JPH11514525A

JPH11514525A - 二本鎖高次構造多型分析

Info

Publication number: JPH11514525A
Application number: JP9517513A
Authority: JP
Inventors: マイケルウッド; アッタルーイルヴァン; ディヴィッドアルバグリ
Original assignee: ナックスコー
Priority date: 1995-11-03
Filing date: 1996-11-01
Publication date: 1999-12-14
Also published as: CA2236675A1; EP0863998A1; AU7483796A; EP0863998A4; WO1997016567A1; US20010012616A1; AU724506B2; US6187532B1

Abstract

(57)【要約】二本鎖高次構造多型分析は、架橋物質及び任意により標識を含むプローブと、該プローブ配列に相補的であるか又は１個又は数個のミスマッチを有する標的配列を有する試料とを混合することにより行われる。中位の緊縮又はそれより弱い緊縮条件下で十分な時間ハイブリッド形成した後、形成した対合に照射して架橋物質による架橋形成を誘導する。次に、該試料を、移動速度が該プローブと該標的間の相補性の程度に依存する変性ゲル電気泳動で分析する。確証のために第２実験において、該プローブと該試料とを強い緊縮条件下で混合してもよく、これにより架橋プローブ／標的の形成が完全にマッチした対合よりミスマッチのある対合がかなり少ないことがわかる。架橋後、該試料はゲル電気泳動で分離され、架橋した核酸の量が求められる。

Description

【発明の詳細な説明】二本鎖高次構造多型分析序言技術分野本発明の分野は、ＤＮＡの突然変異の検出である。背景ヒト及び他の種に関する遺伝子情報の量は、特にヒトゲノムプロジェクトの出現によって膨大なものになってきた。存在する遺伝子の全てを同定することにより我々は特定の表現型と関連がある突然変異を同定することができる。既にかなりの遺伝子ライブラリーがあり、突然変異した場合に様々な病気と関連があることが知られている。嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、β−サラセミア、鎌状赤血球貧血等を単に考慮することが求められている。鎌状赤血球貧血のような場合には、その疾患と関連がある共通の点変異がある。嚢胞性線維症のような場合には、その疾患と関連がある遺伝子全体に多数の点変異が広がっている。患者又は他の種が問題の点変異又は特定の多型をもつかを知りたいという多くの場面がある。我々は病気に興味をいだいているばかりでなく、特に他の種において宿主が特定の対立遺伝子をもつかを知ることに関心がある。既知の配列と標的の配列の差異を同定するために多くの手法が開発された。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）試験は、短いプローブと標的ＤＮＡ間の単一ヌクレオチドミスマッチ又は小さな差異を同定するために用いられる。標的ＤＮＡはゲルを電気泳動し、続いてナイロン又はニトロセルロース膜に移される。標識したプローブをその膜と共に相補性の有無を区別するハイブリッド形成条件下でインキュベートする。該試験は、ミスマッチと相補性を区別するために必要なハイブリッド形成と洗浄の条件の厳守に依存する。配列の差異を直接検出するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が用いられた。増幅不応突然変異系（ＡＲＭＳ）として既知の手法は、３′端のミスマッチを除いて一定の配列に相補的であるオリゴヌクレオチドがＰＣＲのプライマーとして機能しないという所見に基づいている。従って、プライマーセットとＰＣＲ条件の適切な選択によりミスマッチが検出される。また、正常な増幅産物又は突然変異した増幅産物の生成をもたらすプライマーが選ばれ、一方又はもう一方の配列に制限部位を生じる。一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）は、非変性ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）によって移動速度が異なるために単一塩基の差異の検出が期待されている。標的ＤＮＡを変性した後、一本鎖ＤＮＡの二次構造の変化が非変性ゲルを用いて検出される。相補的及びミスマッチのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、相互に異なる条件下で変性する。このことは、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）によって利用されている。ＤＧＧＥゲルは、漸増するレベルの変性剤を含み、相補的及びミスマッチのｄｓＤＮＡ分子をゲル中の異なる点で移動及び変性させる。電気泳動のほかに化学的手法があり、ミスマッチ部位でＤＮＡを切断する化学変性剤、例えば、四酸化オスミウム、ヒドロキシルアミン等が用いられ、リボヌクレアーゼＡはミスマッチ点でＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断し、次に、ＰＡＧＥによる分析が続けられる。他の手法としては、ヘテロ二本鎖分析及びヌクレオチド配列分析が含まれる。これらの手法は全て用いなければならない条件や調節の厳密さの制限、プロトコールの複雑さ、方法の一般性についての制限等がある。関連文献ミスマッチを検出する様々な手法を記載している論文としては、次のものが含まれる。Dowton & Slaugh，Clin．Chem．41:785-794(1995); Newtonら，Nucl．A cids Res．17:2503-2516(1989); Haliassosら，Nucl．Acids Res．17:3606(1989 ); Oritaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:2766-2770(1989); Sarkarら，Nuc l．Acids．Res．20:871-878(1992); Fischer & Lerman，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 80:1579-1583(1983); Cottonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:4397-4 401(1988); Myersら，Science 230:1242-1246(1985); Whiteら，Genomics 12:30 1-306(1992). 発明の要約標的配列と既知の配列間の単一又は多重ミスマッチの検出方法及び組成物が提供される。本方法は、プローブと約３００塩基未満の標的配列を中位の緊縮条件より強くない条件下でハイブリッド形成する工程を含む。該プローブは、既知の配列、任意により検出可能な標識、及び架橋物質を含んでいる。二本鎖核酸の検出可能な量を生じるのに十分な時間ハイブリッド形成した後、媒質の条件を変えて形成した対合の架橋を誘導する。次に、変性条件下でＰＡＧＥを用いて試料を分離し、標的核酸に対する架橋した標識プローブの移動速度を既知の基準に対して求める。ミスマッチのあるプローブ／標的対合は、相補的プローブ／標的対合と異なる速度で移動する。確認のために、ミスマッチ対合の配列とマッチ対合の配列間のハイブリッド形成量がかなり異なるより緊縮なハイブリッド形成条件が選ばれる。得られた試料を上記と同様の方法で加熱し、架橋されるプローブ量がプローブと標的間のミスマッチの程度に関係があり、ミスマッチの場合の架橋プローブの量はかなり少量である。本発明によれば、標的配列における突然変異の存在を求めるために用いられる条件についてかなりの適応性の向上が得られる。個々の実施態様の説明本発明によれば、標的配列においてプローブに対するミスマッチの有無を検出する方法に用いられるプローブが提供される。突然変異、対立遺伝子変異、種変異、別のスプライシング等の結果としてミスマッチが生じる。ミスマッチは、挿入、欠失又はミスマッチ対合があり、通常は１個以上の点ミスマッチである。一般的には、本方法は、既知の配列、任意により検出可能標識及び架橋物質を有することを特徴とするプローブと、標的からのＤＮＡの主成分又は複合混合物の一部として存在することができる標的配列とを混合する工程を用いる。標的配列は、一本鎖として供給される。プローブと標的の配列は、中位の緊縮条件より強くない条件下でハイブリッド形成する。二本鎖核酸の十分な量を十分な時間生成した後、架橋を生じるように条件を変える。架橋が生じた後、試料をゲル電気泳動で分離し、このときミスマッチ二本鎖核酸の移動速度が相補的二本鎖核酸の移動速度と異なる。ミスマッチの有無を求めるためにプローブ−標的二本鎖複合体の移動速度の測定値が基準と比較される。標的ＤＮＡは、任意の供給源に由来し、平均サイズとして約２５〜３００nt、通常は５０〜２５０nt、好ましくは約５０〜２００ntの範囲で供給される。ＤＮＡ源は、原核ＤＮＡであっても真核ＤＮＡであってもよく、通常は真核ＤＮＡである。ＤＮＡ源は、宿主のゲノム、プラスミドＤＮＡ，ウイルスＤＮＡ（ウイルスは天然に存在するものであっても異なるＤＮＡ源からＤＮＡのベクターとして働くものであってもよい）、ＰＣＲ増幅産物等である。標的ＤＮＡは、哺乳動物宿主の特定の対立遺伝子、ＭＨＣ対立遺伝子、酵素イソ型をコードする配列、単細胞生物の特定の遺伝子又は株等である。標的配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ等である。所望の長さを有する核酸は、制限、ＰＣＲとプライマーの使用等によって特にＤＮＡで得られる。好ましくは少なくとも約８０モル％、通常は少なくとも約９０モル％の標的配列が同じサイズを有する。制限については高頻度に切断する酵素、通常は四塩基共通配列を有する酵素が用いられ、制限酵素の組合わせも用いられ、ＤＮＡが完全消化に供される。ミスマッチは、正常には標的断片に内在し、試料ＤＮＡを消化するために用いられる制限酵素によって切断される部位にはない。問題の典型的な配列としては、鎌状赤血球貧血の突然変異、ＩＤＤＭと関連があるＭＨＣ、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、β−サラセミア、アルツハイマー病、及びがん遺伝子（例えば、ｒａｓ、ｓｒｃ、ｍｙｃ等）の活性化及び／又は腫瘍抑制剤（例えば、ｐ５３、ＲＢ等）の不活性化に起因する種々のがんと関連がある突然変異が含まれる。鎌状赤血球貧血のような場合には、単一突然変異がある。嚢胞性線維症のような場合には、求めるべき多重変異がある。適切な制限酵素の選択により１個以上の突然変異が隠れている疑いがある領域が所定のサイズの断片に存在することが示され、プローブの組合わせを用いることにより遺伝子内の１個以上の突然変異の存在が容易に検出される。ＤＮＡ源によっては、ＤＮＡはタンパク質の分離、制限酵素インヒビターの除去等の精製に供される。プローブは、一般的には約１５〜５０nt、通常は約２０〜３５ntを有する。プローブは、１〜５個の架橋物質、通常は約１〜３個の架橋物質を有する。架橋物質は、ハイブリッド形成を妨害しないように選ばれ、通常は架橋を生じるチミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）又はウリジン（Ｕ）に対向して配置される。多数の官能性が光化学的に活性であり、ほとんどの有機部分と共有結合を形成することができる。これらの基としては、カルベン、ニトレン、ケテン、フリーラジカル等が含まれる。バルク溶液、通常は過剰量の非標的核酸中に捕捉分子が供給され、標的配列に結合しないプローブは捕捉分子と反応してプローブと標的の配列間の非特異的架橋を避ける。カルベンは、ジアゾニウム塩、スルホニルヒドラゾン塩又はジアジランのようなジアゾ化合物から得られる。ケテンは、ジアゾケトン又はキノンジアジドから得られる。ニトレンは、アリールアジド、アシルアジド及びアジド化合物から得られる。非共有電子対の光分解生成に関する情報についてはA．Schonberg，Preparative Organic Photochemistry，Spring-Verlag，NY 19 68を参照されたい。架橋に用いられる化合物は、たいてい、塩基、特にピリミジンと共有結合を形成する光活性化可能な化合物である。これらの化合物は、置換クマリン、フロクマリン、イソクマリン、ビスクマリン、プソラレン等のクマリン、キノン、ピロン、α，β−不飽和酸、酸誘導体、例えば、エステル、ケトン及びニトリル；アジド等の官能部分が含まれる。他種の光活性反応成分は、d-又はf-ブロック遷移金属のいずれかに基づく有機金属化合物である。光誘起により金属からのリガンドの消失が誘導されて置換に用いうる空の部位を生じる。適切なリガンドとしてはヌクレオチドが含まれる。有機金属化合物の光置換に関する情報については、“Organometallic Photochem istry”，G.F．Geoffrey & M.S．Wrighton，Academic Press，カリフォルニア州サンフランシスコ，1979を参照されたい。標的配列に結合するプローブ相同配列は、通常は天然に存在するヌクレオチドを含む。しかしながら、ある場合には、リン酸−糖鎖は、ン酸塩の酸素をイオウ、炭素、窒素等で置換することによる天然でない糖を用いること、リ、又は合成に有利な修飾、分析条件下での安定性、酵素分解に対する耐性等を与えることができる修飾により修飾される。プローブは、便利な方法、最も便利には合成法によって調製され、架橋修飾ヌクレオチドが合成中段階的に適切な位置に導入される。文献においては様々な分子のヌクレオチドへの結合が周知であり、ここに記載することを必要としない。例えば、“Oligonucleotides and Analogues．A Practical Approach”，Eckste in，F．ed.，Oxford University Press，1991を参照されたい。同様に、標識が存在する場合にはプローブ鎖の都合のよいヌクレオチドに結合され、プローブと標的の配列間のハイブリッド形成を妨害しない。標識は、一般的には小さく、通常は約１００〜１,０００Ｄａである。標識は検出可能な物質であり、標識が直接、又はレセプターに結合し容易に検出可能な分子で標識されることにより検出され得る。電気泳動で検出される分子としては、放射能標識、例えば、³²Ｐ、³⁵Ｓ等、ローダミン、フルオレセイン等の蛍光物質、ストレプトアビジンに対するビオチン、抗ジゴキシゲニンに対するジゴキシゲニン等のレセプターに対するリガンド、化学発光物質等が含まれる。また、標識が用いられることを必要とせず、ＤＮＡが分離前、分離中或いは分離後に臭化エチジウム、エチジウム二量体、チアゾールオレンジ、チアゾールブルー、その二量体等の染色剤を用いて染色される。ＰＣＲを用いる場合にはプローブよりは標識すべきプライマーが供給され、プライマーが検出のために提供される。リガンドが用いられる場合、レセプターは直接検出可能な標識のいずれかで標識される。本方法は、プローブと標的ＤＮＡとを混合することにより行われる。標的ＤＮＡは、一般的には約１０^-20〜１０^-8モル、通常は約１０^-17〜１０^-10モルの範囲で存在するように算出される。プローブは、標的核酸の算出量に基づいて等価量又は過剰量、一般的には１０⁹倍を超えない過剰量、通常は１０⁷倍を超えない過剰量で存在させることができる。ハイブリッド形成媒質は、中位の緊縮から弱い緊縮までを与え、標的核酸の実質的に全てを架橋することを行わせる。緊縮性は、約２５〜７０℃、しばしば４０〜７０℃、通常は３０〜５０℃の範囲の温度と０.０５〜１.５Mナトリウム、通常は０.２５〜１Mナトリウムイオン又は０〜２０％ホルムアミドに等価である。ＲＮＡの場合は、グアニジニウムチオシアナートが０.１〜６Mの量で添加される。ホルムアミド以外の他の変性剤としては、尿素及びジメチルスルホキシドが含まれる。ハイブリッド形成条件は、プローブとマッチ及びミスマッチ双方の核酸配列の標的配列間のハイブリッド形成の最大量を与えるように選ばれる。ハイブリッド形成時間は、二本鎖核酸の検出可能な量を生じるのに十分な時間であり、ハイブリッド形成条件、及び標識が検出される感受性に依存する。一般的には少なくとも５分から６時間を超えない時間、通常は約１０分〜１時間である。ハイブリッド形成が起こった後、プローブ含有二本鎖核酸が架橋される。光は、核酸の天然に起こる架橋を避けるために３００nm以上である。一般的には、光は光源をパイレックスフィルターと共に用いて３００〜４００nmの範囲である。化学活性化が用いられるが、通常は光分解活性化が便利であり、選択方法となる。照射時間は、一般的には約１分〜２時間、通常は約５分〜１時間の範囲であり、試料のサイズ、照射源の電力、所望の産物量等に依存する。場合によっては、試料の分割量を採取し電気泳動して十分量の架橋が生じたかを求める。照射後、試料を加熱等によって処理し、充填するために先端実験色素、グリセロール、スクロース、ホルムアミド等と混合する。これらの手法は、当該技術において周知であり、ここでの詳細を必要としない。電気泳動は、ポリアクリルアミドゲル、通常は５〜２３％アクリルアミド及び１０〜３０：１のアクリルアミド：二モノマー比を用いて行われる。架橋核酸の領域から非架橋核酸を除去する変性条件が用いられる。尿素の代わりに他の変性物質を用いてもよい。トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡのような典型的な泳動バッファーが用いられる。電気泳動は、ミスマッチ配列とマッチ配列間の分離を可能にする通常の条件下で行われる。レーンの１つに適切なマッチ又はミスマッチ基準を置けば、試料レーンのバンドと基準バンドとを比較することができる。基準と試料間の差は、標的配列が基準配列と異なるかを意味する。適切な標識を用いること又はゲルを染色することにより、標識とプローブの配列間のミスマッチの有無が検出される。確証したい場合には、ＡＳＯ法の変法が用いられ、二重らせん生成度を求める。しかしながら、架橋を生じると使用条件の臨界がかなり減少する。この方法では、温度は一般的には約５０〜７０℃の範囲であり、ナトリウムイオン濃度は一般的には約５０〜５００mM、通常は約１００〜４００mMの範囲である。各標的配列とプローブについては、ミスマッチ配列とマッチ配列間の二重らせん生成度の最大差を得る条件が最適化される。好ましくは、架橋マッチ配列と架橋非マッチ配列の架橋量間で少なくとも約２倍、通常は少なくとも約５倍なければならない。この方法では、より強い緊縮条件が用いられる。その他の点では、条件は泳動の差に用いられる条件と実質的に同じとする。架橋ＤＮＡの量は、マッチした基準及びプローブと標的の配列と関連があるバンドから得られたシグナルを測定することにより容易に求められる。シグナルがかなり少ない場合には配列がミスマッチであることを意味する。シグナルが基準とほぼ同じである場合には配列がマッチしていること意味する。使用者の便利のよいように、１以上、通常は２以上のプローブ、特に１対のプローブで一方のプローブが“野生型”配列と呼ばれる配列に相補的でありもう一方が“突然変異”配列と呼ばれるプローブを含むキットが供給される。しかしながら、多くの場面では標的配列がプローブ配列と同じか又は異なるかを知りたいだけなので、一方の配列が一般的又は野生型でありもう一方の配列が稀であるか又は突然変異体であるという概念がなくこれらの設計が任意であることは理解されるべきである。例えば、１個又は２個のミスマッチによって異なる２つのＭＨＣ対立遺伝子のどちらが存在するかを知りたいかもしれない。１対のプローブは、一般的には５個を超える差異がなく、通常は３個を超える差異がない。標的配列によっては複数のプローブ、特に１対のプローブがあり、通常は約１２対を超えず、標的配列は遺伝子中に広がる複数の潜在的突然変異がある。色素、リガンドが標識として用いられる標識抗体、ＰＣＲで有用な標識プライマー等の補助物質も供給される。下記の実施例は、具体的な説明として示され限定するものではない。実施例実施例１：（Ａ）対立遺伝子特異的ハイブリッド形成と架橋及び（Ｂ）ＤＳＣＰ分析による単一塩基ミスマッチの検出ヒト乳頭腫ウイルス１６型のＥ６遺伝子のヌクレオチド３７４〜４０３を含むオリゴヌタレオチド（オリゴ#1）をＤＮＡ合成のホスホルアミダイト法によって合成し、５′端に³²Ｐで標識した。３８８位のＧ→Ａ単一塩基変化以外はオリゴ #1と同じ配列を有する第２³²Ｐ標識オリゴヌクレオチド（オリゴ#2）を調製した。光活性架橋基、３−Ｏ−（７−クマリニル）グリセロール（配列中ではＸで示される）を含む２０量体ＤＮＡプローブ（オリゴ#3）を調製した。このプローブのＤＮＡ配列は、オリゴ#1に完全に相補的であるが、オリゴ#2とハイブリッド形成してＡ／Ｃミスマッチを含む二重らせんを生じる。オリゴ#1/#3 二重らせん: オリゴ#2/#3 二重らせん: オリゴ#3（２０ピコモル）を、０.１５mlの試料中で２ピコモルの³²Ｐ−５′ 末端標識オリゴ#1或いはオリゴ#2の存在下に下記に纏めた温度とＮａＣｌ濃度でインキュベートした。２０分インキュベートした後、溶液をUV-A波長光の下で４５分間照射した。照射工程の完了時に、試料の１／１０（０.０１５ml）を取り出し、等量のホルムアミド−ブロモフェノールブルー色素ミックスと混合し、７０℃で３分間加熱した。試料を氷で冷却し、７M尿素を含む１５％ポリアクリルアミドゲル（１９：１のアクリルアミド／ビスアクリルアミド）に充填し、ブロモフェノールブルー色素がゲルの底に達するまで３００Vで電気泳動した。ゲルを取り出し、Ｘ線フィルムに−８０℃で一晩曝露した。方法１：対立遺伝子特異的ハイブリッド形成及び架橋ハイブリッド形成温度（４５〜５５℃）及びＮａＣｌ濃度（１５０〜３００mM ）の範囲で実験を行うことにより、相補的オリゴヌクレオチド#1と#3間に顕著な架橋形成を生じるがミスマッチオリゴヌクレオチド#2と#3間に生じない条件を定義することが可能である。ミスマッチ区別に最良の条件を求めるために、放射性バンドをゲルから切り出し、シンチレーション計数で定量し、架橋産物の収率を測定した（未反応³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドに対する）。結果を下記に示す。上記表のデータから、相補的二重らせんとミスマッチ二重らせんを区別する最適条件が試料９と１０（５５℃、１５０mMＮａＣｌ）に用いられたものであることがわかる。これらの条件下で相補的オリゴヌクレオチド対合は、ミスマッチ対合より１３倍の架橋産物を生じる（３９％に対して３％）。方法２：ＤＳＣＰ分析（二本鎖高次構造多型分析）最低緊縮条件（４５℃、３００mMＮａＣｌ）下で行った試料（３及び４）のオートラジオグラムの分析から、ミスマッチオリゴヌクレオチド#2と#3間の架橋から得られた産物が相補的オリゴヌクレオチド#1と#3間の架橋から得られた産物よりゲルをゆっくり移動したことが明らかに示された（ＤＳＣＰ効果）。本実験から得られた結果から、単一塩基ミスマッチを検出するためにハイブリッド形成条件を開発する多くの従来の方法よりＤＳＣＰ法の２つの利点が強調された。１．ＤＳＣＰ法は簡便であり、ミスマッチ配列からマッチ配列を区別するためにハイブリッド形成条件の注意深い最適化を必要としない。ＤＳＣＰ法は、非緊縮ハイブリッド形成条件を用いる。２．非緊縮条件を用いることにより架橋が生じ、よって分析中のシグナルがハイブリッド形成緊縮法が用いられる場合より強い。ＤＳＣＰ分析（４５℃、３００ mMＮａＣｌ）に用いられる条件下での架橋は相補的オリゴヌクレオチド#1と#3間の反応の架橋収率が４９％であったが、ハイブリッド形成緊縮法（５５℃、１５０mMＮａＣｌ）でミスマッチの最良の区別を生じる条件下の架橋効率は３９％であった。従って、ＤＳＣＰ法により２６％以上のシグナルが得られた。実施例２：正常（β^A）及び鎌状赤血球（β^S）β−グロブリン対立遺伝子のＤＳＣＰ分析による検出正常なヒトβ−グロビン遺伝子（β^A標的）或いは鎌状赤血球β−グロビン遺伝子（β^S標的）の配列の一部を含む２つの５６塩基オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成のホスホルアミダイト法によって合成し、５′端に³²Ｐで標識した。β^S −グロビン標的配列は、グルタミン酸の代わりにバリンを含む変異β−グロビン対立遺伝子を生じるＡ→Ｔ単一突然変異によってβ^A標的と異なる。 β^A標的配列（β^Aプローブ）或いはβ^S標的（β^Sプローブ）に相補的な２つのプローブを合成した。これらのプローブを光活性架橋基、３−Ｏ−（７−クマリニル）グリセロール（配列ではＸで示される）で修飾した。標的分子が個別に或いは１：１混合物（異型接合個体に見られる）で存在する場合のβ−グロビン標的の存在を検出及び区別するために２つのβ−グロビンプローブによるＤＳＣＰ分析を用いることができることを示すためにハイブリッド形成と架橋の実験を行った。下記に纏めた実験を行った。各０.０５ml試料は、１０ピコモルの適切なプローブと０.２ピコモルの³²Ｐ− 標識標的を含有した（試料７と８は０.２ピコモルの各標的分子を含有した）。溶液のＮａＣｌ濃度は０.７５Mであった。ハイブリッド形成を３５℃で２０分間行い、試料にUV-A光源を６０分間照射した。試料の１／５（０.０１０ml）を取り出し、等量のホルムアミド−ブロモフェノールブルー色素ミックスと混合し、７０℃で３分間加熱した。試料を氷で冷却し、７M尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル（１９：１のアクリルアミド／ビスアクリルアミド）に充填し、ブロモフェノールブルー色素がゲルの底に達するまで３００Vで電気泳動した。ゲルを取り出し、Ｘ線フィルムに−８０℃ で一晩曝露した。実験で得られたデータから、２つの架橋修飾プローブのいずれか用いることにより２つのβ−グロビン対立遺伝子を検出及び区別するためにＤＳＣＰ分析を用いることが可能であることがわかった。完全に相補的なβ^Aプローブとβ^A標的（試料３）及びβ^Sプローブとβ^S標的（試料５）間の反応から得られた主要な架橋産物は、ミスマッチプローブと標的（試料４と６）間の架橋後に得られた産物より著しく速くゲルを移動した。更に、β^Aとβ^Sの標的（試料７と８）双方の存在下に行った反応の分析から２つのプローブが両対立遺伝子を同時に検出及び区別することができることがわかった。この知見は、鎌状赤血球貧血の保因者である個体がＤＮＡ中にβ^A対立遺伝子とβ^S対立遺伝子の双方を保有するので臨床上適切である。上記の結果から、単一塩基ミスマッチを容易に検出することができる簡便かつ正確な手法が提供されることは明らかである。方法が便利であり、分析が迅速に行われ、条件の調節の変化が少ないために誤差を受けない。本明細書に述べた文献と特許出願全ての記載は、各々の文献又は特許出願が具体的に及び個別的に本願明細書に含まれるのと同じ程度まで本願明細書に含まれるものとする。本発明は十分に記載されているが、下記の請求の範囲の真意又は範囲から逸脱することなく多くの変更や修正が行われることは当業者に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アルバグリディヴィッドアメリカ合衆国カリフォルニア州 94301 パロアルトユニヴァーシティーアベニュー 829

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸プローブと核酸標的間の少なくとも１個のミスマッチの有無を検出する方法であって、前記プローブと標的が５個を超えないミスマッチによって異なる配列を有し、前記プローブが既知の配列及び光活性化可能な架橋物質を含み、前記プローブ配列が前記標的配列に対してハイブリッド形成する場合、光活性化により前記プローブ配列と前記標的配列間に共有結合が形成し、ハイブリッド形成媒質中で前記標的を含む核酸試料と前記プローブを中位の緊縮ハイブリッド形成条件下で前記標的と前記プローブがハイブリッド形成するのに十分な時間混合する工程；前記ハイブリッド形成媒質に照射して前記プローブと標的の配列間に架橋を形成させ、前記プローブがそれに対してハイブリッド形成して架橋二本鎖核酸を形成する工程；及び前記ハイブリッド形成媒質中の核酸を変性電気泳動で分離し、前記架橋二本鎖核酸の移動速度を既知のミスマッチ又はマッチ架橋二本鎖核酸基準と比較し、よって前記少なくとも１個のミスマッチの有無を求める工程を含む、前記方法。２．前記プローブが検出可能な標識で標識される、請求項１記載の前記方法。３．前記試料がポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製され、前記試料核酸が検出可能な標識で標識される、請求項１記載の方法。４．前記電気泳動がポリアクリルアミドゲル電気泳動である、請求項１記載の方法。５．核酸プローブと核酸標的間の少なくとも１個のミスマッチの有無を検出する方法であって、前記プローブと標的が５個を超えないミスマッチによって異なる配列を有し、前記標的配列が約２５〜３００ntの核酸分子を含みかつ前記プローブが１５〜５０ntの既知の配列及び光活性化可能な架橋物質を含み、前記プローブ配列が前記標的配列に対してハイブリッド形成する場合、光活性化により前記プローブ配列と前記標的配列間に共有結合が形成し、ハイブリッド形成媒質中で前記標的を含む試料と前記プローブを中位の緊縮ハイブリッド形成条件下で前記標的と前記プローブがハイブリッド形成するのに十分な時間混合する工程；前記ハイブリッド形成媒質に約３００〜４００nmの範囲の波長で照射して前記プローブと標的の配列間に架橋を形成させ、前記プローブがそれに対してハイブリッド形成して架橋二本鎖核酸を形成する工程；及び前記ハイブリッド形成媒質中の核酸を変性電気泳動で分離し、前記架橋二本鎖核酸の移動速度を既知のミスマッチ又はマッチ架橋二本鎖核酸基準と比較し、よって前記少なくとも１個のミスマッチの有無が求められる工程を含む、前記方法。６．前記試料がゲノムＤＮＡの制限酵素消化によって調製される、請求項５記載の方法。７．前記試料がポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製され、前記試料核酸が検出可能な標識で標識される、請求項５記載の方法。８．前記プローブが検出可能な標識で標識される、請求項５記載の方法。９．前記電気泳動がポリアクリルアミドゲル電気泳動である、請求項５記載の方法。 10．核酸プローブと核酸標的間の少なくとも１個のミスマッチの有無を検出する方法であって、前記プローブと標的が５個を超えないミスマッチによって異なる配列を有し、前記標的配列が約２５〜３００ntの核酸分子を含みかつ前記プローブが１５〜５０ntの既知の配列及び光活性化可能な架橋物質を含み、前記プローブ配列が前記標的配列に対してハイブリッド形成する場合、光活性化により前記プローブ配列と前記標的配列間に共有結合が形成し、ハイブリッド形成媒質中で前記標的を含む核酸試料と前記プローブを２５〜７０℃の範囲の温度及び０.１〜１.５Mトリウムに等価な中位の緊縮ハイブリッド形成条件下で前記標的と前記プローブがハイブリッド形成するのに十分な時間混合する工程；前記ハイブリッド形成媒質に約３００〜４００nmの範囲の波長で照射して前記プローブと標的の配列間に架橋を形成させ、前記プローブがそれに対してハイブリッド形成して架橋二本鎖核酸を形成する工程；及び前記ハイブリッド形成媒質中の核酸を変性電気泳動で分離し、前記架橋二本鎖核酸の移動速度を既知のミスマッチ又はマッチ架橋二本鎖核酸基準と比較し、よって前記少なくとも１個のミスマッチの有無が求められる工程を含む、前記方法。 11．前記架橋物質がクマリニル基を含む、請求項10記載の前記方法。 12．核酸プローブと核酸標的間の少なくとも１個のミスマッチの有無を検出する方法であって、前記プローブと標的が５個を超えないミスマッチによって異なる配列を有し、前記標的配列が約２５〜３００ntの核酸分子を含みかつ前記プローブが１５〜５０ntの既知の配列及び光活性化可能な架橋物質を含み、前記プローブ配列が前記標的配列に対してハイブリッド形成する場合、光活性化により前記プローブ配列と前記標的配列間に共有結合が形成し、ハイブリッド形成媒質中で前記標的を含む核酸試料と前記プローブを強い緊縮ハイブリッド形成条件下で前記標的と前記プローブがハイブリッド形成するのに十分な時間混合し、前記標的に相補的なプローブがミスマッチプローブより少なくとも約２倍量のハイブリッド形成を生じる工程；前記ハイブリッド形成媒質に約３００〜４００nmの範囲の波長で照射して前記プローブと標的の配列間に架橋を形成させ、前記プローブがそれに対してハイブリッド形成して架橋二本鎖核酸を形成する工程；及び前記ハイブリッド形成媒質中の核酸を変性電気泳動で分離し、架橋二本鎖核酸の量を求め、架橋二本鎖核酸の量が前記プローブと前記標的間のミスマッチの有無に関係する工程を含む、前記方法。 13．前記強い緊縮条件が約４０〜７０℃の範囲の温度及び０.０５〜０.５Mナトリウムイオンに少なくとも等価である、請求項12記載の前記方法。 14．２つのプローブを含むキットであって、１５〜５０ntからなり、光活性化可能な架橋物質が前記プローブの各々に結合しており、前記プローブの各々が３個を超えないミスマッチによってもう一方のプローブと異なり、天然に存在する配列であることを特徴とする、前記キット。 15．前記光活性化可能な架橋物質がクマリニル基を含む、前記14記載のキット。 16．前記天然に存在する配列が、一方がもう一方の突然変異体であることによって関係がある、請求項14記載のキット。 17．前記天然に存在する配列が、一方がもう一方の対立遺伝子であることによって関係がある、請求項14記載のキット。 18．前記プローブが検出可能な標識で標識される、請求項14記載のキット。 19．前記プローブの各々が複数の架橋物質を有する、請求項14記載のキット。