5参照。)や、このアレル特異性プライマーを改良したものであって、(4)プライマーの3’末端より2番目の塩基が標的SNP塩基に対応する塩基であり、3’末端の3番目から5’末端までの少なくとも1つの塩基にミスマッチを導入したアレル特異性プライマー(例えば、特許文献6参照。)等がある。さらに、(5)3’末端から4塩基以内に標的SNP塩基に対応する塩基を有し、この標的SNP塩基に対応する塩基に隣接する塩基に、標的SNP塩基の塩基種に応じて選択した塩基種のミスマッチを導入したアレル特異性プライマー(例えば、特許文献7参照。)等がある。
特許第2760553号公報 特許第2853864号公報 米国特許出願公開第2003/0022175号明細書 特許第3859684号公報 特開2005−287499号公報 国際公開2001/042498号パンフレット 特開2004−121087号公報
特許文献3〜7に記載のアレル特異性プライマーは、主に標的SNP塩基に対応する塩基の隣接部にミスマッチを導入し、プライマーと標的塩基配列を有する核酸とのハイブリダイズにおけるSNP近傍をより不安定化することにより、アレル特異性プライマーのSNP識別能を向上させ、擬陽性の問題の解決を図っている。しかしながら、擬陽性を低く抑えることが可能となる場合であっても、アレルごとにプライマー伸長反応効率が大きく異なるような場合には、プライマー伸長反応効率の高低に基づいてアレルを特定することは困難であり、例えば、コントロールをおいて各試料のプライマー伸長反応効率を比較する等の煩雑な判定方式をとらなければならない場合が多い。
このような問題に対し、特許文献4及び7記載のアレル特異性プライマーでは、導入するミスマッチの塩基種を特定の塩基種とすることにより、擬陽性の抑制だけではなく、プライマー伸長反応効率までも調整しようとする試みがなされている。しかしながら、特許文献4記載では、プライマーにミスマッチとして導入される2塩基の組合せは、ミスマッチにのみ着目して決定されている。また、特許文献7記載では、ミスマッチとして導入される塩基は、標的SNP塩基の塩基種にのみ着目して決定されている。このため、これらのアレル特異性プライマーは、標的塩基配列の種類によっては、プライマー伸長反応効率が十分に調整されず、プライマー伸長反応効率の高低に基づいてアレルを特定することは難しい。
本発明は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、擬陽性の可能性が少なく、かつ明確に標的塩基を判別することができる標的塩基特異性プライマー、及び該標的塩基特異性プライマーを用いた標的塩基判別方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的塩基に対応するプライマー上の塩基(標的塩基対応塩基)にミスマッチを導入する場合に、標的塩基に対応する塩基の5’側の隣接する塩基にミスマッチを導入すること、及び、ミスマッチとして導入される塩基(ミスマッチ塩基)の塩基種は、標的塩基の塩基種と、該ミスマッチ塩基と対応する標的塩基配列上の塩基(ミスマッチ対応塩基)の塩基種との組合せに応じて特定の塩基種とすることにより、非常に高いプライマー伸長反応効率を示すという知見を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第一の態様は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、前記標的塩基対応塩基の5’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、かつ、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の3’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記(1a)〜(1m)からなる群より選択される1であることを特徴とする標的塩基特異性プライマーである。
(1a)前記標的塩基として予想される塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
(1b)前記標的塩基として予想される塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
(1c)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
(1d)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
(1e)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がAである。
(1f)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がA又はCである。
(1g)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
(1h)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
(1i)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はCである。
(1j)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
(1k)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
(1l)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がAである。
(1m)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
また、本発明の第二の態様は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、前記標的塩基対応塩基の5’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、前記ミスマッチ対応塩基の3’側に隣接する塩基をアンカー塩基とし、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の3’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記(2a)〜(2m)からなる群より選択される1であることを特徴とする標的塩基特異性プライマーである。
(2a)前記アンカー塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
(2b)前記アンカー塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
(2c)前記アンカー塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
(2d)前記アンカー塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
(2e)前記アンカー塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
(2f)前記アンカー塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
(2g)前記アンカー塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
(2h)前記アンカー塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
(2i)前記アンカー塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がA又はTである。
(2j)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がA、G、又はCである。
(2k)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
(2l)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がA、T、又はGである。
(2m)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がA又はTである。
本発明の第一及び第二の発明においては、前記ミスマッチ塩基が1塩基であり、前記(1a)〜(1m)からなる群より選択される1と、前記(2a)〜(2m)からなる群より選択される1とにおいて、ミスマッチ塩基の塩基種が異なる場合に、前記ミスマッチ塩基が、前記(2a)〜(2m)からなる群より選択される1の塩基種であることが好ましい。
また、本発明の第一及び第二の発明においては、前記ミスマッチ塩基及び前記ミスマッチ対応塩基が1又は2塩基であることが好ましい。
さらに、本発明の第一及び第二の発明においては、前記ミスマッチ塩基は、3’末端から4塩基以内に配置されていることが好ましい。
また、本発明の第三の態様は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別する方法であって、(I)前記核酸試料中の核酸と、本発明の第一又は第二の態様の標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う工程と、(II)前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種を、前記工程(I)における核酸伸長効率に基づき判別する工程と、を有することを特徴とする標的塩基判別方法である。
本発明の第三の態様においては、前記工程(II)が、(II−1)前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程(I)における核酸伸長効率が高い場合には前記予想される塩基であり、前記工程(I)における核酸伸長効率が低い場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程であることが好ましい。
また、前記工程(I)の後前記工程(II)の前に、(III)標的塩基の塩基種が、前記予想される塩基とは異なる種類の塩基である標的塩基配列を有する核酸と、前記標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う核酸伸長工程と、を有し、前記工程(II)が、(II−2)前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が前記工程(III)において得られた伸長産物の量よりも多い場合には前記予想される塩基であり、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が前記工程(III)において得られた伸長産物の量以下である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程、であることが好ましい。前記工程(II−2)が、(II−3)前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が前記工程(III)において得られた伸長産物の量の3倍以上である場合には前記予想される塩基であり、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が前記工程(III)において得られた伸長産物の量の3倍未満である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程、であることも好ましい。
また、本発明の第三の態様においては、前記核酸伸長反応が、プライマー伸長反応であることが好ましい。
本発明の第一及び第二の態様の標的塩基特異性プライマーは、標的塩基の識別能が十分に高い上に、標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行った場合に、核酸伸長反応効率が十分に高いという特性を有する。このため、本発明の標的塩基特異性プライマーは、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために特に好適に用いられる。
また、本発明の第三の態様の標的塩基判別方法を用いて、標的塩基の塩基種を判別することにより、擬陽性の可能性が少なく、かつ明確に標的塩基を判別することができる。
本発明における標的塩基配列とは、解析の対象となる標的塩基を含む塩基配列であって、遺伝子組換え技術等により解析が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列であってもよく、mRNA等の生物のRNAに存在する塩基配列であってもよい。なお、本発明において、標的塩基配列を有する核酸を、標的核酸という。
本発明において、標的塩基とは、標的塩基配列中の一塩基であって、解析の対象となる塩基であり、複数の塩基種があり得るものである。ここで、塩基種とは、塩基配列を構成するヌクレオチドの種類であり、具体的には、ヌクレオチドの塩基部分が、標的塩基がDNAである場合には、A(アデニン)、G(グアニン)、T(チミン)、C(シトシン)のいずれかであり、標的塩基がRNAである場合には、A、G、U(ウラシル)、Cのいずれかである。
本発明における標的塩基としては、複数の塩基種があり得るものであれば、特に限定されるものではないが、遺伝子多型や、疾患のマーカー遺伝子中の特徴的な塩基等であることが好ましい。なお、マーカー遺伝子中の特徴的な塩基とは、該マーカー遺伝子の塩基配列と他の遺伝子の塩基配列とを識別し得る塩基を意味する。ここで、遺伝子多型とは、ある生物種の集団内で、個体ごとに遺伝子の塩基配列が異なるものであれば、特に限定されるものではない。該遺伝子多型として、例えば、一塩基多型(SNP)、マイクロサテライト等がある。本発明における標的塩基としては、特にSNPであることが好ましい。
本発明における核酸試料とは、標的塩基配列を有する核酸(以下、標的核酸ということがある。)を含んでいることが期待される試料であれば、特に限定されるものではない。該核酸試料として、例えば、動物等から採取した生体試料であってもよく、培養細胞溶液等から調製した試料であってもよく、生体試料等から抽出・精製した核酸溶液であってもよい。特に臨床検査等に用いられるヒト由来の生体試料や、ヒト由来の生体試料から抽出・精製した核酸溶液であることが好ましい。また、該核酸試料は、生物から採取された状態の試料であってもよく、調製した試料であってもよい。該調製の方法は、該生体試料中に含有されているDNAやRNA等の核酸を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、通常、生体試料に対してなされている調製方法を行うことができる。その他、生体試料から抽出・精製したDNAをPCR等により増幅処理して得られたものであってもよく、生体試料中に含有されるRNAから逆転写酵素を用いて合成されたcDNAであってもよい。
本発明においては、標的核酸と非相補的な塩基であるミスマッチを標的塩基の隣接部に導入することにより、プライマーと標的核酸とのハイブリダイズにおける標的塩基近傍をより不安定化し、標的塩基特異性プライマーの標的塩基識別能を向上させ、擬陽性の問題の解決を図っている。特に、本発明においては、プライマー上のミスマッチ塩基に隣接する塩基とミスマッチ塩基の組み合わせを最適化することにより、標的塩基識別能を高めている。
通常、ミスマッチ塩基の塩基種は、標的核酸上のミスマッチ塩基と対応する塩基(以下、ミスマッチ対応塩基という。)と非相補的な3種類の塩基のいずれかであればよい。しかしながら、ミスマッチ塩基部分は不安定であり、この不安定性な部分よりプライマー全体の標的核酸からの遊離が起こるため、プライマーを標的核酸に繋ぎとめておくべき塩基、すなわちミスマッチ塩基の隣接塩基が重要である。そこで、本発明においては、ミスマッチ塩基の塩基種を、ミスマッチ対応塩基の塩基種と、標的核酸上の該ミスマッチ対応塩基と隣接する塩基の塩基種との組み合わせに対して最適な特定の塩基種としている。
本発明においては、標的塩基特異性プライマー上の標的塩基対応塩基の5’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とする。すなわち、標的塩基配列上の、標的塩基の3’側に隣接する塩基がミスマッチ対応塩基である。つまり、標的塩基(ミスマッチ対応塩基の5’側に隣接する塩基)の塩基種とミスマッチ対応塩基の塩基種との組み合わせ、又は、ミスマッチ対応塩基の3’側に隣接する塩基(以下、アンカー塩基という)の塩基種とミスマッチ対応塩基の塩基種との組み合わせに対応した特定の塩基種をミスマッチ塩基として導入する。
具体的には、本発明の第一の態様である標的塩基特異性プライマーは、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、前記標的塩基対応塩基の5’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、かつ、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の3’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記(1a)〜(1m)からなる群より選択される1であることを特徴とする。
(1a)前記標的塩基として予想される塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
(1b)前記標的塩基として予想される塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
(1c)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
(1d)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
(1e)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がAである。
(1f)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がA又はCである。
(1g)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
(1h)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
(1i)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はCである。
(1j)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
(1k)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
(1l)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がAである。
(1m)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
また、本発明の第二の態様である標的塩基特異性プライマーは、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、前記標的塩基対応塩基の5’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、前記ミスマッチ対応塩基の3’側に隣接する塩基をアンカー塩基とし、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の3’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記(2a)〜(2m)からなる群より選択される1であることを特徴とする。
(2a)前記アンカー塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
(2b)前記アンカー塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
(2c)前記アンカー塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
(2d)前記アンカー塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
(2e)前記アンカー塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
(2f)前記アンカー塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
(2g)前記アンカー塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
(2h)前記アンカー塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
(2i)前記アンカー塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がA又はTである。
(2j)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がA、G、又はCである。
(2k)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
(2l)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がA、T、又はGである。
(2m)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がA又はTである。
図1は、本発明の第一又は第二の態様である標的塩基特異性プライマーと、標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図である。図1(a)は、標的塩基特異性プライマーと、標的塩基の塩基種が、該標的塩基特異性プライマーが特異的に識別する塩基である標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図であり、図1(b)は、標的塩基特異性プライマーと、標的塩基の塩基種が、該標的塩基特異性プライマーが特異的に識別する塩基以外の塩基である標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図である。標的核酸2中、Sの囲い文字が予想される塩基種である標的塩基、S字のない□が予想される塩基種以外の塩基種である標的塩基、○がミスマッチ対応塩基、△がアンカー塩基である。また、標的塩基特異性プライマー1中、Sの塗りつぶし囲い文字が標的塩基対応塩基であり、●がミスマッチ塩基、▲がアンカー塩基に対応する塩基である。
つまり、本発明の第一の態様の標的塩基特異性プライマーにおいては、例えば、標的塩基配列中、標的塩基S(囲い文字)がAであり、ミスマッチ対応塩基○がTである場合に、ミスマッチ塩基●をT又はGとする。また、標的塩基配列中、標的塩基S(囲い文字)がCであり、ミスマッチ対応塩基○がCである場合に、ミスマッチ塩基●をCとする。一方、本発明の第二の態様の標的塩基特異性プライマーにおいては、例えば、標的塩基配列中、アンカー塩基△がAであり、ミスマッチ対応塩基○がAである場合に、ミスマッチ塩基●をCとする。また、標的塩基配列中、アンカー塩基△がCであり、ミスマッチ対応塩基○がCである場合に、ミスマッチ塩基●をA又はTとする。
第一の態様及び第二の態様において、ミスマッチ塩基として複数種類の塩基が挙げられている場合、いずれの塩基種を選択してもよい。例えば、標的塩基特異性プライマーのTm値、塩基長、同時に使用する他のプライマーの種類、核酸伸長反応の反応条件等を考慮して、適宜選択することができる。
また、第一の態様の標的塩基特異性プライマーと、第二の態様の標的塩基特異性プライマーのいずれを用いてもよい。第一の態様と第二の態様のいずれの標的塩基特異性プライマーを用いるかは、例えば、標的塩基配列の種類、核酸伸長反応の反応条件等を考慮して、適宜選択することができる。
第一の態様と第二の態様を組み合わせた標的塩基特異性プライマーを用いることにより、さらに、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得るという好ましい効果を得ることができる。例えば、標的塩基配列において、標的塩基がAであり、ミスマッチ対応塩基がTであり、アンカー塩基がAである場合に、第一の態様の標的塩基特異性プライマーでは、ミスマッチ塩基としてT又はGを用いることができ(1a)、第二の態様の標的塩基特異性プライマーでは、ミスマッチ塩基としてG又はCを用いることができる(2b)。したがって、ミスマッチ塩基としてGを用いることにより、最も高精度に標的塩基の塩基種を判別し得る標的塩基特異性プライマーを得ることができる。
なお、ミスマッチ塩基が1塩基である場合には、第一の態様と第二の態様において、選択されるミスマッチ塩基の塩基種が異なる場合がある。この場合には、第二の態様を優先させることが好ましい。つまり、前記ミスマッチ塩基が1塩基であり、前記(1a)〜(1m)からなる群より選択される1と、前記(2a)〜(2m)からなる群より選択される1とにおいて、ミスマッチ塩基の塩基種が異なる場合には、ミスマッチ塩基は、(2a)〜(2m)からなる群より選択される1の塩基種とすることが好ましい。
例えば、標的塩基として予想される塩基がCであり、ミスマッチ対応塩基がCであり、アンカー塩基がTである場合には、第一の態様においては、(1m)よりミスマッチ塩基はCとなるが、第二の態様においては、(2f)よりミスマッチ塩基はTとなり、塩基種が一致しない。この場合には、標的塩基特異性プライマーのミスマッチ塩基をCよりもTとすることが好ましい。
第一の態様及び第二の態様の標的塩基特異性プライマー(以下、本発明の標的塩基特異性プライマーということがある。)において、標的塩基対応塩基、ミスマッチ塩基、及びアンカー塩基に対応する塩基は、プライマーの3’末端側からこの順に配置されていればよい。つまり、標的塩基特異性プライマー上の標的塩基対応塩基の位置は、必ずしも限定されるものではないが、ミスマッチ塩基が、3’末端から4塩基以内に配置されていること、すなわち、標的塩基特異性プライマーの3’末端側から3塩基以内に標的塩基対応塩基が配置されていることが好ましい。標的塩基特異性プライマーの3’末端側近傍に標的塩基対応塩基やミスマッチ塩基を配置することにより、プライマーの標的塩基の識別能を十分に高くすることができるためである。標的塩基特異性プライマーの3’末端側から2塩基目に標的塩基対応塩基が、3塩基目にミスマッチ塩基が、それぞれ配置されていることがより好ましい。
また、本発明の標的塩基特異性プライマーにおいて、ミスマッチ塩基が標的塩基対応塩基の5’側に隣接する塩基であれば、ミスマッチ塩基の数は特に限定されるものではない。例えば、標的塩基対応塩基の5’側の隣接した塩基を一端とした連続した塩基をミスマッチ塩基とすることができる。ミスマッチ塩基数は、1又は2塩基であることが好ましく、1塩基であることがより好ましい。
本発明の標的塩基特異性プライマーにおいて、標的塩基対応塩基、ミスマッチ塩基、アンカー塩基に対応する塩基以外の塩基は、標的塩基配列と相補的な塩基であることが好ましいが、本発明の標的塩基特異性プライマーを用いて標的塩基の塩基種を判別し得る限り、特に限定されるものではなく、標的塩基配列と完全に相補的である必要はない。
本発明の標的塩基特異性プライマーは、標的塩基配列に応じて、常法により設計することができる。例えば、公知のゲノム配列データやSNPデータ等から得られる塩基配列情報と、汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便に設計することができる。公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースであるNCBI(National center for Biotechnology Information)やDDBJ(DNA Data Bank of Japan)等において入手することができる。また、公知のSNPデータは、例えば、東京大学医科学研究所が整備した日本人のSNPのデータベースJSNP(http://snp.ims.u−tokyo.ac.jp/index_ja.html)等のデータベースから入手することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Web上で利用可能なPrimer3(Rozen, S., H.J. Skaletsky、1996年、http: //www−genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3. html)や、Visual OMP(DNA Software社製)等がある。
このようにして設計したプライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、オリゴ合成メーカーに合成をされ依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。
また、本発明の標的塩基特異性プライマーは、標的核酸とハイブリダイズする領域以外にも、標的塩基の塩基種判別を阻害しない程度において、付加的な配列を有することができる。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、核酸の標識に供される配列等がある。
さらに、本発明の標的塩基特異性プライマーは、後述する工程(I)により得られた核酸伸張産物の検出や解析等を容易にするために、標識されたものであってもよい。該標識をするための物質は、核酸の標識に用いることができるものであれば、特に限定されるものではなく、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン等がある。
本発明の第三の態様である標的塩基判別方法(以下、本発明の標的塩基判別方法ということがある。)は、本発明の標的塩基特異性プライマーを用いて標的塩基の塩基種の判別を行う方法である。具体的には、本発明の標的塩基判別方法は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別する方法であって、(I)前記核酸試料中の核酸と、本発明の標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う工程と、(II)前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種を、前記工程(I)における核酸伸長効率に基づき判別する工程と、を有することを特徴とする。
例えば、図1(a)において、標的塩基特異性プライマー1と標的核酸2は、標的塩基特異性プライマー1上のミスマッチ塩基以外では互いに相補的である、つまり、標的塩基特異性プライマー1の3’末端側は標的核酸2とハイブリダイズしているため、標的核酸2を鋳型とした標的塩基特異性プライマー1の核酸伸長反応が効率よく進行する。一方、図1(b)において、標的塩基特異性プライマー1と標的核酸2は、標的塩基特異性プライマー1上のミスマッチ塩基と標的塩基対応塩基の2塩基において非相補的であり、このため、標的塩基特異性プライマー1の3’末端側は標的核酸2とハイブリダイズし難く、標的核酸2を鋳型とした標的塩基特異性プライマー1の核酸伸長反応効率は低くなる。このように、工程(II)において、前記工程(I)における核酸伸長効率が高い場合には、前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記予想される塩基(核酸伸長反応において用いた標的塩基特異性プライマーの標的塩基対応塩基と相補的な塩基)であり、前記工程(I)における核酸伸長効率が低い場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別することができる。
ここで、核酸伸長反応効率の高低は、当業者であれば、核酸伸長反応の種類、反応条件等を考慮して適宜判別することができる。例えば、標的塩基の塩基種が予め分かっている標的核酸を鋳型として、工程(I)と同様に核酸伸長反応を行い、得られた核酸伸長反応効率を基準として判別することができる。
具体的には、前記工程(I)の後前記工程(II)の前に、工程(III)として、標的塩基の塩基種が、前記予想される塩基とは異なる種類の塩基である標的塩基配列を有する核酸と、前記標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う核酸伸長工程と、を有し、前記工程(II)において、前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が、前記工程(III)において得られた伸長産物の量よりも多い場合には前記予想される塩基であり、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が、前記工程(III)において得られた伸長産物の量以下である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別することができる。
また、後述するように、伸長反応をリアルタイムPCR等のPCR法にて行う場合には、サイクル数を基にして伸長反応効率を比較することが汎用されている。この場合には、例えば、2サイクル分程度の産物量比があれば、伸長産物量が異なると判断し得る。ここで、1サイクル当たりの増幅率を1.75とした場合に、2サイクル分の産物量比は約3(1.75×1.75≒3.06)である。このため、前記工程(II)において、前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が、前記工程(III)において得られた伸長産物の量の3倍以上である場合には前記予想される塩基であり、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が、前記工程(III)において得られた伸長産物の量の3倍未満である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別することも好ましい。
工程(I)における核酸伸長反応は、核酸試料中の核酸と、本発明の標的塩基特異性プライマーとのハイブリダイズを利用するものであれば、特に限定されるものではなく、遺伝子解析等の分野で通常行われている核酸伸長反応の中から適宜選択して用いることができる。例えば、プライマー伸長反応であってもよく、リガーゼを用いて別のプライマーと結合させる反応であってもよい。
本発明の標的塩基判別方法においては、核酸伸長反応として、プライマー伸長反応であることが好ましい。プライマー伸長反応は、核酸試料中の核酸を鋳型とし、本発明の標的塩基特異性プライマーを伸長させる反応であれば、特に限定されるものではなく、遺伝子解析等の分野で通常行われている核酸伸長反応の中から適宜選択して用いることができる。核酸試料中の標的核酸量が微量である場合であっても、標的塩基の塩基種を判別し得ることから、本発明の標的塩基判別方法においては、プライマー伸長反応として、PCR(Polymerase Chain Reaction)法、LAMP(Loop−Mediated Isothermal Amplification)法、SMAP(SMart Amplification Process)法、RCR(Recombinatorial Chain Reaction)法、TMA(Transcripition mediated amplification)法、PALSAR(Probe alternation link self−assembly reaction)法、NASBA(nucleic acid sequence based amplification)法、及びICAN (Isothermal and chimieric primer initiated amplification of nucleic acids) 法等の塩基増幅反応であることがより好ましい。
工程(I)における核酸伸長反応として、PCR法等の塩基増幅反応を用いた場合には、工程(I)における核酸伸長効率を、前記塩基増幅反応により産生された増幅産物量に基づいて調べることができる。核酸伸長効率が高い場合には、増幅産物量は多くなり、核酸伸長効率が低い場合には、増幅産物量は少なくなるためである。
その他、前記核酸伸長効率は、前記塩基増幅反応により産生された増幅産物の分子量に基づき調べることもできる。本発明の標的塩基判別方法においては、標的塩基識別能が非常に高い本発明の標的塩基特異性プライマーを用いるため、核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、標的塩基特異性プライマーの標的塩基対応塩基と非相補的な塩基である場合の核酸伸長反応効率は非常に低く、擬陽性が生じるおそれが顕著に小さいため、増幅産物の分子量が予想される分子量であれば、核酸伸長効率が高いと判断することができるためである。
核酸伸長反応において用いられるポリメラーゼ等の酵素、ヌクレオチド、バッファー等の試薬は、特に限定されるものではなく、通常使用されているものを通常使用されている濃度で用いることができる。また、核酸伸長反応は常法により行うことができ、反応条件等は、標的塩基配列の種類、核酸試料の種類や量、用いる酵素の種類等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、プライマー伸長反応を行う場合には、次のような手順で行うことができる。まず、核酸試料に、本発明の標的塩基特異性プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、バッファー、必要に応じて塩類等を加え、反応溶液を調製する。この反応溶液を、核酸試料中の二本鎖核酸を変性させるために高温状態に置いた後、本発明の標的塩基特異性プライマーと該二本鎖核酸が結合できるように温度を下げる。その後、DNAポリメラーゼが伸長反応を行うことが可能な温度条件に設定する。これにより、核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、該標的塩基特異性プライマーからプライマー伸長反応は効率よく行われる。逆に、核酸試料中の二本鎖核酸が、該標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と非相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、該標的塩基特異性プライマーからのプライマー伸長反応効率は著しく悪くなる。したがって、このプライマー伸長反応の最中、あるいは反応後に、プライマー伸長反応効率を調べることにより、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確な標的塩基の塩基種判別が可能となる。
プライマー伸長反応効率の測定方法は、特に限定されるものではなく、通常用いられている方法で測定することができる。例えば、プライマー伸長反応の結果放出されるピロリン酸量を測定することにより、プライマー伸長反応効率を測定することができる。ピロリン酸量の測定方法は、特に限定されるものではなく、例えばNucleic Acids Researchの第9巻第19号e93(2001年)や、国際公開2003/078655号パンフレット、特開2004−141158号公報等で提案されている方法等、通常行われている測定方法を用いて行うことができる。その他、標的塩基特異性プライマーの5’ 末端側を水晶振動子上に固定した状態で、上記プライマー伸長反応を行い、その振動数変化を解析してプライマー伸長反応をモニタリングすることで、プライマー伸長反応効率を調べてもよく、標的塩基特異性プライマーの5’ 末端側を金表面に固定した状態で、上記プライマー伸長反応を行い、その表面プラズモン共鳴(SPR)現象を解析してプライマー伸長反応をモニタリングすることで、プライマー伸長反応効率を調べてもよい。
また、プライマー伸長反応を行う具体的手順は上記の手順に限られることはない。例えば、上記の手順のように、予め必要な試薬類を全て反応液中に混合した上でプライマー伸長反応を行ってもよく、核酸試料に、本発明の標的塩基特異性プライマー、バッファー、必要に応じて塩類等を加えた溶液をまず用意し、高温による変性工程および標的塩基特異性プライマーによる二本鎖核酸への結合を行った後、ポリメラーゼとヌクレオチドを順次加えることで反応を行わせるいわゆるホットスタート法で行ってもよい。また、核酸試料中の核酸が一本鎖核酸である場合、二本鎖核酸の場合と異なり、核酸を変性させるという意味での高温条件下におく工程は必要ないが、一本鎖核酸と標的塩基特異性プライマーの結合反応を制御する意味において、これら両者がまず十分解離した状態を調整する必要があるので、高温条件下におく工程が、標的塩基特異性プライマーと核酸試料中の核酸との結合工程の前にあることがより好ましい。
また、プライマー伸長反応において用いられるポリメラーゼは、特に限定されるものではなく、遺伝子解析等の分野で通常用いられているポリメラーゼを用いることができる。例えば、DNAポリメラーゼであってもよく、RNAポリメラーゼであってもよい。また、耐熱性ポリメラーゼであってもよく、非耐熱性ポリメラーゼであってもよい。さらに、3’→5’exonuclease活性を有するものであってもよく、有さないものであってもよい。その他、鎖交換活性を有するものであってもよい。
本発明の標的塩基判別方法においては、特に3’→5’exonuclease活性が弱いポリメラーゼ、又は該活性を有さないポリメラーゼを用いることが好ましい。本発明においては、3’→5’exonuclease活性のないポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行うと、核酸試料中の核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、非常に効率よく反応が進むのに対し、核酸試料中の核酸が、該標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と非相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、プライマー伸長反応はほとんど進まない。したがって、3’→5’exonuclease活性が弱い又は有さないポリメラーゼを用いることにより、擬陽性の可能性を顕著に低くすることができるためである。但し、本発明の標的塩基判別方法においては、3’→5’exonuclease活性がないポリメラーゼを用いることを必ずしも要求するものではなく、例えば、3’→5’exonuclease活性を有する超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1由来のKOD DNAポリメラーゼを用いた場合であっても、高精度に標的塩基の塩基種を判別することができる。
本発明の標的塩基判別方法においては、プライマー伸長反応として、標的核酸を鋳型とし、本発明の標的塩基特異性プライマーを用いたPCRを行うことが特に好ましい。具体的には、核酸試料に、本発明の標的塩基特異性プライマー、この標的塩基特異性プライマーとフォワードプライマー/リバースプライマーの関係になる第2のプライマー、PCR用DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、マグネシウムイオン、バッファー、必要に応じて塩類等を加え、反応溶液を調製し、該反応溶液を、常法により、変性工程、アニール工程、伸長工程からなるサイクルを1〜40サイクル繰り返すことにより、PCRを行うことができる。核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、標的核酸中の本発明の標的塩基特異性プライマーと該第2のプライマーとで挟まれた領域の核酸が、効率よく増幅される。逆に、核酸試料中の二本鎖核酸が、該標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と非相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、該領域の核酸はほとんど増幅されない。したがって、PCRの最中、あるいは後に、増幅産物である該領域の核酸量を調べることにより、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確な標的塩基の塩基種判別が可能となる。
増幅産物量の測定方法は、特に限定されるものではなく、PCR産物量の測定等に通常用いられている方法で測定することができる。例えば、前述のように、PCRの結果放出されるピロリン酸量を測定してもよく、電気泳動法を用いて測定してもよい。また、蛍光インターカレーターを用いて蛍光強度を測定する方法によっても測定することができる。
その他、予め適当な蛍光物質を用いて標識された標的塩基特異性プライマーを用いてPCRを行うことにより、一分子蛍光検出法を用いて、得られた核酸増幅産物を検出し、その量や分子量等を解析することができる。一分子蛍光検出法では、分子の拡散速度の変化をもとに、得られた核酸増幅産物を解析する。より詳しくは、核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、該標的塩基特異性プライマーと前述の第2のプライマーとで挟まれた領域の核酸が効率よく増幅されるため、蛍光標識された標的塩基特異性プライマーの分子量が大幅に増加することになる。溶液中の物質の拡散速度は、物質の分子量に依存しているため、蛍光標識された標的塩基特異性プライマーの拡散速度が著しく低下する。一方、核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と非相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、該標的塩基特異性プライマーと前述の第2のプライマーとで挟まれた領域の核酸はほとんど増幅されないため、蛍光標識された標的塩基特異性プライマーの分子量は変化せず、したがって、拡散速度はほとんど変化しない。つまり、一分子蛍光検出法により、PCRの結果得られた核酸増幅産物の拡散速度を測定することにより、標的塩基特異性プライマーの伸長の有無を調べることができ、この結果に基づいて標的塩基の塩基種を判別することができる。一分子蛍光検出法による解析方法は、特に限定されるものではなく、例えばNature Geneticsの第38巻第324〜330ページ(2006年)に記載の方法等、通常行われている解析方法を用いて行うことができる。なお、一分子蛍光検出法による解析方法は、一分子当たり十分な分子量の差が生じればよく、核酸増幅産物が非常に微量であっても解析可能であるため、例えば、前述の第2のプライマーを用いずに、標識された標的塩基特異性プライマーのみを用いて伸長反応を行った場合であっても、標的塩基の塩基種を判別することができる。また、異なる蛍光物質を用いて標識した複数種類の標的塩基特異性プライマーを、同一溶液内に添加し、常法に基づき、マルチプレックスPCR検出を行うこともできる。
また、PCR等の核酸増幅反応により得られた核酸増幅産物は、微小ビーズの凝集に基づいて検出することもできる。微小ビーズの凝集に基づく検出方法では、第一のリガンドを用いて修飾された本発明の標的塩基特異性プライマーと、該第一のリガンドとは異なる種類の第二のリガンドを用いて修飾された前述の第2のプライマーとを用いて、核酸試料中の核酸を鋳型とし、常法によりPCRを行った後、得られた増幅産物を、該第一のリガンドに特異的に結合するレセプターを結合した第一の微小ビーズと、該第二のリガンドに特異的に結合するレセプターを結合した第二の微小ビーズとを用いて検出する。核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、両末端が、それぞれ第一のリガンドと第二のリガンドにより修飾された増幅産物が得られるため、該増幅産物に第一の微小ビーズと第二の微小ビーズとを混合すると、これらの微小ビーズがこの増幅産物によって架橋された構造となり、この反応が多数生じることにより、微小ビーズは凝集する。一方で、核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と非相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、両末端が修飾された増幅産物は得られないため、第一の微小ビーズと第二の微小ビーズとを混合しても、これらの微小ビーズは凝集しない。プライマー単独でもリガンド−レセプター反応は生じるが、架橋が生じることはなく、異なるリガンドで両末端が修飾された増幅産物が存在しなければ凝集が生じることはないためである。したがって、微小ビーズの凝集の有無を検出することにより、標的塩基の塩基種を判別することができる。微小ビーズの凝集に基づく検出方法は、特に限定されるものではなく、例えば特開2005−95134号公報に記載の方法等、通常行われている解析方法を用いて行うことができる。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[鋳型DNA作成用プライマーの準備]
鋳型DNAはpUC19 DNA(TaKaRa Bio社製)を基本として、GeneTailor Site−Directed Mutagenesis System(Invitrogen社製)によって変異を導入した。変異導入に用いたプライマーは変異を含むフォワードプライマーと通常のリバースプライマーからなる。リバースプライマーは全てのフォワードプライマーに共通のMi−Rを用いた。また、フォワードプライマーはミスマッチに対して3’側からの影響を調べるためのMi−F−uXX(XXは塩基2種の組み合わせ)シリーズと、5’側からの影響を調べるためのMi−F−dXX(XXは塩基2種の組み合わせ)シリーズの2群に大きく分けられ、それぞれのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせによって、それぞれ異なる変異が導入されたpUC19 DNAを作成した。これらのプライマーの詳細を表1に示す。表の配列中の下線部の塩基が変異箇所である。例えば、Mi−F−uAAとMi−Rを用いた変異導入PCRにより、標的塩基がAであり、ミスマッチ塩基がAである変異体が得られた。
Figure 2009247231
[メチレーション]
GeneTailor Site−Directed Mutagenesis System(Invitrogen社製)の手順に従って、別途購入したpUC19 DNA(TaKaRa Bio社製)をメチル化した。具体的には、1.6μLの10×メチレーションバッファーに、100ngのpUC19 DNA、1.6μLの10×SAM、1.0μLのDNAメチラーゼ(4U/μL)、適量の滅菌水をそれぞれ添加し、16μLの反応溶液を調製した後、37℃で1時間インキュベートした。
[変異導入PCR]
前述した変異導入用プライマーをそれぞれ用いて、同じく前述したメチル化されたpUC19 DNAに対して、変異導入PCRを行う。基本的にはGeneTailor Site−Directed Mutagenesis System(Invitrogen社製)を用いて行った。具体的には、5μLの10×High Fidelity PCRバッファーに、1.5μLの10mMのdNTP、1μLの50mMの硫酸マグネシウム、1.5μLの10μMのフォワードプライマー、1.5μLの10μMのリバースプライマー、12.5ngのメチル化されたDNA、0.2μLのPlatinum Taq High Fidelity(5U/μL)、適量の滅菌水をそれぞれ添加し、50μLの反応溶液を調製した。その後、該反応溶液を、94℃で2分間処理した後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で3分間の熱サイクルを24サイクル行い、さらに68℃で10分間処理することにより、変異導入PCRを行った。なお、PCR装置は、旧MJ Research社(現Bio Rad Laboratories社)のGradient Thermal Cycler PTC−200を用いて行った。
[トランスフォーメーション]
前述の変異導入PCRにより得られた変異導入体を導入した。基本的にはGeneTailor Site−Directed Mutagenesis System(Invitrogen社製)の手順に従って行った。コンピテントセルは、同じく該システムのキットに貼付されているOne−Shot(登録商標)Max Efficiency DH5α(登録商標)−T1Rコンピテントセルを用いた。また、LB agarとしては、LB培地に予めアンピシリンが含まれている、FastMedia(登録商標)AMP X−GAL(CAYLA社)を用いた。具体的には、氷上で融解したDH5α−T1Rコンピテントセルに、2μLの前述の変異導入PCR後の反応溶液を直接添加して、タッピングした後、氷上で10分間インキュベートした。その後、42℃で30秒間、ウォーターバス上でインキュベートし、速やかに氷上で1分間放置したものに、200μLのSOC培地を添加した。なお、SOC培地は、予め室温まで戻しておいた。さらに、37℃で1時間、125rpmで振とうさせながらインキュベートした。このコンピテントセル含有益を、予め37℃で30分間インキュベートしたLB agarに播き、37℃で16時間インキュベートし、コロニーを得た。
[大腸菌含有溶液の調製]
以下に続くPCR用の鋳型として用いるために、大腸菌含有溶液を調製し、吸光度を測定後に再度濃度調整を行った。すなわち、大腸菌より抽出精製されたプラスミドを鋳型として用いるのではなく、大腸菌そのものの希釈溶液を鋳型を含む核酸溶液として用いた。前述のトランスフォーメーションにより得られたコロニーのうち、任意に10個のコロニーを選択して、100μLの滅菌MilliQ水に希釈した。十分に希釈した後、NanoDrop(登録商標)ND−1000 Spectrophotometer(NanoDrop社製)を用いて601nm、280nmの吸光度を測定した。601nmと280nmの吸光度の間には相関があり、280nmの吸光度が0.01になるように希釈して濃度調整を行った。以後、得られた調製液を、鋳型を含む核酸試料溶液として用いた。
[プライマーの準備]
標的塩基を判別するためのプライマーをフォワードプライマーとし、3’末端から第2塩基目に標的塩基対応塩基、第3塩基目にミスマッチ塩基を、それぞれ配置した。具体的には、フォワードプライマーは、前述のpUC19変異導入鋳型のMi−F−uXXに対応するasP−F−uXX(XXは塩基2種の組み合わせ)シリーズと、Mi−F−dXXに対応するasP−F−dXX(XXは塩基2種の組み合わせ)シリーズの2群に大きく分けられる。また、リバースプライマーは全てのフォワードプライマーに共通のasP−Rを用いた。それぞれのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせによって、PCR増幅を行った。これらのプライマーの詳細を表2に示す。表の配列中の下線部の2塩基のうち、3’側の塩基が標的塩基対応塩基、5’側の塩基がミスマッチ塩基である。
Figure 2009247231
[各プライマーの特異性の評価1]
アニーリング温度の上昇にしたがって、産物量は減少するが、その減少率の多少をもって特異性や増幅効率を評価することができる。そこで、アニーリング温度を54℃、58℃の2条件でPCRを行い、58℃での増幅産物量と54℃での増幅産物量の比(p(58℃)/p(54℃))を増幅産物量の変動率とし、該変動率に基づき、標的塩基がAである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。
具体的には、3μLの10×PCRバッファーに、3μLの2mMのdNTP、1.2μLの25mMの硫酸マグネシウム、0.2μLの45μMのフォワードプライマー、0.2μLの45μMのリバースプライマー、5μLの核酸試料溶液、0.6μLのKOD Plus(1.0U/μL)、適量の滅菌水をそれぞれ添加し、30μLの反応溶液を調製した。その後、該反応溶液を、94℃で2分間処理した後、94℃で30秒間、54℃又は58℃で30秒間、68℃で30秒間の熱サイクルを35サイクル行い、さらに68℃で2分間処理することにより、特異性評価PCRを行った。なお、PCR装置は、旧MJ Research社(現Bio Rad Laboratories社)のGradient Thermal Cycler PTC−200を用いて行った。
各PCRにおいて用いた核酸試料溶液及びフォワードプライマーは、表3に記載した。表3中、「(変異導入プライマー対)」とは、鋳型として用いた核酸試料溶液を得るために行った変異導入PCRにおいて用いたプライマー対を示している。また、「特異性評価用プライマー対」とは、特異性評価PCRにおいて用いたプライマー対を示している。
Figure 2009247231
PCR後の反応溶液中の核酸増幅産物の量を、電気泳動法により測定した。具体的には、電気泳動測定用キットとしてDNA 1000 LabChip Kit(Agilent社製)を、電気泳動用装置として2100 Bioanalyzer(Agilent社製)を、それぞれ用いて測定した。核酸増幅産物の定量結果は、同装置上に自動的に表示される。
得られた核酸増幅産物の定量結果から算出された58℃での増幅産物量(ng/μL)と54℃での増幅産物量(ng/μL)の比(p(58℃)/p(54℃))を表3に示す。表中*が付されたプライマーは、ミスマッチ塩基のない標的核酸と完全に相補的なプライマーであり、リファレンスとして用いている。すなわち、p(58℃)/p(54℃)が、標的核酸と完全に相補的なプライマーの値以下である場合(表中♯が付されたプライマー)には、ミスマッチ導入により、標的塩基の識別能が保存されている又は向上されたと判断することができる。
表3の結果から、標的塩基がAであり、ミスマッチ対応塩基がTである場合には、ミスマッチ塩基としてT又はGを導入したプライマーを用いることにより、ミスマッチ塩基としてCを導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
同様に、標的塩基がAであり、ミスマッチ対応塩基がGである場合には、ミスマッチ塩基としてTを導入したプライマーを用いることにより、ミスマッチ塩基としてA又はGを導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
[各プライマーの特異性の評価2]
表4記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価1と同様にして、標的塩基がTである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表4中の「(変異導入プライマー対)」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表3と同様である。
表4の結果から、標的塩基がTであり、ミスマッチ対応塩基がTである場合には、ミスマッチ塩基としてT又はGを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がTであり、ミスマッチ対応塩基がGである場合には、ミスマッチ塩基としてTを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がTであり、ミスマッチ対応塩基がCである場合には、ミスマッチ塩基としてAを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
Figure 2009247231
[各プライマーの特異性の評価3]
表5記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価1と同様にして、標的塩基がGである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表5中の「(変異導入プライマー対)」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表3と同様である。
表5の結果から、標的塩基がGであり、ミスマッチ対応塩基がAである場合には、ミスマッチ塩基としてA又はCを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がGであり、ミスマッチ対応塩基がTである場合には、ミスマッチ塩基としてT又はGを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がGであり、ミスマッチ対応塩基がGである場合には、ミスマッチ塩基としてTを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がGであり、ミスマッチ対応塩基がCである場合には、ミスマッチ塩基としてT又はCを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
Figure 2009247231
[各プライマーの特異性の評価4]
表6記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価1と同様にして、標的塩基がCである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表6中の「(変異導入プライマー対)」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表3と同様である。
表6の結果から、標的塩基がCであり、ミスマッチ対応塩基がAである場合には、ミスマッチ塩基としてCを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がCであり、ミスマッチ対応塩基がTである場合には、ミスマッチ塩基としてT又はGを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がCであり、ミスマッチ対応塩基がGである場合には、ミスマッチ塩基としてAを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がCであり、ミスマッチ対応塩基がCである場合には、ミスマッチ塩基としてCを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
Figure 2009247231
[各プライマーの特異性の評価5]
表7記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価1と同様にして、アンカー塩基がAである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表7中の「(変異導入プライマー対)」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表3と同様である。
表7の結果から、アンカー塩基がAであり、ミスマッチ対応塩基がAである場合には、ミスマッチ塩基としてCを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がAであり、ミスマッチ対応塩基がTである場合には、ミスマッチ塩基としてG又はCを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がAであり、ミスマッチ対応塩基がCである場合には、ミスマッチ塩基としてTを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
Figure 2009247231
[各プライマーの特異性の評価6]
表8記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価1と同様にして、アンカー塩基がTである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表8中の「(変異導入プライマー対)」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表3と同様である。
表8の結果から、アンカー塩基がTであり、ミスマッチ対応塩基がAである場合には、ミスマッチ塩基としてCを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がTであり、ミスマッチ対応塩基がTである場合には、ミスマッチ塩基としてG又はCを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がTであり、ミスマッチ対応塩基がCである場合には、ミスマッチ塩基としてTを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
Figure 2009247231
[各プライマーの特異性の評価7]
表9記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価1と同様にして、アンカー塩基がGである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表9中の「(変異導入プライマー対)」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表3と同様である。
表9の結果から、アンカー塩基がGであり、ミスマッチ対応塩基がAである場合には、ミスマッチ塩基としてG又はCを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がGであり、ミスマッチ対応塩基がTである場合には、ミスマッチ塩基としてG又はCを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がGであり、ミスマッチ対応塩基がCである場合には、ミスマッチ塩基としてA又はTを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
Figure 2009247231
[各プライマーの特異性の評価8]
表10記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価1と同様にして、アンカー塩基がCである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表10中の「(変異導入プライマー対)」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表3と同様である。
表10の結果から、アンカー塩基がCであり、ミスマッチ対応塩基がAである場合には、ミスマッチ塩基としてA、G、又はCを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がCであり、ミスマッチ対応塩基がTである場合には、ミスマッチ塩基としてCを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がCであり、ミスマッチ対応塩基がGである場合には、ミスマッチ塩基としてA、T、又はGを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がCであり、ミスマッチ対応塩基がCである場合には、ミスマッチ塩基としてA又はTを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
Figure 2009247231
[標的塩基特異性プライマーを用いたSNP検出]
ヒトのビタミンKエポキシド還元酵素複合体(vitamin K epoxide reductase complex:VKORC)のサブユニット1(VKORC1)遺伝子の、開始コドン(ATG)のAを1位としたときの1173位の塩基における一塩基多型VKORC1(1173C>T)(SNP ID:rs9934438)を、本発明の標的塩基特異性プライマーを用いて検出した。なお、各プライマーは、シグマアルドリッチジャパン株式会社ライフサイエンス事業部に依頼して合成されたものを使用した。
<ヒトゲノム検体の遺伝子型の確認>
VKORC1(1173C>T)の検出に用いるため、表11に示すヒトゲノム検体を、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団が提供しているヒューマンサイエンス研究資源バンクより非連結匿名化された状態で入手した。これらのヒトゲノム検体の塩基配列を、シークエンサーを用いて読み取り、遺伝子型を確認した。確認した遺伝子型を表11に示した。
Figure 2009247231
<プライマーの設計>
標的塩基をVKORC1の1173位の塩基とし、予想される塩基種をC(1173C)又はT(1173T)として、プライマーの設計を行った。設計したプライマーは、本発明の標的塩基特異性プライマーである、1173Cを特異的に検出し得るプライマーと1173Tを特異的に検出し得るプライマー、本発明のプライマーではない1173Cを特異的に検出し得るプライマー、及びこれらのプライマーをフォワードプライマーとし、VKORC1(1173C>T)近隣のVKORC1遺伝子を鋳型としてPCRを行うためのリバースプライマーであるVKORC1―Rプライマーを設計した。なお、図2は、VKORC1(1173C>T)近隣のVKORC1遺伝子の塩基配列を示した図である。枠で囲まれた塩基Cが検出対象である1173位の塩基である。
まず、1173Cを特異的に検出するプライマーを設計した。VKORC1遺伝子の塩基配列より明らかであるように、ミスマッチ対応塩基はCであり、アンカー塩基はTである。このため、本発明の第一の態様のプライマーでは、前記(1m)より、ミスマッチ塩基はCとなるが、本発明の第二の態様のプライマーでは、前記(2f)より、ミスマッチ塩基はTとなり、両者の塩基種は異なる。本実施例では、本発明の第二の態様のプライマーとし、ミスマッチ塩基をTとして、VKORC1―C(T)プライマーを設計した。
次に、1173Tを特異的に検出するプライマーを設計した。この場合、本発明の第一の態様のプライマーでは、前記(1e)より、ミスマッチ塩基はAとなるが、本発明の第二の態様のプライマーでは、前記(2f)より、ミスマッチ塩基はTとなり、両者の塩基種は異なる。本実施例では、本発明の第二の態様のプライマーとし、ミスマッチ塩基をTとして、VKORC1―T(T)プライマーを設計した。
また、本発明のプライマーではない1173Cを特異的に検出し得るプライマーとして、ミスマッチ塩基をAとした以外はVKORC1―C(T)プライマーと同じ塩基配列を有するVKORC1―C(A)プライマーを設計した。
さらに、これらの3種のプライマーをフォワードプライマーとした場合にリバースプライマーとして機能し得るVKORC1―Rプライマーを設計した。
作成した4種のプライマーの塩基配列を表12に示す。
Figure 2009247231
<プライマーの修飾>
まず、表12記載の塩基配列を有するVKORC1―C(T)プライマーと、VKORC1―T(T)プライマーを、それぞれリガンドで修飾することにより、5’末端にジゴキシゲニン(digoxigenin:DIG)を結合させた5’DIG化VKORC1―C(T)プライマーと、5’末端にDNP(dinitorophenol)を結合させた5’DNP化VKORC1―T(T)プライマーを作製した。
次に、表12記載の塩基配列を有するVKORC1―Rプライマーを、リガンドで修飾することにより、5’末端にFITC(フルオレセインイソチオシアナート)を結合させた5’FITC化VKORC1―Rプライマーを作製した。
<受容体結合分散性微粒子の調製>
DIGと特異的に結合するヤギ抗DIG抗体(GeneTex,Inc.社製)を結合させた分散性微粒子(以下、抗DIG分散性微粒子)、FITCと特異的に結合するヤギ抗FITC抗体(BETHYL Laboratories,Inc.社製)を結合させた分散性微粒子(以下、抗FITC分散性微粒子)、及びDNPと特異的に結合するヤギ抗DNP抗体(BETHYL Laboratories,Inc.社製)を結合させた分散性微粒子(以下、抗DNP分散性微粒子)を調製した。
各受容体結合分散性微粒子は、具体的には、以下のようにして調製した。まず、1mLのMES(Wako社製)緩衝液(500mM、pH6.1)に、水を加えて9mLに調製した溶液を50mL容チューブに入れ、1mLの10%CM−MP(300nmカルボキシタイプラテックス粒子、Ceradyn社製)スラリーを加えた後、8mLの1mg/mLの各抗体リン酸緩衝溶液を加えた。該50mL容チューブを、ボルテックスミキサー(VORTEXGENIE2、Scientific Industries社製)の中間回転強度にて5秒間混合した後、さらに1mLの1.152g/LのEDAC(MW=191.7、Sigma社製)MES緩衝液(50mM、pH6.1)を加え、直ちにボルテックスミキサーの中間回転強度にて5秒間混合した。その後、該50mL容チューブを、ローテーター(MTR−103、アズワン社製)にセットし、室温で1時間混合したものを、4℃、15,000xgで5分間遠心し、遠心分離したCM−MPが上清側に舞い上がることを防止するために、最低減速条件で遠心を停止させた。上清を除去した後、10mLのMES緩衝液(50mM、pH6.1)を加え、室温で、ソニケーター(VC−130、Sonics社製)の30amplitudeの強度で3〜4秒間超音波処理を行うことにより、CM−MPの塊を分散させた。再度同様に、該50mL容チューブを遠心後、10mLのMES緩衝液を加え、CM−MPの塊を分散させた。その後、4℃で16時間静置後、目視にて沈渣が無いことを確認した。このようにして得たMES緩衝液中に分散したCM−MPを、1%の受容体結合分散性微粒子スラリーとした。
<VKORC1(1173C>T)の検出1>
5’DIG化VKORC1―C(T)プライマー、5’DNP化VKORC1―T(T)プライマー、及び5’FITC化VKORC1―Rプライマーを用いて、3種類のヒトゲノム検体(PSCDA0206、0182、0009)のVKORC1(1173C>T)を検出した。
まず、29.7μLのmilliQ水に、6μLの10×Buffer(東洋紡社製)、6μLのdNTP(2mM)、2.4μLの硫酸マグネシウム(25mM)、10μLのヒトゲノム検体(20ng/μL)、1.7μLの5’DIG化VKORC1―C(T)プライマー、1.8μLの5’DNP化VKORC1―T(T)プライマー、1.2μLの5’FITC化VKORC1―Rプライマー、及び1.2μLのKODplus(東洋紡社製)を加え、反応溶液を調製した。該反応溶液を、94℃で5分間の変性工程、次に94℃で30秒間、64℃で30秒間、68℃で30秒間を35サイクルの増幅工程、68℃で2分間の伸長工程、からなる反応条件によりPCRを行った。ヒトゲノム検体に代えて、等量のmilliQ水を用いたものを、ネガティブコントロールとした。
その後、受容体結合分散性微粒子を用いた免疫比濁法により、PCR増幅の有無を調べた。まず、各PCR済反応溶液中の、5’DIG化VKORC1―C(T)プライマーによるPCR増幅の有無を調べた。各2μLのPCR済反応溶液に、それぞれ1μLの1%抗DIG分散性微粒子スラリーと、1μLの1%抗FITC分散性微粒子スラリーを加え、ボルテックスミキサーを用いて混合した後、室温で5分間放置した。分光高度計(SPECTRA max PLUS384、Molecular Device社製)を用いて、該PCR済反応溶液の分散性微粒子添加前と凝集塊生成後の、それぞれの800nmの吸光度(A800)を測定し、分散性微粒子の添加による該PCR済反応溶液のA800の変化を測定した。
次に、各PCR済反応溶液中の、5’DNP化VKORC1―T(T)プライマーによるPCR増幅の有無を調べるため、各2μLの該PCR済反応溶液に、それぞれ1μLの1%抗DNP分散性微粒子スラリーと、1μLの1%抗FITC分散性微粒子スラリーを加え、同様にして、分散性微粒子の添加による該PCR済反応溶液のA800の変化を測定した。
図3は、VKORC1(1173C>T)の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗DIG分散性微粒子と抗FITC分散性微粒子を加えた時の各PCR済反応溶液のA800の変化とし、横軸を抗DNP分散性微粒子と抗FITC分散性微粒子を加えた時の各PCR済反応溶液のA800の変化とした。●はPSCDA0182の結果を、○はPSCDA0206の結果を、▲はPSCDA0009の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。
3種全てのヒトゲノム検体において、抗DNP分散性微粒子を加えた場合にA800が大きくなった。一方、抗DIG分散性微粒子を加えた場合には、PSCDA0182ではA800が大きくなっていたが、他の2種のヒトゲノム検体ではA800はあまり変化しなかった。さらに、ネガティブコントロールでは、いずれの場合でもA800の変化はほとんど観察されなかった。すなわち、5’DNP化VKORC1―T(T)プライマーによるPCR増幅は、3種全てのヒトゲノム検体においてなされたが、5’DIG化VKORC1―C(T)プライマーによるPCR増幅は、PSCDA0182においてのみなされたことが分かった。つまり、PSCDA0182はVKORC1(1173C/T)、PSCDA0206及び0009はVKORC1(1173T/T)であるという結果が得られた。該結果は、シークエンス解析による多型判定の結果と一致しており、本発明の標的塩基特異性プライマーであるVKORC1―C(T)プライマー、VKORC1―T(T)プライマーを用いることにより、VKORC1(1173C>T)を検出できることが明らかである。
<VKORC1(1173C>T)の検出2>
フォワードプライマーとして表12記載の塩基配列を有するVKORC1―C(T)プライマー又はVKORC1―C(A)プライマーを、リバースプライマーとしてVKORC1―Rプライマーを、鋳型として2種類のヒトゲノム検体(PSCDA0210及び0532)を、それぞれ用いてPCRを行った。
具体的には、まず、31μLのmilliQ水に、6μLの5×Buffer(東洋紡績社製)、5μLのdNTP(2mM)、2μLの硫酸マグネシウム(25mM)、1μLのヒトゲノム検体(20ng/μL)、2.5μLのフォワードプライマー、2.5μLのリバースプライマー、及び1μLのKOD plus(東洋紡績社製)を加え、反応溶液を調製した。該反応溶液を、<VKORC1(1173C>T)の検出1>と同じ反応条件でPCRを行った。アガロース電気泳動により、得られたPCR産物を分離した後、Agilent2100 BIOANALYZER(DNA1000kit、Agilent Technology社製)を用いてバンドパターンを確認した。
得られたバンドパターンを図4に示す。(a)はVKORC1―C(T)プライマーとPSCDA0210を用いて得たPCR産物のバンドパターンであり、(b)はVKORC1―C(T)プライマーとPSCDA0532を用いて得たPCR産物のバンドパターンであり、(c)はVKORC1―C(A)プライマーとPSCDA0210を用いて得たPCR産物のバンドパターンであり、(d)はVKORC1―C(A)プライマーとPSCDA0532を用いて得たPCR産物のバンドパターンである。矢印アがPCR産物のバンドであり、矢印イとウはマーカーのバンドである。(a)、(c)、及び(d)において、PCR産物のバンドが検出された。
シークエンス解析の結果から、PSCDA0210はVKORC1(1173C/T)であり、PSCDA0532はVKORC1(1173T/T)であった。実際に、VKORC1―C(T)プライマーにより、PSCDA0210ではPCR産物が検出されたが、PSCDA0532では検出されなかった。一方、VKORC1―C(A)プライマーにより、PSCDA0210とPSCDA0532の両方でPCR産物が検出された。つまり、VKORC1―C(A)プライマーでは、ミス伸長による非特異的なPCR増幅が起こっていた。
この結果から、プライマーのミスマッチ塩基の塩基種を、前記(1a)〜(1m)や前記(2a)〜(2m)により選択する、本発明の標的塩基特異性プライマーは、非常に特異性に優れていることが明らかである。
本発明の標的塩基特異性プライマーを用いることにより、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確に標的塩基の塩基種を判別することが可能であるため、SNP解析等の、一塩基の相違を高精度に判別することが要求されるような遺伝子解析医療機関等における遺伝子解析等の分野において利用が可能である。
本発明の第一又は第二の態様である標的塩基特異性プライマーと、標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図である。図1(a)は、標的塩基特異性プライマーと、標的塩基の塩基種が、該標的塩基特異性プライマーが特異的に識別する塩基である標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図であり、図1(b)は、標的塩基特異性プライマーと、標的塩基の塩基種が、該標的塩基特異性プライマーが特異的に識別する塩基以外の塩基である標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図である。 VKORC1(1173C>T)近隣のVKORC1遺伝子の塩基配列を示した図である。枠で囲まれた塩基Cが検出対象である1173位の塩基である。 <VKORC1(1173C>T)の検出1>において、VKORC1(1173C>T)の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗DIG分散性微粒子と抗FITC分散性微粒子を加えた時の各PCR済反応溶液のA800の変化とし、横軸を抗DNP分散性微粒子と抗FITC分散性微粒子を加えた時の各PCR済反応溶液のA800の変化とした。●はPSCDA0182の結果を、○はPSCDA0206の結果を、▲はPSCDA0009の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。 <VKORC1(1173C>T)の検出2>において、得られたバンドパターンを示した図である。(a)はVKORC1―C(T)プライマーとPSCDA0210を用いて得たPCR産物のバンドパターンであり、(b)はVKORC1―C(T)プライマーとPSCDA0532を用いて得たPCR産物のバンドパターンであり、(c)はVKORC1―C(A)プライマーとPSCDA0210を用いて得たPCR産物のバンドパターンであり、(d)はVKORC1―C(A)プライマーとPSCDA0532を用いて得たPCR産物のバンドパターンである。矢印アがPCR産物のバンドであり、矢印イとウはマーカーのバンドである。
符号の説明
1…標的塩基特異性プライマー、2…標的核酸。

Claims (14)

  1. 標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、
    前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、
    前記標的塩基対応塩基の5’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、かつ、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の3’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記(1a)〜(1m)からなる群より選択される1であることを特徴とする標的塩基特異性プライマー。
    (1a)前記標的塩基として予想される塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
    (1b)前記標的塩基として予想される塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
    (1c)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
    (1d)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
    (1e)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がAである。
    (1f)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がA又はCである。
    (1g)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
    (1h)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
    (1i)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はCである。
    (1j)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
    (1k)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
    (1l)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がAである。
    (1m)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
  2. 標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、
    前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、
    前記標的塩基対応塩基の5’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、前記ミスマッチ対応塩基の3’側に隣接する塩基をアンカー塩基とし、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の3’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記(2a)〜(2m)からなる群より選択される1であることを特徴とする標的塩基特異性プライマー。
    (2a)前記アンカー塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
    (2b)前記アンカー塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
    (2c)前記アンカー塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
    (2d)前記アンカー塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
    (2e)前記アンカー塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
    (2f)前記アンカー塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
    (2g)前記アンカー塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
    (2h)前記アンカー塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がG又はCである。
    (2i)前記アンカー塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がA又はTである。
    (2j)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がA、G、又はCである。
    (2k)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
    (2l)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がA、T、又はGである。
    (2m)前記アンカー塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がA又はTである。
  3. さらに、前記ミスマッチ塩基の塩基種が、下記(1a)〜(1m)からなる群より選択される1であることを特徴とする請求項2記載の標的塩基特異性プライマー。
    (1a)前記標的塩基として予想される塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
    (1b)前記標的塩基として予想される塩基がAであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
    (1c)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
    (1d)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
    (1e)前記標的塩基として予想される塩基がTであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がAである。
    (1f)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がA又はCである。
    (1g)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
    (1h)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がTである。
    (1i)前記標的塩基として予想される塩基がGであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はCである。
    (1j)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がAである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
    (1k)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がTである場合に、前記ミスマッチ塩基がT又はGである。
    (1l)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がGである場合に、前記ミスマッチ塩基がAである。
    (1m)前記標的塩基として予想される塩基がCであり、前記ミスマッチ対応塩基がCである場合に、前記ミスマッチ塩基がCである。
  4. 前記ミスマッチ塩基が1塩基であり、
    前記(1a)〜(1m)からなる群より選択される1と、前記(2a)〜(2m)からなる群より選択される1とにおいて、ミスマッチ塩基の塩基種が異なる場合に、前記ミスマッチ塩基が、前記(2a)〜(2m)からなる群より選択される1の塩基種であることを特徴とする請求項3記載の標的塩基特異性プライマー。
  5. 前記ミスマッチ塩基及び前記ミスマッチ対応塩基が1又は2塩基であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の標的塩基特異性プライマー。
  6. 前記ミスマッチ塩基が、3’末端から4塩基以内に配置されていることを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の標的塩基特異性プライマー。
  7. 標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別する方法であって、
    (I)前記核酸試料中の核酸と、請求項1〜6のいずれか記載の標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う工程と、
    (II)前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種を、前記工程(I)における核酸伸長効率に基づき判別する工程と、
    を有することを特徴とする標的塩基判別方法。
  8. 前記工程(II)が、
    (II−1)前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程(I)における核酸伸長効率が高い場合には前記予想される塩基であり、前記工程(I)における核酸伸長効率が低い場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程、
    であることを特徴とする請求項7記載の標的塩基判別方法。
  9. 前記工程(I)の後前記工程(II)の前に、
    (III)標的塩基の塩基種が、前記予想される塩基とは異なる種類の塩基である標的塩基配列を有する核酸と、前記標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う核酸伸長工程と、
    を有し、前記工程(II)が、
    (II−2)前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が前記工程(III)において得られた伸長産物の量よりも多い場合には前記予想される塩基であり、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が前記工程(III)において得られた伸長産物の量以下である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程、
    であることを特徴とする請求項7記載の標的塩基判別方法。
  10. 前記工程(II−2)が、
    (II−3)前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が前記工程(III)において得られた伸長産物の量の3倍以上である場合には前記予想される塩基であり、前記工程(I)において得られた伸長産物の量が前記工程(III)において得られた伸長産物の量の3倍未満である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程、
    であることを特徴とする請求項9記載の標的塩基判別方法。
  11. 前記核酸伸長反応が、プライマー伸長反応であることを特徴とする請求項7〜10のいずれか記載の標的塩基判別方法。
  12. 前記プライマー伸長反応が、PCR(Polymerase Chain Reaction)法、LAMP(Loop−Mediated Isothermal Amplification)法、SMAP(SMart Amplification Process)法、RCR(Recombinatorial Chain Reaction)法、TMA(Transcripition mediated amplification)法、PALSAR(Probe alternation link self−assembly reaction)法、NASBA(nucleic acid sequence based amplification)法、及びICAN (Isothermal and chimieric primer initiated amplification of nucleic acids) 法からなる群より選択される1の塩基増幅反応であることを特徴とする請求項11記載の標的塩基判別方法。
  13. 前記工程(II)において、前記核酸伸長効率を、前記塩基増幅反応により産生された増幅産物量に基づき調べることを特徴とする請求項7又は8記載の標的塩基判別方法。
  14. 前記工程(II)において、前記核酸伸長効率を、前記塩基増幅反応により産生された増幅産物の分子量に基づき調べることを特徴とする請求項7又は8記載の標的塩基判別方法。
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